專利名稱：2,4－二氯酚人工抗原、制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于小分子有機(jī)污染物的免疫化學(xué)及殘留分析生物技術(shù)領(lǐng)域。涉及有機(jī)合成、免疫化學(xué)、生物化學(xué)及理化測試技術(shù)等。具體地說是一種2，4-二氯酚人工抗原、制備方法及其用途。特別涉及環(huán)境激素類物質(zhì)2，4-二氯酚半抗原、人工全抗原的設(shè)計(jì)合成和免疫動物特異性抗體的制備方法，及建立可應(yīng)用于檢測水體中殘留2，4-二氯酚的熒光免疫分析技術(shù)。
背景技術(shù)：
環(huán)境激素是環(huán)境中的激素類似物，它能通過與激素受體結(jié)合，干擾正常的生理代謝、內(nèi)分泌和生殖機(jī)能，引起種種負(fù)面的生物學(xué)效應(yīng)。近70年來，隨著工業(yè)的發(fā)展，大量的環(huán)境激素在制藥、塑料制品添加劑生產(chǎn)、除草劑的使用和垃圾處理等過程中不斷的釋放，對生態(tài)環(huán)境造成了巨大的危害。環(huán)境激素問題已成為繼臭氧層、地球氣候變暖之后全球的第三大環(huán)境問題，成為環(huán)境科學(xué)研究領(lǐng)域中的熱門課題。其主要研究范圍是環(huán)境激素的篩選與調(diào)查、作用機(jī)制、監(jiān)測方法、對人和動物的危害等。目前專家們已經(jīng)篩選出70余種化學(xué)品為環(huán)境激素類物質(zhì)，多用來制造人們?nèi)粘Ｓ玫耐苛稀⑾匆聞?、樹脂、可塑劑等。其中酚類化合物中列入環(huán)境激素類物質(zhì)的有烷基酚、氯酚及雙酚A等[姜保璽，李文蘭.環(huán)境荷爾蒙的研究現(xiàn)狀及其趨勢.世界環(huán)境，2002，37-10]。
由于環(huán)境激素在環(huán)境污染中具有“低劑量，長時間”的特性，因此，對環(huán)境激素類物質(zhì)2，4-二氯酚直接監(jiān)測往往比較困難[齊文啟，孫宗光.痕量有機(jī)污染物的監(jiān)測.北京化學(xué)工業(yè)出版社，2002]。目前對分子量小于1000道爾頓的小分子類有毒污染物如環(huán)境激素類物質(zhì)，傳統(tǒng)的分析方法主要是色譜法，包括氣相色譜、高效液相色譜法、色質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS、HPLC-MS)等。但這類分析方法體系中將待測物從樣品中分離提取并去除共存雜質(zhì)干擾的前處理過程十分復(fù)雜，需經(jīng)提取、凈化、濃縮和衍生等復(fù)雜的樣品前處理，對實(shí)驗(yàn)室和儀器化程度要求高。并且操作費(fèi)時，分析成本昂貴，不利于推廣使用，難以適應(yīng)大量樣本和現(xiàn)場檢測的要求。因而尋求一種快速、簡便、靈敏并且經(jīng)濟(jì)實(shí)用的分析方法成為當(dāng)前研究的方向。
免疫分析法是一種形式特殊的試劑分析法，它的起點(diǎn)是抗體成為分析試劑，利用抗體與抗原的特異性結(jié)合作用來選擇性識別和測定可以作為抗體或抗原的待測物。免疫分析法不受周圍環(huán)境和樣本內(nèi)干擾物質(zhì)的影響，具有靈敏度高，選擇性好、穩(wěn)定性強(qiáng)及簡單方便經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，在國內(nèi)外的實(shí)際應(yīng)用取得的成就不可低估，可進(jìn)行百余項(xiàng)微量物質(zhì)的檢測，產(chǎn)生了良好的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益[朱正美，劉輝.免疫學(xué)技術(shù).北京科學(xué)出版社，2002]。
2，4-二氯酚可用于有機(jī)合成，對其制備方法研究已很成熟[趙美法，苯酚的系列氯代衍生物的合成與應(yīng)用，中國氯堿，2002，819-22]。它是生產(chǎn)二氯苯氧酸及其酯類除草劑2，4-二氯苯氧乙酸和2，4-二氯苯氧乙酸丁酯的中間體[李從寶，石磊.新世紀(jì)2，4-二氯苯酚形勢展望.化工中間體(市場快訊版)，2002，3/47-11]。還可用于生產(chǎn)殺蟲劑酚線磷、甲醋除草醚、除草醚及除草劑惡草酮[黑中一，王紅學(xué)，寇俊杰.制備高純度2，4-二氯苯酚的幾種方法，農(nóng)藥，2003，42(10)9-11]。在醫(yī)藥上可用于生產(chǎn)硫雙二氯酚，此外還可用于生產(chǎn)防霉劑、防蛀劑。但由于其大量的使用污染了土壤和水源，造成環(huán)境污染。由于2，4-二氯酚具有致癌、致畸和致突變的潛在毒性，已被中國、歐盟和美國環(huán)保署列入環(huán)境優(yōu)先控制污染物名單[I.Intergrated-Risk-Information-System(IRIS electronic database).Cincinnati.OH.USA，2001][M.Fielding，D.Barceló，A.Helweg.S.Galassi，L.Tortensson，P.VanZonen，R.Wolter，G.Angeletti，Pesticides in Ground and Drinking Water，EuropeanCommission，Brussels，1992]。
2，4-二氯酚帶來的環(huán)境影響及它對生物體的潛在毒性已引起人們的廣泛關(guān)注。根據(jù)世界衛(wèi)生組織和美國環(huán)境保護(hù)局給出其環(huán)境健康標(biāo)準(zhǔn)，2，4-二氯酚在水體中允許最大濃度為900μg/l[World Health Organization.Environmental healthcriteria for chlorophenols.Supplement.Draft，July 31，1986][U.S.EnvironmentalProtection Agency.Ambient water quality criteria for 2，4-fichlorophenol.EPA-440/5-80-042，NTIS Publ.No.PB81-117533，Office of Water Regulations andStandard(1980)]。我國執(zhí)行的《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GHZB1-1999)中規(guī)定2，4-二氯酚的限定標(biāo)準(zhǔn)值為0.002mg/L[《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GHZB1-1999)，2001]。
有關(guān)2，4-二氯酚免疫分析的研究，國內(nèi)外報(bào)道較少，張靜等通過琥珀酸酐法合成過2，4-二氯酚全抗原，運(yùn)用雙抗夾心法免疫法進(jìn)行分析[張靜，某些環(huán)境荷爾蒙物質(zhì)的免疫分析研究，福州大學(xué)碩士學(xué)位論文，2004]。Hiroyuki Tanaka等人通過酶聯(lián)免疫ELISA方法獲取能同時檢測2，4-二氯酚、2，4-二氯苯氧乙酸的抗體，但未見運(yùn)用于具體環(huán)境檢測中[Hiroyuki Tanaka，Shayu Yan，Norio Miura andYukihiro Shoyam！’Preparation of anti-2，4-dichlorophenol and2，4-dichlorophenoxyacetic acid monoclonal antibodies，Cytotechnology，Volume 42，Number 2，2003101-107]。而對于重氮法制備半抗原，間接競爭熒光免疫分析法(FIA)檢測2，4-二氯酚國內(nèi)外還未見報(bào)道。熒光免疫分析技術(shù)始創(chuàng)于40年代初，其基本原理是將特異性的抗體或抗原標(biāo)記上熒光基團(tuán)使之成為特異性的試劑，與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用熒光檢測儀檢測熒光信號。此法將免疫學(xué)反應(yīng)的特異性和熒光技術(shù)的敏感性相結(jié)合，比ELISA法具有更高的靈敏度與更低的檢測限。
本發(fā)明利用制備的2，4-二氯酚人工抗原免疫動物獲得具有效價高、特異性好的抗2，4-二氯酚多克隆抗體。所選用方法簡便易行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種2，4-二氯酚人工抗原。
本發(fā)明的目的還提供一種上述2，4-二氯酚人工抗原的準(zhǔn)備方法。
本發(fā)明的另外一個目的是提供一種上述2，4-二氯酚人工抗原的用途，用于制備特異性抗體和制備方法及其環(huán)境激素類物質(zhì)2，4-二氯的分析。
首先根據(jù)小分子免疫化學(xué)基本原理設(shè)計(jì)合成小分子目標(biāo)分析物半抗原，通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄅc載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)合成了人工全抗原，以純化后的全抗原免疫動物獲得了小分子分析物特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)從而定性定量地檢測樣品中痕量小分子目標(biāo)分析物，其選擇性決定于免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，其靈敏度取決于抗體的親合性。因此該技術(shù)可用于快速檢測水體和土壤中殘留的環(huán)境激素類物質(zhì)2，4-二氯酚。該技術(shù)的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、人工抗原的合成及抗體的制備。
本發(fā)明的2，4-二氯酚人工抗原具有如下的結(jié)構(gòu)式
其中，R＝BSA或OVA，可以表示為 或 NHBSA是牛血清白蛋白，NH BSA是卵清蛋白。
2，4-二氯酚的分子結(jié)構(gòu)式為 其結(jié)構(gòu)單元一部分是苯環(huán)，另一部分是苯環(huán)上的取代基羥基和鹵基。從免疫學(xué)角度上看，苯環(huán)空間結(jié)構(gòu)相對較大，酚羥基為特征基團(tuán)，可作為抗原決定簇。而酚羥基的鄰位，具有較高的化學(xué)活性，可作為與載體蛋白連接的臂。因而在合成半抗原時，保留苯基、酚羥基和鹵基，而將苯環(huán)上的鄰位氫取代，形成與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的臂。因此本專利在設(shè)計(jì)半抗原時，采用重氮化反應(yīng)，引入結(jié)構(gòu)中含有可與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的羧基的活性側(cè)鏈的合成方法來合成半抗原，這樣既可保持2，4-二氯酚半抗原與2，4-二氯酚在結(jié)構(gòu)上的相似性，又可使半抗原具有與載體蛋白偶聯(lián)的合適結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明合成的2，4-二氯酚半抗原的分子結(jié)構(gòu)為 化學(xué)名稱2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚，分子量為311。
2，4-二氯酚半抗原合成的技術(shù)方案是將對氨基苯甲酸溶于堿性溶液，在低溫下，慢慢滴加亞硼酸鈉的水溶液、濃酸反應(yīng)，然后過濾、洗滌、干燥后即得粗產(chǎn)品，粗產(chǎn)品經(jīng)過重結(jié)晶得成品。合成步驟如下
按對氨基苯甲酸、亞硝酸鈉、酸三者摩爾比1∶1～1.2∶1.5～1.8的量投料，將一定量的對氨基苯甲酸溶于5％堿性溶液(氫氧化鈉或氫氧化鉀)，在低溫冰水浴，磁力攪拌下慢慢滴加亞硝酸鈉水溶液，在濃酸(鹽酸或硫酸∶水＝1∶2～5，v/v)介質(zhì)中，保持反應(yīng)溫度0～5℃反應(yīng)，用KI-淀粉試紙檢驗(yàn)反應(yīng)的終點(diǎn)，試紙變蘭即為反應(yīng)終點(diǎn)(按對氨基苯甲酸摩爾值的0.01-0.05％加尿素少許，除去過量亞硝酸鈉)。
將一定量2，4-二氯酚溶于10％堿性溶液(氫氧化鈉或氫氧化鉀)，逐滴加入上述液，反應(yīng)20～40min。靜置過夜，抽濾，洗滌，得粗品。重結(jié)晶，干燥后得純品。反應(yīng)式如下 合成的半抗原具有反應(yīng)功能團(tuán)羧基，則可將其與載體蛋白通過適宜的交聯(lián)試劑與交聯(lián)方法，使半抗原與蛋白偶聯(lián)。
本發(fā)明的2，4-二氯酚人工抗原合成的可以采用下述方法分別獲得(1)活化酯法合成免疫原以酰胺基CONH為橋，將半抗原通過活化酯法，分別連接到載體蛋白質(zhì)(Protein)上，半抗原上的羧基先與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)反應(yīng)生成一個中間物，然后再與蛋白質(zhì)上的氨基偶聯(lián)，形成半抗原-蛋白質(zhì)的偶聯(lián)物。
反應(yīng)式如下 其合成步驟如下將溶有NHS和DCC的有機(jī)溶劑逐滴加入溶有半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚的有機(jī)溶劑中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6～12小時，4℃過夜，離心分出上清液。將上層的活化酯液加入到溶于緩沖溶液的蛋白質(zhì)溶液中，4℃反應(yīng)2～6h。所述的半抗原、NHS、DCC、蛋白質(zhì)四者摩爾比分別為1∶2～4∶2～4∶0.01～0.05。
反應(yīng)完畢，將溶液裝入透析袋，用蒸餾水透析或pH6.8～7.4磷酸鹽緩沖溶液PBS透析5d。透析后離心分出上清液，即得免疫原DCP-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，經(jīng)過柱提純后，加入等量甘油-20℃下冷凍保存，或-20℃凍干保存。
(2)混合酸酐法合成包被原，步驟如下半抗原的羧基在正丁胺的存在下，與氯甲酸異丁酯反應(yīng)，形成混合酸酐中間體，再與蛋白質(zhì)的氨基反應(yīng)，形成半抗原-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物。
反應(yīng)式如下 取一定量溶有半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚的有機(jī)溶劑，順次加入正丁胺與氯甲酸異丁酯，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2～4h。將上述反應(yīng)液逐滴入用緩沖溶液溶解的蛋白質(zhì)溶液中，4℃反應(yīng)1～3h。按半抗原、正丁胺、氯甲酸異丁酯、蛋白質(zhì)四者摩爾比分別為1∶2～4∶1.5～3∶0.01～0.05。
反應(yīng)完畢，將溶液裝入透析袋，用蒸餾水透析或pH6.8～7.4磷酸鹽緩沖溶液PBS透析5d。透析后離心得上清液，即得包被原DCP-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，經(jīng)過柱提純后，加入等量甘油-20℃下保存，或-20℃凍干保存。
所述的有機(jī)溶劑是N，N-二甲基甲酰胺DMF或二甲亞砜DMSO。
利用上述的2，4-二氯酚人工抗原，免疫動物制備的2，4-二氯酚特異性抗體，它是能與2，4-二氯酚發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的免疫球蛋白IgG。
上述的2，4-二氯酚特異性抗體用于檢測水體及土壤中2，4-二氯酚的殘留量。
本發(fā)明通過設(shè)計(jì)合成2，4-二氯酚半抗原和人工抗原，經(jīng)免疫動物產(chǎn)生特異性抗體，以抗原抗體特異性免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，并引入標(biāo)記物來放大顯示這一反應(yīng)，可用于實(shí)際樣品中2，4-二氯酚殘留量的測定。此法靈敏度高、特異性強(qiáng)，樣品前處理簡單，便于進(jìn)行現(xiàn)場監(jiān)測。
總之，本發(fā)明提供一種2，4-二氯酚半抗原的合成路線。本發(fā)明提供一種2，4-二氯酚人工抗原的合成方法。本發(fā)明還提供一種具有較高特異性抗2，4-二氯酚抗體的簡便可行的制備方法。本發(fā)明提供一種2，4-二氯酚抗體的熒光免疫檢測和分析技術(shù)。
本發(fā)明還具有以下優(yōu)點(diǎn)和積極效果(1)抗體實(shí)用性強(qiáng)2，4-二氯酚抗體制備技術(shù)具有重要的使用價值和實(shí)際意義。制備的特異性好、效價高的抗體，以抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)可用于樣品測定。此抗體及其制備方法為免疫測定2，4-二氯酚提供保障，也為環(huán)境激素2，4-二氯酚快速檢測試劑盒的研制解決了一個技術(shù)難點(diǎn)。
(2)抗體穩(wěn)定性好此法制備的2，4-二氯酚抗體具有較好的穩(wěn)定性。
(3)抗體制備技術(shù)簡便可行抗體的整個制備過程無需特別的儀器設(shè)備，成本低廉，容易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
本發(fā)明的其它的目的、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)可從優(yōu)選實(shí)驗(yàn)方案的描述中得到證實(shí)。
具體實(shí)施例實(shí)施例1 2，4-二氯酚半抗原的合成與鑒定1 2，4-二氯酚半抗原的合成5.5mmol 0.75g對氨基苯甲酸溶于5ml 5％氫氧化鈉，冷卻后冰浴下滴入0.4g亞硝酸鈉(溶于3ml水)，磁力攪拌下加入1.5ml濃HCl(溶于5ml水)，保持反應(yīng)溫度0～4℃反應(yīng)30min(至KI-淀粉試紙變蘭，加尿素少許)將1g 2，4-二氯酚溶于2ml 10％NaOH，逐滴加入上述液，反應(yīng)20min。靜置過夜，得黃褐色塊狀固體。用水及乙醇(1∶1)重結(jié)晶。干燥得粉末固體，即半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚，產(chǎn)率84％。
2 2，4-二氯酚半抗原的鑒定取上述合成的產(chǎn)物經(jīng)紅外光譜IR及核磁共振譜1H-NMR測定分子結(jié)構(gòu)。IR(KBr壓片)cm-13431(νO-H)，3078(＝C-H)，1693(-COOH)，1603(＝N)，1499(νN＝N)，1223(νC-O)，931(δO-HCOOH)，776(C＝CH)，740(-OH)。1H-NMR(Pry)δ(ppm)8.39-8.41(2H，ArH)，δ7.83-7.85(2H，ArH)，δ7.80(H，ArH)，δ7.68(H，ArH)。從以上分析綜合可知，所合成的產(chǎn)物為目標(biāo)物。
實(shí)施例2 2，4-二氯酚人工抗原的合成與鑒定將半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚，分別采用活化酯法和混合酸酐法連接到BSA和OVA上，合成人工抗原(免疫原和包被原)，具體方法為2.1免疫原的合成稱取0.2mmol 62mg半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚溶于200μlDMF中，將19.4mg NHS與34.2mg DCC溶于300μl DMF，逐滴加入半抗原溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)4h，4℃過夜，離心分出上清液。將上層的活化酯液加入到60mg BSA溶于5ml碳酸鹽緩沖溶液(0.05M，pH9.6)，4℃反應(yīng)4h。反應(yīng)完畢，將溶液裝入透析袋，用0.9％生理鹽水透析5d，每6h換液一次。透析后離心分出上清液，即得免疫原DCP-BSA，經(jīng)過硅膠柱層析提純后，加入等量甘油-20℃下冷凍保存。
2.2包被原的合成稱取0.2mmol 62mg半抗原4，6-二氯-2-(4-羧基苯基偶氮)苯酚溶于200μlDMF中，順次加入20μl正丁胺與20μl氯甲酸異丁酯，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1h。另取40mg OVA溶于3ml碳酸鈉緩沖溶液(0.05M，pH9.6)，逐滴加上述反應(yīng)液100μl，4℃反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢，將溶液裝入透析袋，用0.9％生理鹽水透析5d，每6h換液一次。透析后離心得上清液，即得包被原DCP-OVA，經(jīng)過硅膠柱層析提純后，加入等量甘油4℃下保存。
2.3人工抗原的鑒定采用全波長紫外分光光度計(jì)對半抗原、載體蛋白及偶聯(lián)物進(jìn)行掃描，根據(jù)吸收峰確定偶聯(lián)是否成功。結(jié)果顯示半抗原在248nm和348nm處有特征吸收峰，蛋白質(zhì)BSA和OVA在280nm處有特征吸收峰，而偶聯(lián)物特征吸收峰為336nm，偶聯(lián)物的吸收峰與蛋白質(zhì)、半抗原比較發(fā)生了位移。偶聯(lián)物具備有半抗原的吸收特征也說明人工抗原的合成是成功的。根據(jù)半抗原-結(jié)合物在紫外吸收區(qū)域的吸收約等于游離蛋白和半抗原的吸光值的簡單加和的特點(diǎn)，通過三者在280nm的吸光值按下列公式計(jì)算結(jié)合比結(jié)合比＝[ε280抗原-ε280蛋白質(zhì)]/ε280半抗原經(jīng)過計(jì)算，結(jié)合比如下免疫原TCP-BSA結(jié)合比為21∶1、包被原TCP-OVA結(jié)合比為17∶1。本文合成的2，4-二氯酚人工抗原結(jié)合比值都在文獻(xiàn)所建議的范圍之內(nèi)，證明了所合成的2，4-二氯酚人工抗原比較理想。
實(shí)施例3 2，4-二氯酚抗體的制備及純化3.1抗血清的制備選取成年的雄性新西蘭白兔每組三只(編號1、II和III)，體重約2～2.5Kg，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動物房，觀察一周后免疫(由上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物房飼養(yǎng))。
將免疫原慢慢解凍，用0.9％生理鹽水(或PBS)稀至1mg/ml，按免疫劑量吸入5ml消毒注射器中，首次免疫加入等量弗氏完全佐劑(CFA)，用聚氟乙烯塑膠管連接另一支5ml注射器，對推至充分乳化，形成油包水(W/O)狀態(tài)，按免疫方案注射免疫。
首次免疫采用由等量弗氏完全佐劑乳化的免疫原，于兔背部皮內(nèi)多點(diǎn)注射免疫。首免后間隔四周，以后每隔二周用由弗氏不完全佐劑乳化的免疫原，于兔背部、頸部皮下多點(diǎn)及腿部注射加強(qiáng)免疫，免疫劑量為每公斤免體重2mg。從第三次開始，每次免疫后7天，于兔耳緣靜脈采少量血，分離血清，測定抗體效價。當(dāng)達(dá)到一定效價后，采全血。本實(shí)驗(yàn)采用兔頸動脈取血法，每只兔子可采血約60ml左右，采血后，收集在100ml的三角錐形瓶中，待血液凝固后，用針頭將三角瓶邊緣的血塊與離心管分離，置于37℃溫箱中30min，再放于4℃冰箱3～4h，等血塊收縮后，用吸管將血清吸入離心管中，以4000rpm離心15min，分離出血清。于-20℃保存。I號兔得血清23ml，II號兔得血清25ml，III號兔得血清17ml。
3.2抗體效價測定將免疫原按制定的免疫方案免疫了兩只兔子。從加強(qiáng)免疫第三次開始，在每次免疫后第7天于兔耳緣靜脈采少量血，血清經(jīng)適當(dāng)稀釋后，用瓊脂雙向擴(kuò)散法和熒光免疫法測定抗體效價。待第四次免疫后，有兩只兔子獲得了較高的效價(瓊脂雙擴(kuò)散法≥1∶32)，瓊脂雙擴(kuò)散法測得的效價分別為1∶32、1∶16和1∶64，熒光免疫法測得效價分別為1∶25600、1∶6400和1∶51200(抗血清熒光值/陰性對照熒光值＞2)。
3.3抗體的純化和鑒定抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨二步鹽析法、經(jīng)葡聚糖凝膠柱除鹽和二乙基氨基乙基纖維素柱反相吸附純化血清，純化抗體凍干后于-20℃保存。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除免疫球蛋白IgG外的蛋白質(zhì)都沉淀下來，上清液中只有IgG。
實(shí)施例4 2，4-二氯酚間接競爭熒光免疫方法(FIA)的建立4.1熒光免疫方法的原理間接競爭熒光免疫分析法是將小分子的氯酚類環(huán)境激素與大分子載體偶聯(lián)制備的復(fù)合物作為包被抗原吸附于固相載體(96孔熒光酶標(biāo)板)上，制成固相抗原，然后加入待測氯酚，固相抗原中的氯酚和待測氯酚與抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)，若待測氯酚含量越多，被結(jié)合在固相抗體原上的抗體就越少，反之結(jié)合在固相抗原的抗體則多，反應(yīng)后加入熒光標(biāo)記的二抗(只能與結(jié)合在固相抗原上的抗體結(jié)合)，最后洗去游離未反應(yīng)的待測物、2，4-二氯酚抗體和二抗，置于熒光酶標(biāo)儀上讀數(shù)。當(dāng)抗體量一定時，加入的待測氯酚量越多，與固相抗原結(jié)合的抗體就越少，熒光強(qiáng)度就減弱，抑制率增高，反之，則熒光強(qiáng)度增大，抑制率增高，因此可以根據(jù)已知量的氯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣品的抑制率，推算出待測氯酚的濃度。
4.2抗原與抗體最佳工作濃度的確定用方陣試驗(yàn)分別對間接競爭FIA法中抗原及抗體工作濃度進(jìn)行篩選和認(rèn)定。在同一包被液濃度下，隨著抗體濃度的稀釋，所得的熒光強(qiáng)度呈下降，同樣在同一抗體濃度下，隨著包被液濃度的下降，所得的熒光強(qiáng)度也呈下降。以抑制靈敏度高，線性好的試驗(yàn)組合為最佳工作濃度。結(jié)果判定以在熒光酶標(biāo)儀讀取的各孔熒光值F中，以ΔF讀數(shù)較大，而抗原抗體用量較少的為抗原抗體的工作濃度。選擇包被抗原濃度為5μg/ml，抗體濃度為2.5μg/ml為最佳工作濃度，4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制根據(jù)方陣試驗(yàn)結(jié)果，以空白吸收值最低，熒光強(qiáng)度較好，2，4-二氯酚對抗原抗體結(jié)合反應(yīng)抑制率高，線性關(guān)系好的試驗(yàn)條件組合建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。其步驟如下
(1)包被以0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液將包被抗原稀釋至工作濃度，100μL/孔加至熒光酶標(biāo)板，4℃過夜。
(2)封閉將包被好的板取出，待其恢復(fù)至室溫，PBST(含0.05％吐溫20的PBS溶液)洗滌3次。加入1％OVA封閉，150μL/孔，37℃溫育0.5h。
(3)加樣將封閉好的板取出，待其恢復(fù)至室溫，PBST洗滌3次。每孔依次加入50μL經(jīng)PBST稀釋的系列濃度的2，4-二氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液和50μL經(jīng)PBST稀釋的抗體，對照孔加入50μL PBST，37℃溫育1h。
(4)二抗反應(yīng)將溫育好的板取出，待其恢復(fù)至室溫，PBST洗滌3次。每孔加入100μL PBST稀釋羊抗兔FITC-IgG(1∶1000)，37℃溫育1h。
(5)測定將溫育好的板取出，PBST洗滌5次。用熒光酶標(biāo)儀讀取熒光強(qiáng)度值F，λ設(shè)為528nm。
(6)根據(jù)抑制率對2，4-二氯酚濃度作圖，得到2，4-二氯酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，進(jìn)行相關(guān)分析，并計(jì)算IC50和IC20。
FIA法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以抑制率I對2，4-二氯酚的對數(shù)作圖。抑制率的計(jì)算公式如下I%=(FMax-FMin)-(FS-FMin)(FMax-FMin)×100]]>I-抑制率，F(xiàn)Max-不加氯酚樣品時的吸光值，F(xiàn)s-加氯酚樣品時的熒光值，F(xiàn)Min-空白對照孔的熒光值(或陰性對照值孔的熒光值)由上式可得2，4-二氯酚各濃度的抑制率，作圖。結(jié)果表明，當(dāng)2，4-二氯酚的濃度在5～100μg/L范圍內(nèi)，抑制率I與2，4-二氯酚的對數(shù)呈明示的線性關(guān)系，其線性回歸方程為I＝32.06x+9.32，相關(guān)系數(shù)r＝0.9903，抑制中濃度(以抑制率為50％表示)IC50＝18.6μg/L，最低檢測限(以抑制率為20％表示)IC20＝2.15μg/L。
4.4抗體的特異性抗體的特異性即是指它和同特異性抗原結(jié)合的能力與抗原類似物結(jié)合能力的比較，常以交叉反應(yīng)率作為評價的標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，則抗體的特異性越好。選取與2，4-二氯酚結(jié)構(gòu)相似的化合物五氯酚、2，4，6-三氯酚、2-氯酚、4-氯酚等與2，4-二氯酚在相同條件下通過FIA試驗(yàn)進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，從而測定2，4-二氯酚抗體的特異性。根據(jù)2，4-二氯酚類似物的抑制曲線，求出不同氯酚的抑制中濃度IC50，根據(jù)下列公式計(jì)算出交叉反應(yīng)率 2，4-二氯酚抗體對五氯酚、2，4，6-三氯酚、2-氯酚、4-氯酚等的交叉反應(yīng)率分別為3.9％、10.4％、16.2％、1.7％。從而可知，所制備的三種抗體的特異性較強(qiáng)。5樣品的FIA快速測定5.1樣品預(yù)處理水樣取河水、自來水及湖水經(jīng)沉淀過濾后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH6.8，分別添加不同濃度的2，4-二氯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，用間接競爭FIA法進(jìn)行加標(biāo)回收測定，計(jì)算回收率。
5.2樣品的測定樣品測定方法與標(biāo)準(zhǔn)曲線的操作相同，將經(jīng)包被和封閉好的的板每孔加入系列已知添加濃度的樣品液50μl，對照孔加入100μl抗體，37℃溫育1h后，洗滌，余后步驟同前。經(jīng)分析可知，該方法用于水樣中2，4-二氯酚殘留的測定，回收率在89.0～106.1％之間，變異系數(shù)范圍在3.18～11.73％之間。隨著樣品添加量的降低，回收率基本呈下降趨勢。
實(shí)施例5包被抗原與抗體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)快速檢測法對于人工抗原和抗體在常溫下的穩(wěn)定程度有很高的要求，因此本發(fā)明進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。把經(jīng)包被、封閉、洗滌后的熒光酶標(biāo)板直接倒置或用保鮮膜密封后倒置于4℃冰箱中保存，定期測定貯存時間對FIA分析的影響。本發(fā)明合成的人工抗原具有較好的穩(wěn)定性，在4℃環(huán)境下可保存6個月不變性，-20℃冰箱中至少可保存12個月。
凍干抗體的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在-20□保存，其穩(wěn)定性至少可保持12個月以上；在4□保存，其穩(wěn)定性至少可保持6個月以上；在0～25□室溫保存，其穩(wěn)定性至少可保持2個月以上?？梢詽M足快速檢測要求。
盡管參考目前被認(rèn)為是優(yōu)選的實(shí)施方案，但是本發(fā)明并不受所公開的發(fā)明的限制。相反，在所受權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)，本發(fā)明包括各種改變和等同的方案。下面權(quán)利要求的范圍給予最廣泛地解釋，以便包括所有這些改變和等同結(jié)構(gòu)和功能。
權(quán)利要求
1，一種2，4-二氯酚人工抗原，其具有如下的結(jié)構(gòu)式 其中，R＝BSA或OVA，NHBSA是牛血清白蛋白，NHBSA是卵清蛋白。
2，如權(quán)利要求1所述的2，4-二氯酚人工抗原的制備方法，其特征是采用下述二種方法分別獲得(1)活化酯法合成免疫原，步驟如下在有機(jī)溶劑中，N-羥基琥珀酰亞胺、N，N-二環(huán)己基碳二亞胺和半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚N ，N-二甲基甲酰胺室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6～12h，4℃保溫4～10小時，離心分出上清液；將上層的活化酯液和pH9.6的牛血清白蛋白的碳酸鹽緩沖溶液，4℃反應(yīng)2～6h后，用蒸餾水透析或pH6.8～7.4磷酸鹽緩沖溶液透析5天，離心分出上清液，即得免疫原TCP-BSA；所述的半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚、N-羥基琥珀酰亞胺、N，N-二環(huán)己基碳二亞和牛血清白蛋白的摩爾比為1∶2～4∶2～4∶0.01～0.05。(2)混合酸酐法合成包被原，步驟如下在室溫和有機(jī)溶劑中，半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚、正丁胺與氯甲酸異丁酯反應(yīng)2～4h；另取pH9.6的卵清蛋白的碳酸鈉緩沖溶液和上述反應(yīng)液在4℃反應(yīng)1～3h，然后反應(yīng)溶液用蒸餾水透析或pH6.8～7.4磷酸鹽緩沖溶液透析1～5天，透析后離心得上清液，即得包被原TCP-OVA；所述的半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚、正丁胺、氯甲酸異丁酯與卵清蛋白的摩爾比為1∶2～4∶1.5～3∶0.01～0.05。其中，所述的免疫原TCP-BSA結(jié)構(gòu)式為 所述的包被原TCP-OVA結(jié)構(gòu)式為 其中，NHBSA和NHOVA如權(quán)利要求1所述。
3.如權(quán)利要求2所述的2，4-二氯酚人工抗原的制備方法，其特征是有機(jī)溶劑是N，N-二甲基甲酰胺或二甲亞砜。
4.如權(quán)利要求2所述的2，4-二氯酚人工抗原的制備方法，其特征是所述的免疫原和包被原分別被加入等量甘油-20℃下保存。
5.如權(quán)利要求2所述的2，4-二氯酚人工抗原的制備方法，其特征是所述的2，4-二氯酚半抗原的制備方法是(1)在氫氧化鈉水溶液中和冰水浴下，對氨基苯甲酸、亞硝酸鈉和濃HCl溶液，在0～4℃反應(yīng)0.5～1h；再加入尿素少許；所述的氨基苯甲酸、亞硝酸鈉、酸和尿素的摩爾比1∶1～1.2∶1.5～1.8∶0.01～0.05；(2)將2，4-二氯酚的NaOH的水溶液和上述(1)的反應(yīng)液反應(yīng)20～30min，靜置4～10小時，抽濾，洗滌，得粗品，其中，2，4-二氯酚和(1)的產(chǎn)物摩爾比為1∶0.8～1。
6.如權(quán)利要求2所述的2，4-二氯酚人工抗原的制備方法，其特征是所述的粗品，用醇溶液重結(jié)晶、干燥得純半抗原2，4-二氯-6-(4-羧基苯基偶氮)苯酚，
7.一種如權(quán)利要求1所述的2，4-二氯酚人工抗原的用途，其特征是用于制備2，4-二氯酚抗體、2，4-二氯酚間接競爭熒光免疫方法的建立或水環(huán)境中殘留2，4-二氯酚的檢測。
8.如權(quán)利要求7所述的2，4-二氯酚人工抗原的用途，其特征是所述的2，4-二氯酚抗體的制備方法如下(1)選取成年的雄性新西蘭白兔每組兩只，體重約2～2.5Kg；用0.9％生理鹽水或磷酸鹽緩沖溶液將免疫原稀至1mg/ml，首次免疫加入等量弗氏完全佐劑，充分乳化，形成油包水狀態(tài)，注射免疫，首免后間隔四周，以后每隔二周用由弗氏不完全佐劑乳化的免疫原，于兔背部、頸部皮下多點(diǎn)及腿部注射加強(qiáng)免疫，免疫劑量為每公斤免體重2mg，從第三次開始，每次免疫后7天，于兔耳緣靜脈采少量血，分離血清，測定抗體效價，當(dāng)達(dá)到一定效價后，頸動脈取血，分離出血清，于-20℃保存；(2)抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨二步鹽析法、經(jīng)葡聚糖凝膠柱除鹽和二乙基氨基乙基纖維素柱反相吸附純化血清得到純度較高的免疫球蛋白IgG。
全文摘要
本發(fā)明是一種2，4－二氯酚人工抗原、制備方法及其用途。其具有如右的結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)，其中，R＝BSA或OVA，NHBSA是牛血清白蛋白，NHBSA是卵清蛋白。系由半抗原2，4－二氯－6－(4－羧基苯基偶氮)苯酚經(jīng)過活化酯法或者混合酸酐法合成。該抗原可用于制備2，4－二氯酚抗體、2，4－二氯酚間接競爭熒光免疫方法的建立或水環(huán)境中殘留2，4－二氯酚的檢測。本發(fā)明的抗體實(shí)用性強(qiáng)、穩(wěn)定性好；制備方法簡便可行、成本低廉和容易工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C07K16/00GK1775805SQ20051011096
公開日2006年5月24日 申請日期2005年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日
發(fā)明者余宇燕, 莊惠生 申請人:東華大學(xué)