專利名稱：核酸的分離的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從生物材料，特別是從血液中提取核酸和其他生物分子的方法。
很多情況下需要進(jìn)行大量的DNA分析，這就需要快速、安全、高產(chǎn)量的分離和純化DNA及其它核酸的方法。
用于DNA鑒定或分析的樣品可以來自多種生物材料，比如，動(dòng)植物的細(xì)胞、排泄物和組織等；也可以從土壤、食料和水等物質(zhì)中獲得。
現(xiàn)有提取DNA的方法包括酚/氯仿法、鹽析法、離液鹽和有機(jī)硅樹脂法、親和樹脂法、離子交換層析法以及磁珠法。方法見US專利5057426、4923978，EP專利0512767A1和EP專利0515484B、WO95/13368、WO97/10331和WO96/18731。這些專利和專利申請(qǐng)公開了先將核酸吸附到固體支持物上，然后進(jìn)行核酸分離的方法。以前的方法都是用某些易燃、可燃或有毒的溶劑分離核酸。
血液是一種用于DNA分析最豐富的樣品來源，因?yàn)檠簶悠房捎杀姸嘣蚨Ｒ?guī)獲得。然而，當(dāng)應(yīng)用已有的DNA提取方法時(shí)，由于血液的粘稠和富含蛋白酶的性質(zhì)，處理含有相對(duì)少量DNA的大體積血液非常困難，因此難于自動(dòng)化完成。迄今為止，核酸提取只能依靠應(yīng)用危險(xiǎn)試劑和緩慢的操作步驟來實(shí)行部分的自動(dòng)化。
現(xiàn)在我發(fā)明了一種用于從血液和其它生物材料中提取核酸和其它生物分子的改進(jìn)方法。
本發(fā)明提供了一種從生物材料中提取生物分子的方法，該方法包括首先用能夠結(jié)合生物分子的固相在第一pH值接觸生物材料，然后在第二pH值通過用一種洗脫劑洗脫將已結(jié)合到固相的生物分子提取出來。
本方法特別適用于血液材料，也可以廣泛用于其它材料，例如質(zhì)粒和載體的分離，以及植物DNA的提取。
最好將血液中的細(xì)胞裂解以釋放出核酸分子?？梢允褂靡阎牧呀鈩┖头椒ǎ缗c離子型和非離子型去污劑、低滲鹽溶液、蛋白酶、離液劑、溶劑接觸，改變pH值或加熱。分離核酸所采用的裂解細(xì)胞的方法見WO 96/00228。
當(dāng)生物材料是血液時(shí)，樣品可以任意用水或其它溶劑稀釋，以便于操作和進(jìn)一步加工。
樣品可以稀釋多達(dá)十倍使用，一般情況下更高的稀釋倍數(shù)可能更好。本發(fā)明的特點(diǎn)是可以使用高倍稀釋的血液。
與血液接觸的固相可由對(duì)核酸有天然親和力的材料制成，或者由表面經(jīng)過某種試劑處理的材料制成，這種試劑使核酸能夠結(jié)合在固相上或者增加固相對(duì)核酸的親和力。合適的材料包括可控孔度玻璃、多糖(瓊脂糖或纖維素)、其它類型硅石/玻璃、陶瓷材料、多孔塑料材料，例如多孔塑料塞(它在一個(gè)單獨(dú)的模制部分中，或是一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管中的插入體)、聚苯乙烯珠和順磁珠等。材料的尺寸和孔隙度沒有嚴(yán)格要求，根據(jù)不同的用途可以有不同的選擇。
處理固相表面或者衍生化加工固相的合適方法包括用一種能夠在固相表面導(dǎo)入電荷，例如正電荷，或者給固相加上親水或疏水表面，例如羥基、硝基、自反應(yīng)基團(tuán)、染料和其它芳香族化合物的物質(zhì)處理固相表面。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，固相可以使DNA在一個(gè)pH值時(shí)優(yōu)先于血液樣品中的雜質(zhì)結(jié)合到其上，而在不同的pH值時(shí)由于洗脫劑的接觸，已經(jīng)結(jié)合到固相的核酸將被釋放出來。本系統(tǒng)可以與摻入了組氨酸或多聚組氨酸的固相一起使用，所述固相在較低的pH值時(shí)，例如pH值小于6時(shí)將結(jié)合核酸，而在pH值升高時(shí)，例如大于8時(shí)已結(jié)合的核酸被釋放出來。或者，核酸在基本中性的pH值時(shí)結(jié)合到胺化表面，而在非常高的pH值時(shí)被釋放出來。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可以向塑料器皿中摻入結(jié)合劑，例如在平板的一個(gè)孔中，使結(jié)合劑被加入到其表面，然將血液樣品與表面接觸，使核酸結(jié)合到表面上。血液樣品被取出后，用洗脫劑處理器皿表面，釋放出被結(jié)合的核酸。當(dāng)接觸表面是多孔平板中一個(gè)孔部分時(shí)，整個(gè)系統(tǒng)適用于快速大規(guī)模取樣和提取技術(shù)。
適用的結(jié)合劑包括使用帶正電荷的固相的電荷開關(guān)型離子交換樹脂，該固相可以通過改變pH值到高于其pKa而逆轉(zhuǎn)成帶負(fù)電荷或變成中性，例如，核苷酸、多胺、咪唑基團(tuán)和其它具有合適pKa值的類似試劑。
而且，核酸也可以應(yīng)用摻入到固相的多種嵌入型化合物，例如放線菌素D、溴化乙錠等，通過嵌入反應(yīng)而結(jié)合。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，可修飾塑料表面使其含有官能團(tuán)。該塑料可以是可用于容納樣品的任何一種塑料制品，例如聚丙烯。官能團(tuán)可以帶正電荷或負(fù)電荷，從而在正確的緩沖液中結(jié)合核酸。
或者，官能團(tuán)也可以是能夠和其他配基或聚合物共價(jià)偶聯(lián)的化學(xué)基團(tuán)。
當(dāng)在塑料模具中，例如平板的孔中或PCR管中使用塑料時(shí)，塑料表面的性質(zhì)可以通過在模制化合物(moulding compound)中，例如在注入型模制化合物中包含或加入合適的化學(xué)品而改性以用于本發(fā)明。
當(dāng)在PCR管中或在深孔平板中使用塑料表面時(shí)，這些管或孔可以用來分離和固定少量的DNA或RNA，得到可用于進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)或進(jìn)行其它基因分析和操作的純化模版。
當(dāng)塑料是聚丙烯材料時(shí)，例如薄壁PCR管，聚丙烯表面可以用氧化劑進(jìn)行氧化而改性，例如用高錳酸鉀和硫酸，以造成羧化表面(COOH基團(tuán))。這樣的PCR管可以改善從溶液中或粗提樣品中，例如血液中，進(jìn)行DNA的分離。通過調(diào)整pH值、介電常數(shù)、溶解度或離子強(qiáng)度，可以將DNA或RNA固定在管壁上，并洗除雜質(zhì)，直接用于PCR或其它分析技術(shù)。
羧基基團(tuán)還可以通過與陰離子基團(tuán)，例如咪唑、多聚組氨酸、或其它強(qiáng)或弱的離子交換劑共價(jià)偶聯(lián)而被改性，以便憑借電荷的相互作用來結(jié)合核酸。這種管可以改善從溶液中或粗提樣品中，例如血液中，進(jìn)行DNA的分離。同樣可以通過調(diào)整pH值、介電常數(shù)或離子強(qiáng)度，將DNA或RNA固定在管壁上，并洗除雜質(zhì)，直接用于PCR或其它分析技術(shù)。
核酸可以在低鹽溶液中洗脫，以備用于PCR或其它分析。
通過在混合/攪拌裝置中與固相混合，讓血液樣品經(jīng)過固相，而使血液樣品與固相接觸?；蛘吖滔嗫梢允琼槾判缘牟⒃诖艌?chǎng)中操作。盡管本發(fā)明特別適用于從血液中分離核酸，但是也可以用于多種生物分子，特別是那些需要除掉細(xì)胞壁碎片或不溶性顆粒的生物分子。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，固相在柱中呈顆粒狀，血液憑借加在柱上的壓差而通過柱，血液樣品借助氣壓流過柱，而顆粒狀的固體材料被流化，以加強(qiáng)混合和接觸率，并減少堵塞。
本發(fā)明的方法適于以多孔方式進(jìn)行，其中從不同的樣品里基本上同時(shí)進(jìn)行一系列的提取，這將便于提取過程的自動(dòng)化，以完成快速、大量的提取和進(jìn)行組合化學(xué)反應(yīng)。在一系列標(biāo)準(zhǔn)孔中進(jìn)行大產(chǎn)量提取，例如在8×12個(gè)孔中在同一時(shí)間自動(dòng)處理大量樣品。
本發(fā)明在實(shí)施例中進(jìn)行說明。
實(shí)施例1從全血中提取核酸用glutaldehyde將多聚組氨酸共價(jià)偶聯(lián)到100(m玻璃珠上，即將1克胺化玻珠與0.01％(v/v)glutaldehyde在含有20mg多聚組氨酸，pH值8的0.1M碳酸氫鈉溶液中混合從而制備電荷開關(guān)型離子交換劑。溫育過夜后，徹底洗滌玻珠以去除非共價(jià)結(jié)合的物質(zhì)，貯存于含有0.1％(v/v)Tween 20，pH5的10mM MES中。
將100(m衍生化玻珠約300mg加入1ml封住兩端的塑料柱中。
將血液樣品與同體積的含有1％Tween 20、蛋白酶(200(g/ml)和1mMEDTA的10mM MES(pH5)混合。消化完全后，將血液吸入含有玻珠的柱中，DNA隨即被固定，雜質(zhì)蛋白通過柱子流出而被廢棄。
含有被固定DNA的玻珠用含有10mM MES pH5的緩沖液洗滌，該MES含有1％Tween20和1mM EDTA。重復(fù)洗滌過程，直到洗滌液無(wú)色。
洗滌之后，空氣干燥玻珠，用少量10mM Tris HCl，pH8.5洗脫DNA，然后收集到無(wú)菌管中以備進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)。這樣，即從血液中分離出了DNA。
針對(duì)不同的生物分子，緩沖液等可做適當(dāng)改變。
實(shí)施例21克羧化順磁珠用50mM咪唑緩沖液(pH6)洗滌后，與溶于50ml 50mM咪唑緩沖液(pH6)中的100mg多聚組氨酸混合。加入化學(xué)偶聯(lián)劑(EDC)直終濃度為5mg/ml，混合過夜。順磁珠用含0.5M氯化鈉、1％Tween 20、100mM Tris HCl pH8的水溶液洗滌，貯存于10mM MES，0.1％Tween 20pH5。
為了從血液中提取DNA，將1mg順磁珠與稀釋于10％Tween 20，25mMMES，1mM EDTA pH5中的血液混合。用磁鐵分離出順磁珠，重懸于1mM MES，0.1％Tween 20中洗滌。為了洗脫DNA，將順磁珠重懸于10mM Tris HClpH8.5，用磁鐵將其分離出來，而DNA留存于溶液中。
權(quán)利要求
1.一種從生物材料中提取生物分子的方法，該方法包括將生物材料在第一pH值與能結(jié)合所述生物分子的固相接觸，然后在第二pH值用洗脫液通過洗脫將已結(jié)合到固相上的生物分子提取出來。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生物分子包括核酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述生物材料是血液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述生物分子在pH小于6時(shí)與固相接觸，DNA結(jié)合于固相上，而在pH大于8時(shí)將DNA從固相中釋放出來。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述生物分子在基本中性的pH時(shí)與固相接觸，DNA結(jié)合于固相上，而在pH大于10時(shí)將DNA從固相中釋放出來。
6.根據(jù)權(quán)利要求3到5中任意一項(xiàng)的方法，其中血液中的細(xì)胞通過裂解釋放出核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中細(xì)胞通過與離子或非離子型去污劑、低滲鹽溶液、蛋白酶或離液劑接觸，或者通過改變pH值或加熱而被裂解。
8.根據(jù)權(quán)利要求3到7中任意一項(xiàng)的方法，其中血液用水或其它稀釋劑稀釋以便于操作和傾注。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中血液稀釋度高達(dá)10倍。
10.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中與生物材料接觸的固相由對(duì)核酸有天然親和力的材料制成。
11.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中與生物材料接觸的固相是由表面經(jīng)過能使核酸結(jié)合其上或增強(qiáng)其對(duì)核酸的親和力的試劑處理過的材料制成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中固體材料的表面用能使固相表面帶正電荷或者具有親水性或疏水性的物質(zhì)進(jìn)行處理。
13.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中使用的結(jié)合試劑是采用帶正電荷的固相的電荷開關(guān)型離子交換樹脂，可以通過改變pH值至其pKa值之上或之下而逆轉(zhuǎn)或中和電性。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中結(jié)合試劑可以是核苷酸、多胺，或含有咪唑部分的化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中利用摻入到固相中的嵌入型化合物，通過嵌入而結(jié)合核酸。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中染料是放線菌素D或溴化乙錠。
17.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中固相材料表面用組氨酸或多聚組氨酸處理。
18.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中固相是可控孔度玻璃、多糖、陶瓷材料或多孔塑料材料。
19.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中固相包含聚苯乙烯珠或順磁材料珠。
20.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中固相包含經(jīng)過改性而具有官能團(tuán)的塑料表面。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中塑料是聚丙烯。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中聚丙烯表面通過氧化劑氧化而被改性，形成羧化表面。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中羧基通過共價(jià)偶聯(lián)陰離子型基團(tuán)，例如咪唑、多聚組氨酸、或者任何強(qiáng)或弱的離子交換劑而被進(jìn)一步改性，使核酸借助電荷相互作用而結(jié)合。
24.根據(jù)權(quán)利要求11到23中任意一項(xiàng)的方法，其中所述官能團(tuán)帶正電荷或負(fù)電荷以結(jié)合核酸。
25.根據(jù)權(quán)利要求11到23中任意一項(xiàng)的方法，其中所述官能團(tuán)是能夠與其它配基或聚合物共價(jià)偶聯(lián)的化學(xué)基團(tuán)。
26.根據(jù)權(quán)利要求20到25中任意一項(xiàng)的方法，其中固體材料是多孔塑料塞，它是一個(gè)單獨(dú)的模制部分，或是容器中的插入體。
27.根據(jù)權(quán)利要求20到25中任意一項(xiàng)的方法，其中塑料處于塑料模具中。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中固體材料是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)管。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中固體材料是深孔平板。
30.根據(jù)權(quán)利要求26到29中任意一項(xiàng)的方法，其中管或孔用于分離和固定少量DNA或RNA，得到可用于下一步PCR反應(yīng)或進(jìn)行其它基因分析和操作的純模版。
31.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中固相包括顆粒狀固體材料，通過使血液樣品在混合/攪拌裝置中與固相材料混合，使血液樣品通過固相，而使血液樣品與固相接觸，或在可磁化支持物上操作固相。
32.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中容器是多孔平板中的孔，可基本上同時(shí)對(duì)不同的樣品進(jìn)行一系列的DNA提取。
33.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中固相在柱中為顆粒狀，血液憑借加在柱上的壓差而通過柱。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其中血液樣品借助氣壓流過柱，而顆粒狀的固體材料被流化。
35.根據(jù)前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述生物分子通過用低鹽緩沖液或水洗脫而取出。
全文摘要
一種從血液中提取核酸的方法，該方法包括將血細(xì)胞，最好于細(xì)胞裂解之后，在一個(gè)pH值時(shí)與活化固相接觸以固定核酸，然后在電荷逆轉(zhuǎn)或變?yōu)殡娭行詴r(shí)在較高pH值下取出核酸。固相可以是用作為結(jié)合劑的組氨酸活化的玻珠。血液樣品借助氣壓被抽吸到含有玻珠的柱子上，隨即玻珠被流化，從而改善接觸，并避免堵塞。
文檔編號(hào)C07H1/08GK1781931SQ20051011641
公開日2006年6月7日 申請(qǐng)日期1998年12月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月6日
發(fā)明者M·J·貝克 申請(qǐng)人:Dna研究創(chuàng)新有限公司