專利名稱：TGF－β基因表達(dá)抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β基因表達(dá)抑制劑、用于與TGF-β相關(guān)的疾病的治療藥物和新的吡咯-咪唑聚酰胺。更具體地說，本發(fā)明涉及含有具有特定結(jié)構(gòu)的吡咯-咪唑聚酰胺的TGF-β基因表達(dá)抑制劑。
背景技術(shù)：
原發(fā)性高血壓誘發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，諸如腦卒中、缺血性心臟病、腎硬化等，并且這些并發(fā)癥基本上與因血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)過度生長的血管病有關(guān)且是高血壓療法的目標(biāo)。此外，在治療心絞痛和心肌梗死的經(jīng)皮經(jīng)腔冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(PTCA)后，在約40％的病例中出現(xiàn)再狹窄，但沒有治療它的有效藥物，并且是心血管領(lǐng)域中的巨大難題。在組織病理學(xué)上，已知在動(dòng)脈增生性疾病，諸如高血壓性血管疾病、血管成形術(shù)后的新內(nèi)膜形成和動(dòng)脈粥樣硬化中涉及TGF-β。認(rèn)為這類疾病中的細(xì)胞生長會(huì)受到各種機(jī)制抑制。不同機(jī)制之一為抑制轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)表達(dá)。
TGF是首先作為莫洛尼(Molony)肉瘤病毒(MSV)轉(zhuǎn)化的小鼠3T3細(xì)胞的因子發(fā)現(xiàn)的，而莫洛尼(Molony)肉瘤病毒(MSV)可以將正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成惡性細(xì)胞并且主要分類為TGF-α和TGF-β。TGF-β是蛋白質(zhì)的C-末端上的112個(gè)氨基酸的部分，其中所述蛋白質(zhì)的分子量約為40,000且由作為前體的390-412個(gè)氨基酸組成并且進(jìn)一步通過二硫鍵形成二聚體(25kDa)以便具有活性。
構(gòu)成控制細(xì)胞生長和發(fā)育的蛋白質(zhì)家族的TGF-β(非專利對(duì)比文件1)在不同組織中產(chǎn)生，諸如血管、血小板、肝、腎、心肌、肺、胰腺、皮膚、胎盤、骨髓，并且對(duì)細(xì)胞增殖、胞外基質(zhì)形成和免疫性具有控制活性。
TGF-β抑制大部分細(xì)胞增殖，但對(duì)間質(zhì)細(xì)胞，諸如成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)等具有雙相增殖活性。即，在正常條件下，TGF-β抑制這些細(xì)胞增殖，而在諸如炎癥、機(jī)械應(yīng)激等情況下刺激增殖。這些事實(shí)揭示出TGF-β通過促進(jìn)VSMC生長和胞外基質(zhì)形成涉及血管成形術(shù)后的新內(nèi)膜形成。在動(dòng)脈硬化損害形成中也涉及TGF-β?；谶@類信息，認(rèn)為目的在于控制TGF-β作用的對(duì)血管疾病的局部治療可以有效減輕上述動(dòng)脈增生性疾病。
此外，認(rèn)為經(jīng)皮的腎血管成形術(shù)后的腎動(dòng)脈再狹窄中涉及TGF-β。這些事實(shí)揭示出本發(fā)明的特異性TGF-β基因表達(dá)抑制劑可以有效地作為上述各種增生性血管和狹窄性疾病的治療藥物。
此外，肝中的星形膠質(zhì)細(xì)胞在肝中原纖維形成過程中的胞外基質(zhì)產(chǎn)生中起重要作用(非專利對(duì)比文件2)。星形膠質(zhì)細(xì)胞由TGF-β1活化，并且活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)TGF-β1從受損害的肝中的炎癥細(xì)胞中分泌。同時(shí)，TGF-β1受體的表達(dá)在活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中受到促進(jìn)，并且胞外基質(zhì)蛋白通過自身內(nèi)分泌機(jī)制在TGF-β1周圍增加(非專利對(duì)比文件3)。這些事實(shí)揭示出有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為上述各種肝病的治療藥物。
此外，TGF-β的表達(dá)在腎病，諸如IgA腎病、局灶性腎小球硬化、新月形腎炎、局灶性硬化性狼瘡性腎炎、彌漫性增生性狼瘡性腎炎、糖尿病性腎病變、高血壓性腎硬化等的模型動(dòng)物腎活組織檢查中的胞外基質(zhì)中和腎小球腎炎和糖尿病性腎病變患者的腎活檢組織中同時(shí)增加(非專利對(duì)比文件4和非專利對(duì)比文件5)。同時(shí)，Border等報(bào)導(dǎo)了對(duì)Thy-1腎炎大鼠給予抗-TGF-β抑制胞外基質(zhì)在腎小球中的蓄積(非專利對(duì)比文件5)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為上述各種腎病的治療藥物。
此外，在心肌梗死動(dòng)物模型中的疤痕形成階段上的梗死形成病灶中，TGF-β的表達(dá)連續(xù)升高并且涉及心肌纖維性顫動(dòng)(非專利對(duì)比文件6)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為心肌梗死后心肌纖維性顫動(dòng)的治療藥物。
此外，對(duì)肺纖維化模型動(dòng)物給予抗-TGF-β抗體和TGF-β的可溶性受體改善了肺纖維化(非專利對(duì)比文件7)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為肺纖維化的治療藥物。
此外，有許多有關(guān)TGF-β1在人慢性胰腺炎中高度表達(dá)的報(bào)導(dǎo)，并且對(duì)復(fù)發(fā)性急性胰腺炎模型動(dòng)物給予重組TGF-β誘導(dǎo)胰腺炎癥損害處的原纖維形成或纖連蛋白mRNA的高度表達(dá)。相反，已經(jīng)證實(shí)當(dāng)準(zhǔn)備了胰腺炎模型時(shí)，給予針對(duì)TGF-β1的中和抗體抑制了胞外基質(zhì)產(chǎn)生以及I和III型膠原蛋白和纖連蛋白的mRNA表達(dá)(非專利對(duì)比文件8)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為慢性胰腺炎中原纖維形成的治療藥物。
此外，已經(jīng)提出硬皮病可能由TGF-β導(dǎo)致，并且Mori等報(bào)導(dǎo)了TGF-β誘導(dǎo)皮膚原纖維形成模型小鼠的皮膚原纖維形成(非專利對(duì)比文件9)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為各種皮膚原纖維形成疾病的治療藥物。
此外，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了TGF-β mRNA的表達(dá)在骨髓纖維化患者的巨核細(xì)胞中得到促進(jìn)(非專利對(duì)比文件10)，并且TGF-β在血小板中的濃度取得了高值(非專利對(duì)比文件11)且TGF-β在患者血漿中的濃度明顯較高(非專利對(duì)比文件12)。根據(jù)Rameshwar等所述，骨髓纖維化患者的單核細(xì)胞通過粘著活化了誘導(dǎo)IL-1產(chǎn)生的NF-k且IL-1通過促進(jìn)TGF-β產(chǎn)生導(dǎo)致骨髓纖維化(非專利對(duì)比文件13)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為骨髓纖維化的治療藥物。
此外，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在具有額部毛發(fā)脫失的雄激素性脫發(fā)患者的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中，雄激素從真皮乳頭細(xì)胞中誘導(dǎo)TGF-β1且這種TGF-β1抑制表皮細(xì)胞生長(非專利對(duì)比文件14)。這些事實(shí)提示有理由推定本發(fā)明的TGF-β1基因表達(dá)特異性抑制劑可以有效地作為具有額部毛發(fā)脫失的雄激素性脫發(fā)的治療藥物。
已經(jīng)將使反求遺傳學(xué)中的基因功能失活的方法用于分析特異性基因功能，該方法還具有用于病毒感染、癌癥和異?；虮磉_(dá)導(dǎo)致的其它疾病的治療應(yīng)用的潛力。即，已知可以通過同源重組在DNA水平上或者可以通過反義寡脫氧核苷酸和核酶在RNA水平上實(shí)現(xiàn)基因功能失活。然而，使用反義寡核苷酸和核酶的方法存在靶序列受限、反義寡核苷酸和核酶轉(zhuǎn)入組織和細(xì)胞無效和它們易于被核糖核酸酶降解的問題。
另一方面，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了不同于(脫氧)核苷酸試劑，諸如反義試劑和核酶，吡咯-咪唑聚酰胺類(下文也稱作Py-Im聚酰胺)可以特異性識(shí)別DNA序列并在胞外控制特異性基因的表達(dá)。
吡咯-咪唑聚酰胺類是一組合成小分子，它們由為芳族環(huán)的N-甲基吡咯單元(下文也稱作Py)和N-甲基咪唑單元(下文也稱作Im)組成(非專利對(duì)比文件15-17)。連續(xù)偶聯(lián)并折疊的Py和Im在γ-氨基丁酸酯的存在下可以呈現(xiàn)U-形構(gòu)象。在本發(fā)明涉及的吡咯-咪唑聚酰胺類中，N-甲基吡咯單元(Py)、N-甲基咪唑單元(Im)和γ-氨基丁酸酯單元(也稱作γ-連接基)彼此通過酰胺鍵(-C(＝O)-NH-)結(jié)合，并且吡咯-咪唑聚酰胺類的一般結(jié)構(gòu)和生產(chǎn)方法為公知的(專利對(duì)比文件1-3)。
合成的聚酰胺類可以結(jié)合具有高度親和性和特異性的雙螺旋DNA小溝中的特異性堿基對(duì)。堿基對(duì)的特異性識(shí)別取決于Py與Im的1對(duì)1配對(duì)的形成。即，在DNA小溝中的U-形構(gòu)象中，Py/Im對(duì)靶向C-G堿基對(duì)，Im/Py靶向G-C堿基對(duì)，且Py/Py靶向A-T堿基對(duì)和T-A堿基對(duì)(非專利對(duì)比文件16-17)。按照近來的研究，顯而易見的是，作為用3-羥基吡咯(Hp)取代Py/Py對(duì)的吡咯環(huán)的結(jié)果，A-T縮合可以通過Hp/Py優(yōu)選與T/A對(duì)結(jié)合而得到克服(非專利對(duì)比文件18)。
一般來說，認(rèn)為啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄是基因控制中的重要點(diǎn)。為了啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，需要幾種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基因啟動(dòng)子區(qū)中的特異性識(shí)別序列。小溝中的聚酰胺可以通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合干擾基因控制，條件是該轉(zhuǎn)錄因子在基因表達(dá)中起重要作用。這種推定已經(jīng)在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中被證實(shí)為正確的。結(jié)合在鋅指識(shí)別位點(diǎn)(TFIIIA結(jié)合位點(diǎn))內(nèi)的8元環(huán)Py-Im聚酰胺抑制5S RNA基因的轉(zhuǎn)錄(非專利對(duì)比文件19)。結(jié)合與人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)啟動(dòng)子中的轉(zhuǎn)錄因子序列相鄰的堿基對(duì)序列的聚酰胺類阻斷人細(xì)胞中的HIV-1復(fù)制。這些序列包括TATA框、淋巴細(xì)胞強(qiáng)化因子LEF-1序列和ETS-1序列(非專利對(duì)比文件20)。與它們相反，聚酰胺還可以通過阻斷阻抑因子或取代原始轉(zhuǎn)錄因子活化基因的表達(dá)(非專利對(duì)比文件21-23)。人巨細(xì)胞病毒(CMV)的UL122介導(dǎo)的早期蛋白2(IE86)阻斷將RNA聚合酶II提供給啟動(dòng)子并抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄(非專利對(duì)比文件21)。合成的聚酰胺類可以通過IE86阻斷抑制并減緩相應(yīng)基因的表達(dá)(非專利對(duì)比文件22)。通過Mapp設(shè)計(jì)的聚酰胺作為人工轉(zhuǎn)錄因子起作用并介導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(非專利對(duì)比文件23)。
專利對(duì)比文件1日本專利JP3045706專利對(duì)比文件2JP-A-2001-136974專利對(duì)比文件3WO 03/000683 A1非專利對(duì)比文件1Piek等，《FASEB雜志》(FASEB J.)13，2105-2124(1999)非專利對(duì)比文件2Bataller R等《胃腸病學(xué)》(Gastroenterology)118，1149，2000非專利對(duì)比文件3Watanabe，H.等Gendai Iryo 35(No.2)，2003非專利對(duì)比文件4Yamamoto T.等《國際腎臟》(KidneyInt)49461，1996非專利對(duì)比文件5Border WA等《國際腎臟》(KidneyInt)511388，1997非專利對(duì)比文件6Ono等《循環(huán)》(Circulation)98149，1998非專利對(duì)比文件7Giri SN al《胸腔》(Thorax)1993非專利對(duì)比文件8Makino，N等Gendai Iryo Vol.35，No.2，2003非專利對(duì)比文件9Mori等《細(xì)胞生理學(xué)雜志》(J CellPhysiol)；181153，1999非專利對(duì)比文件10Reilly J等《臨床血液病學(xué)》(ClinHaematol)11751-767，1998非專利對(duì)比文件11Martyre MC等《英國血液病學(xué)雜志》(Br J Haematol)7780-86，1991非專利對(duì)比文件12Rameshwar P等《美國血液病學(xué)雜志》(Am J Haematol)59133-142，1998非專利對(duì)比文件13Rameshwar等《免疫學(xué)雜志》(JImmunol)1652271-2277，2000非專利對(duì)比文件14Shigeki等《FASEB雜志》(FASEBJ.)161967-1969，2002非專利對(duì)比文件15Trauger等《自然》(Nature)，1996；382559-61非專利對(duì)比文件16White等《化學(xué)與生物學(xué)》(Chem Biol.)1997；4569-78非專利對(duì)比文件17Dervan《生物有機(jī)藥物化學(xué)》(BioorgMed Chem.)2001；92215-35非專利對(duì)比文件18White等《自然》(Nature)1998；391468-71非專利對(duì)比文件19Gottesfeld等《自然》(Nature)1997；387202-5非專利對(duì)比文件20Dickinson等《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc Natl Acad Sci USA.)1998；9512890-5非專利對(duì)比文件21Lee等《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(ProcNatl Acad Sci USA.)1996；932570-5非專利對(duì)比文件22Dickinson等《生物化學(xué)》(Biochemistry.)1999；3810801-7非專利對(duì)比文件23Mapp等《美國國家科學(xué)院院報(bào)》(Proc Natl Acad Sci USA.)2000；973930-5

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題使用反義寡脫氧核苷酸和核酶的上述方法存在靶序列受限、反義寡核苷酸和核酶轉(zhuǎn)入組織和細(xì)胞無效和它們易于被核糖核酸酶降解的問題。迄今為止，尚沒有有關(guān)使用結(jié)合hTGF-β基因堿基序列的TGF-β基因表達(dá)抑制劑或與TGF-β相關(guān)的疾病的治療藥物的報(bào)導(dǎo)。
解決問題的方式本發(fā)明者努力嘗試研發(fā)通過特異性結(jié)合人TGF-β啟動(dòng)子特定區(qū)抑制人TGF-β基因表達(dá)的吡咯-咪唑聚酰胺類并研究其藥理作用。為了獲得可以抑制人轉(zhuǎn)化生長因子-β1(hTGF-β1)基因表達(dá)并且還可以用作治療藥物的化合物，本發(fā)明者已經(jīng)研究了靶向hTGF-β1啟動(dòng)子的不同片段的聚酰胺類，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)合與脂肪-特異性元件2(FSE2)序列相鄰的hTGF-β1啟動(dòng)子從-557到-536的堿基對(duì)序列的化合物顯著抑制hTGF-β1啟動(dòng)子的活性并且減量調(diào)節(jié)培養(yǎng)的人血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中hTGF-β1基因的表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下所述。
(1)TGF-β基因表達(dá)抑制劑，包含吡咯-咪唑聚酰胺，該吡咯-咪唑聚酰胺含有N-甲基吡咯單元(下文也稱作Py)、N-甲基咪唑單元(下文也稱作Im)和γ-氨基丁酸酯單元，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺可以在雙螺旋區(qū)(下文稱作靶區(qū))的小溝中的γ-氨基丁酸酯單元處折疊成U-形構(gòu)象，其中所述的雙螺旋區(qū)包含下列人轉(zhuǎn)化生長因子β1(下文也稱作hTGF-β1)啟動(dòng)子中從-557到-536的堿基序列(SEQ ID NO1)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈TAAAGGAGAGCAATTCTTACAG其中Py/Im對(duì)相應(yīng)于C-G堿基對(duì)，Im/Py對(duì)相應(yīng)于G-C堿基對(duì)，并且Py/Py對(duì)相應(yīng)于A-T堿基對(duì)和T-A堿基對(duì)。
(2)(1)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，進(jìn)一步包含β-丙氨酸單元。
(3)(1)或(2)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的靶區(qū)為雙螺旋區(qū)，它包含如下hTGF-β1啟動(dòng)子中從-548到-537的堿基序列(SEQ ID NO2)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈GCAATTCTTACA。
(4)(3)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的靶區(qū)為雙螺旋區(qū)，它包含如下hTGF-β1啟動(dòng)子中從-544到-538的堿基序列(SEQ IDNO3)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈TTCTTAC。
(5)(1)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺由如下通式表示[通式1] (6)(5)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺的末端羧基形成酰胺。
(7)(6)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的酰胺為與N，N-二甲氨基丙胺形成的酰胺。
(8)(5)-(7)中任意一項(xiàng)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺與FITC(異硫氰酸熒光素)形成共軛物。
(9)由如下通式表示的吡咯-咪唑聚酰胺 本發(fā)明的效果按照本發(fā)明，可以獲得沒有如化療劑產(chǎn)生的副作用的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，因?yàn)榛虮磉_(dá)可以受到特異性抑制，并且沒有作為被核糖核酸酶降解的缺陷，因?yàn)樗且环N化合物。


附圖1表示用于本發(fā)明的合成Py-Im聚酰胺的結(jié)構(gòu)。
附圖2A表示合成Py-Im聚酰胺(化合物4b)的結(jié)構(gòu)。
附圖2B表示合成Py-Im聚酰胺(化合物4b)的TIC圖和電噴霧離子化質(zhì)譜。
附圖3表示聚酰胺-寡核苷酸復(fù)合物通過合成Py-Im聚酰胺與相應(yīng)雙鏈寡核苷酸結(jié)合的形成。通過T4多核苷酸，使用[γ-32P]-ATP標(biāo)記相應(yīng)于hTGF-β1啟動(dòng)子從-548到-537堿基對(duì)序列的雙鏈DNA(附圖1)并在37℃下和結(jié)合緩沖液中與錯(cuò)配聚酰胺(泳道0)或與增加量的聚酰胺(泳道1、2和3分別為1nM、2nM和4nM)一起培育15分鐘。將由此獲得的復(fù)合物在20％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳并通過放射自顯影術(shù)觀察。
附圖4表示FITC標(biāo)記的聚酰胺在10-9M濃度下培育2小時(shí)后保留在培養(yǎng)的hVSMC細(xì)胞核中。FITC標(biāo)記的聚酰胺可以在培養(yǎng)的hVSMC細(xì)胞核中保留48小時(shí)以上。將FITC標(biāo)記的聚酰胺以10-9M的濃度直接加入到培養(yǎng)基中并在熒光顯微鏡下觀察。
附圖5表示聚酰胺在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中抑制熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄。在30℃下將1微克質(zhì)粒在轉(zhuǎn)錄緩沖液中與8U的海拉細(xì)胞核提取物、3類各400mM的未標(biāo)記的核苷酸三磷酸(UTP、CTP、GTP)和25μMα-32P-ATP一起培育60分鐘。通過添加175μl的海拉提取物終止溶液終止反應(yīng)且然后進(jìn)行苯酚-氯仿-異戊醇提取和乙醇沉淀。將樣品重新懸浮于98％甲醛負(fù)荷染料中并在90℃下加熱10分鐘，此后上6％的7M脲-聚丙烯酰胺凝膠。干燥該凝膠并通過放射自顯影術(shù)觀察；附圖6表示聚酰胺抑制質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中熒光素酶基因的表達(dá)(pGL/TGF)。TPA促進(jìn)hTGF-β1啟動(dòng)子活性，聚酰胺(pol)降低hTGF-β1啟動(dòng)子活性，而錯(cuò)配的聚酰胺(Mis)不會(huì)降低該活性。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物試劑在滅菌培養(yǎng)基中將受到hTGF-β1啟動(dòng)子控制的1微克熒光素酶基因轉(zhuǎn)染6小時(shí)。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，將細(xì)胞在有(或沒有)聚酰胺或錯(cuò)配聚酰胺存在下的含有0.5％ CS的培養(yǎng)基中培育24小時(shí)，并且使用雙重?zé)晒馑孛?報(bào)道基因測定系統(tǒng)檢測熒光素酶活性。將100μL熒光素酶底物與20μL細(xì)胞提取物混合?；旌虾螅瑢⒃摲磻?yīng)混合物放入發(fā)光計(jì)(Turner Designs-Bioblock，Illkirch，F(xiàn)rance)，并且測定室溫下發(fā)射10秒的光。將PMA用作陽性對(duì)照。與對(duì)照組比較*P＜0.05。
附圖7表示聚酰胺抑制hTGFβ1 mRNA在hVSMC細(xì)胞中的表達(dá)。將10-9M聚酰胺加入到培養(yǎng)的hVSMC的培養(yǎng)基中并培育24小時(shí)。將用50ng/mL TPA處理用作陽性對(duì)照。從細(xì)胞中提取總RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生單鏈cDNA且如材料和方法部分中所述用hTGFβ1和18S rRNA的引物擴(kuò)增。(A)在1.5％瓊脂糖凝膠電泳上分離5微升PCR產(chǎn)物。(B)TPA刺激hTGFβ1 mRNA的表達(dá)。hTGFβ1 mRNA與18S rRNA之比在聚酰胺處理的組(pol)中顯著下降，而錯(cuò)配的聚酰胺(mis)對(duì)hTGFβ1的表達(dá)沒有任何作用。
附圖8表示聚酰胺對(duì)培養(yǎng)的hVSMC中hTGFβ1蛋白的作用。將10-9M聚酰胺加入到培養(yǎng)的hVSMC的培養(yǎng)基中并培育24小時(shí)。(A)通過蛋白質(zhì)印跡分析研究hTGFβ1蛋白的表達(dá)。(B)聚酰胺(pol)顯著抑制培養(yǎng)的hVSMC中的hTGFβ1蛋白，而錯(cuò)配的聚酰胺(mis)沒有這種作用。序列表自由正文SEQ ID NO4有義引物SEQ ID NO5反義引物SEQ ID NO6有義引物SEQ ID NO7反義引物本發(fā)明的最佳實(shí)施方式在本發(fā)明涉及的吡咯-咪唑聚酰胺中，N-甲基吡咯單元(下文也稱作Py)、N-甲基咪唑單元(下文也稱作Im)和γ-氨基丁酸酯單元(也稱作γ連接基)彼此通過酰胺鍵(-C(＝O)-NH-)結(jié)合，并且吡咯-咪唑聚酰胺的一般結(jié)構(gòu)和制備方法為公知的(專利對(duì)比文件1-3)。
例如，易于通過自動(dòng)化合成儀，使用固相上的Fmoc(9-芴基甲氧羰基)(固相Fmoc法)合成吡咯-咪唑聚酰胺類(專利對(duì)比文件3)。由于可使用固相Fmoc法以從在末端上帶有羧酸殘基的固相載體上切下吡咯-咪唑聚酰胺類，所以可以通過在分子末端引入不同官能團(tuán)生產(chǎn)吡咯-咪唑聚酰胺類的衍生物。如果必要，可以引入具有DNA烷基化活性的化合物，例如duocarmycin、吡咯并苯二氮雜、博來霉素、烯二炔類化合物、氮芥、其衍生物等。由于固相Fmoc法因使用商購蛋白質(zhì)(肽)合成儀而自動(dòng)化，所以可以合成與帶有吡咯-咪唑聚酰胺類的天然或非天然蛋白質(zhì)的共軛物。此外，由于在Fmoc法中的反應(yīng)條件比在t-BOC法中溫和，所以能夠引入非蛋白質(zhì)的有機(jī)化合物(包括帶有在酸性條件下不穩(wěn)定的官能團(tuán)的化合物)。例如，可以通過自動(dòng)方式合成吡咯-咪唑聚酰胺類與DNA或RNA的共軛物(或其衍生物)。
可以按照上述公知的Fmoc法等合成帶有末端羧基的吡咯-咪唑聚酰胺類。具體實(shí)例包括在末端上帶有β-丙氨酸殘基(β-氨基丙酸酯殘基)和γ-氨基丁酸酯殘基的吡咯-咪唑聚酰胺類。例如，可以通過固相Fmoc法，使用帶有固相載體的肽合成儀合成在末端上帶有β-丙氨酸殘基和γ-氨基丁酸酯殘基的吡咯-咪唑聚酰胺類，所述的固相載體可以固定氨基吡咯甲酸、氨基咪唑甲酸、β-丙氨酸或γ-氨基丁酸酯，它們中每一種的氨基被Fmoc保護(hù)。
氨基吡咯甲酸的具體實(shí)例包括例如4-氨基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-甲基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-乙基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-丙基-2-吡咯甲酸、4-氨基-1-丁基-2-吡咯甲酸等。氨基咪唑甲酸的具體實(shí)例包括例如4-氨基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-甲基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-乙基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-丙基-2-咪唑甲酸、4-氨基-1-丁基-2-咪唑甲酸等。
例如，可以通過固相Fmoc法合成吡咯-咪唑聚酰胺和FITC(異硫氰酸熒光素)的共軛物。由于已知FITC為熒光標(biāo)記試劑，所以可以將獲得的共軛物用于證實(shí)吡咯-咪唑聚酰胺識(shí)別特異性DNA。
本發(fā)明的TGF-β基因表達(dá)抑制劑包含含有N-甲基吡咯單元(Py)、N-甲基咪唑單元(Im)和γ-氨基丁酸酯單元的吡咯-咪唑聚酰胺，該吡咯-咪唑聚酰胺可以在上述雙螺旋區(qū)(下文稱作靶區(qū))的小溝中的γ-氨基丁酸酯單元處折疊成U-形構(gòu)象，其中所述的雙螺旋區(qū)包含hTGF-β1啟動(dòng)子中從-557到-536的序列(SEQ ID NO1)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈，其中Py/Im對(duì)相應(yīng)于C-G堿基對(duì)，Im/Py對(duì)相應(yīng)于G-C堿基對(duì)，并且Py/Py對(duì)相應(yīng)于A-T堿基對(duì)和T-A堿基對(duì)。
一般來說，DNA螺旋骨架形成2種溝。寬和深溝稱作大溝，而窄和淺溝稱作小溝。上述吡咯-咪唑聚酰胺可以通過非共軛鍵與由特異性堿基對(duì)形成的具有高度親和性和特異性的小溝結(jié)合。吡咯-咪唑聚酰胺的Py/Im對(duì)、Im/Py對(duì)和Py/Py對(duì)分別結(jié)合小溝的相應(yīng)C-G堿基對(duì)、G-C堿基對(duì)和A-T和T-A堿基對(duì)。并且吡咯-咪唑聚酰胺的分子在γ-氨基丁酸酯單元的位置上折疊成U-形構(gòu)象。
當(dāng)小溝中的堿基對(duì)與吡咯-咪唑聚酰胺的Py和Im對(duì)不相應(yīng)時(shí)，吡咯-咪唑聚酰胺與小溝的結(jié)合不足。在本說明書中，與如上所述的小溝堿基對(duì)不相應(yīng)的吡咯-咪唑聚酰胺稱作錯(cuò)配物或錯(cuò)配的聚酰胺。
根據(jù)體外研究，Py-Im聚酰胺類為一般或組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的有效抑制劑或激活劑(非專利對(duì)比文件19-23)。果蠅屬有時(shí)獲得了功能表型或在有特定聚酰胺存在下失去它而沒有特定的毒性。這就是聚酰胺對(duì)基因表達(dá)特異性控制的結(jié)果(Janssen等《分子細(xì)胞》(MolCell.)2000；61013-24；Janssen等《分子細(xì)胞》(Mol Cell.)2000；6999-1011)。本發(fā)明者合成了靶向hTGF-β1啟動(dòng)子的特異性片段的Py-Im聚酰胺類。正如附圖4中確切表示的，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Py-Im聚酰胺類自發(fā)通過細(xì)胞膜，并且在將Py-Im聚酰胺加入到hVSMC培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中時(shí)，它以高濃度在細(xì)胞核中蓄積。這些聚酰胺類在細(xì)胞核中穩(wěn)定地保留48小時(shí)或48小時(shí)以上，而沒有特定的丟失。與上述反義寡核苷酸和核酶相比(Hu WY，F(xiàn)ukuda N，Nakayama M，Kishioka H，Kanmatsuse K.“靶向大鼠血小板衍生生長因子A-鏈mRNA的DNA-RNA嵌合型錘頭核酶抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖”(Inhibition of vascularsmooth muscle cell proliferation by DNA-DNA chimeric hammerheadribozyme targeting to rat platelet-derived growth factorA-chain mRNA.)-《高血壓雜志》(J Hypertens.)2001；19203-12；Teng J，F(xiàn)ukuda N，Hu WY，Nakayama M，Kishioka H，Kanmatsuse K.“與轉(zhuǎn)化生長因子-βmRNA的DNA-RNA嵌合型錘頭核酶抑制來自自發(fā)性高血壓型大鼠的血管平滑肌細(xì)胞過度生長”(DNA-RNA chimerichammerhead ribozyme to transforming growth factor-betal mRNAinhibits the exaggerated growth of vascular smooth muscle cellsfrom spontaneously hypertensive rats.)-《心血管研究》(Cardiovasc Res.)2000；48138-47)，聚酰胺類在培養(yǎng)的hVSMC中表現(xiàn)出優(yōu)良的滲透性(在低濃度下，不需要轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基)和較高的穩(wěn)定性。聚酰胺類的高滲透性和穩(wěn)定性可以對(duì)真核細(xì)胞核提供理想的藥物遞送以用于基因療法。
迄今為止，Py-Im聚酰胺類的研發(fā)基于啟動(dòng)子序列中的轉(zhuǎn)錄因子-DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征。靶向含有啟動(dòng)子的TATA框中的序列的最有效方式在于靶向與TATA框相鄰的堿基對(duì)序列的設(shè)計(jì)。在編碼大部分蛋白質(zhì)的基因中，TATA框位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的25-35堿基對(duì)。轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子D(TAFIID)包括TATA框結(jié)合蛋白(TBP)，該蛋白特異性結(jié)合TATA框并形成獲得了核心啟動(dòng)子中的其它轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子的前起始復(fù)合物(PIC)。PIC通過與激活劑或抑制劑發(fā)生相互作用啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄并控制基因表達(dá)。由于TBP還結(jié)合雙螺旋DNA的小溝(Lee等《細(xì)胞》(Cell.)1991，12月20日；67(6)1241-50；Starr等《細(xì)胞》(Cell.)1991；671231-40；Courey等《細(xì)胞》(Cell.)1988；55887-98.)，合成的聚酰胺競爭性地占據(jù)了TATA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)并干擾基因的轉(zhuǎn)錄。已知在基于不同啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的聚酰胺類中，靶向TATA框的任意一種始終是成功的(非專利對(duì)比文件20、21)。
存在既不帶有TATA框，也不帶有啟動(dòng)區(qū)(Inr)的啟動(dòng)子類型(Javahery等《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol Cell Biol.)1994；14116-27；Lo等《基因》(Gene.)1996，12月5日；182(1-2)13-22；Romeo等《基因》(Gene.)1997；189289-95.)。看起來存在高度特異性地高度表達(dá)的基因啟動(dòng)子可能帶有TATA框，而管家基因的啟動(dòng)子缺乏它的趨向。對(duì)以低水平表達(dá)的基因或那些在生長期過程中需要嚴(yán)格減量調(diào)節(jié)的基因而言可能需要沒有TATA框的啟動(dòng)子，而對(duì)這些啟動(dòng)子的機(jī)理仍然有待研究。hTGF-β1的啟動(dòng)子屬于這類啟動(dòng)子且含有許多轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)不同上游區(qū)中的正序列和負(fù)序列(Kim等《生物化學(xué)雜志》(J Biol Chem.)1989；264402-8.)。幾種SP-1和兩種AP-1序列與轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相鄰存在。由于各種病毒和細(xì)胞啟動(dòng)子被SP-1蛋白活化，所以看起來僅一種SP-1序列對(duì)受到SP-1刺激的啟動(dòng)子而言是足夠的(Kadonaga等《細(xì)胞》(Cell.)1987；511079-90；Courey等《細(xì)胞》(Cell.)1988；55887-98.)。AP-1序列對(duì)由Jun同型二聚體或Fos/Jun雜二聚體復(fù)合物組成的AP-1轉(zhuǎn)錄因子起反應(yīng)。幾種物質(zhì)，諸如TPA、v-src基因產(chǎn)物和hTGF-β1自身通過AP-1序列刺激hTGF-β1表達(dá)(Kim等《生物化學(xué)雜志》(J Biol Chem.)1989；2647041-5；Kim等《生物化學(xué)雜志》(J Biol Chem.)1989；26419373-8.Kim等《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol Cell Biol.)1990；101492-7；Birchenall-Roberts等《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol Cell Biol.)1990；104978-83.)。
推定SP-1和/或AP-1的序列介導(dǎo)hTGF-β1基因表達(dá)活化。設(shè)計(jì)重要的聚酰胺類以便靶向與AP-1和SP-1的不同序列相鄰的堿基對(duì)，從而阻斷反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。然而，沒有數(shù)據(jù)足以證實(shí)這些聚酰胺類是抑制，還是活化hTGF-β1啟動(dòng)子。這些結(jié)果可能是因設(shè)計(jì)的聚酰胺類在DNA等的小溝中占據(jù)的位點(diǎn)不合適所致。本發(fā)明者已經(jīng)將靶序列擴(kuò)展至hTGF-β1啟動(dòng)子的上游。聚酰胺類之一靶向hTGF-β1啟動(dòng)子從-544到-538的堿基對(duì)序列，并且證實(shí)它在體外抑制啟動(dòng)子活性(附圖5-7)并抑制hVSMC培養(yǎng)物中的hTGF-β1 mRNA和蛋白(附圖7、8)。hTGF-β1啟動(dòng)子從-544到-538的堿基對(duì)序列與脂肪-特異性元件2(FSE2)序列相鄰定位(附圖1)。FSE2表示對(duì)前脂肪細(xì)胞中脂肪細(xì)胞P2(aP2)基因表達(dá)的抑制活性，并且前脂肪細(xì)胞含有多于脂肪細(xì)胞的FES2序列結(jié)合蛋白(Kadonaga等《細(xì)胞》(Cell.)1987；511079-90；Courey等《細(xì)胞》(Cell.)1988；55887-98.)。已經(jīng)從含有TATA框的核心啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了抑制轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄阻抑物，但在不含TATA的啟動(dòng)子中未發(fā)現(xiàn)(Aso等《歐洲分子生物學(xué)協(xié)會(huì)雜志》(EMBO J.)1994；13435-45；Mack等《自然》(Nature.)1993；363281-3；Merino等《自然》(Nature.)1993；365227-32.)。認(rèn)為這些轉(zhuǎn)錄阻抑物干擾TBP-TATA相互作用且然后抑制基因轉(zhuǎn)錄。與阻抑物相關(guān)的這些數(shù)據(jù)的組合提示了如下推定脂肪細(xì)胞中FSE-2序列的抑制功能由TATA框介導(dǎo)。由于hTGF-β1啟動(dòng)子不含TATA框，認(rèn)為FSE2序列在hTGF-β1中的功能與aP2基因的功能不同。由于哺乳動(dòng)物的幾乎所有基因的表達(dá)非常傾向依賴于與啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列結(jié)合的大量蛋白質(zhì)的作用的組合，解釋本發(fā)明結(jié)果的最簡單的模型在于本發(fā)明的吡咯-咪唑聚酰胺阻斷FSE2序列區(qū)中轉(zhuǎn)錄因子和DNA的相互作用并且表現(xiàn)出對(duì)hTGF-β1啟動(dòng)子活性的抑制作用。
除啟動(dòng)子區(qū)中非轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)作用外，存在其它因子也可能影響基因表達(dá)的可能性。這些因子包括染色質(zhì)包裝、聚腺苷酸化、剪接、mRNA穩(wěn)定性、翻譯啟動(dòng)等(Berger等《分子細(xì)胞》(Mol Cell.)2001；5263-8；McKeown《細(xì)胞生物學(xué)年鑒》(Annu Rev Cell Biol.)1992；8133-55；Decker等《生物化學(xué)科學(xué)趨勢》(Trends Biochem Sci.)1994；19336-40；Kozak《細(xì)胞生物學(xué)年鑒》(Annu Rev CellBiol.)1992；8197-225.)。看起來存在合成的聚酰胺因核小體定位而可以接近靶位點(diǎn)并且通過靶向特異性序列對(duì)染色質(zhì)凝聚/解凝結(jié)構(gòu)起作用的可能性(Gottesfeld等《分子生物學(xué)雜志》(J Mol Biol.)2002；321249-63；Gottesfeld等《分子生物學(xué)雜志》(J Mol Biol.)2001；309615-29.)。已經(jīng)證實(shí)吡咯-咪唑聚酰胺開放了能夠使GAF結(jié)合成為可能的異染色質(zhì)褐色衛(wèi)星，且作為結(jié)果，導(dǎo)致黑腹果蠅中的表型改變。由于吡咯-咪唑聚酰胺類易于合成且設(shè)計(jì)成用于靶向關(guān)注的序列，所以它們用于研究基因組功能，并且最終用于基因療法，諸如抑制和活化hTGF-β1基因。
可以在遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始區(qū)的上游設(shè)計(jì)本發(fā)明的Py-Im聚酰胺且它們表現(xiàn)出對(duì)hTGF-β1基因表達(dá)的抑制作用。
具體實(shí)施例方式
I.材料和方法(1)相應(yīng)于hTGF-β1啟動(dòng)子的Py-Im聚酰胺的設(shè)計(jì)附圖1表示生產(chǎn)用于本實(shí)驗(yàn)的化合物及其錯(cuò)配化合物(下文還簡稱為錯(cuò)配物)的方案。設(shè)計(jì)Py-Im聚酰胺以使其結(jié)合與脂肪-特異性元件2(FSE2)相鄰的hTGF-β1啟動(dòng)子從-544到-538的堿基對(duì)。
(2)使用Fmoc法的Py-Im聚酰胺類的機(jī)器輔助的自動(dòng)化合成使用恒流肽合成儀Pioneer(Trademark)(Applied Biosystems，Inc.)進(jìn)行0.1mmol等級(jí)的吡咯-咪唑聚酰胺類的機(jī)器輔助的自動(dòng)化合成(200mg的Fmoc-β-丙氨酸-CLEAR酸性樹脂，0.50meq/g，PeptideInstitute，Inc.)。自動(dòng)化固相合成包括下列步驟用DMF洗滌；用20％哌啶/DMF除去Fmoc基團(tuán)；用甲醇洗滌；在有HATU和DIEA(各4當(dāng)量)存在下與單體偶聯(lián)60分鐘；用甲醇洗滌；如果必要，用無水乙酸/吡啶保護(hù)；和最終用DMF洗滌。一般獲得中等產(chǎn)率的Py-Im聚酰胺類(10-30％)。
FITC偶聯(lián)使溶于DMF的四(4)倍過量的熒光素(0.40mmol)和DIEA(不含HATU)過柱并閃蒸60分鐘。
一般操作在用Fmoc-β-丙氨酸-Wang樹脂除去Fmoc基團(tuán)后，用甲醇連續(xù)洗滌該樹脂。使用Fmoc氨基酸進(jìn)行偶聯(lián)步驟且然后用甲醇進(jìn)行洗滌。將這些步驟重復(fù)多次，直到引入所有序列。在完成偶聯(lián)步驟后，保護(hù)N末端上的氨基酸或如果必要使其與FITC偶聯(lián)，用DMF進(jìn)行洗滌并移除反應(yīng)容器。
作為羧酸的降解通過在降解步驟后用冷乙醚沉淀分離合成的聚酰胺類(91％ TFA-3％/TIS-3％ DMS-3％水混合物，5ml/樹脂0.1mmol)。
作為胺的降解通過在降解步驟后用冷乙醚沉淀分離合成的聚酰胺類(N，N-二甲氨基丙胺5ml/樹脂0.1mmol，50℃，過夜)。
純化使用分析型RP-HPLC進(jìn)行最終純化，流速為10ml/分鐘，在緩沖液A(0.1％ AcOH/水)中的B(乙腈)的線性梯度，在350nm處使用UV檢測。
在如下的化合物4a和4b中，I、P、β、γ、Dp和Ac分別表示N-甲基咪唑殘基、N-甲基吡咯殘基、β-丙氨酸殘基、γ-氨基丁酸酯殘基、N，N-二甲氨基丙胺和?；?。
a)FITC-β-IPP-β-IPP-γ-PPP-β-PP-βDp(化合物4a)梯度緩沖液B 15％-45％(30分鐘)，流速10ml/分鐘。產(chǎn)率7mg(3％)。
b)Ac-IPP-β-IPP-γ-PPP-β-PP-βCOOH(化合物4b)梯度緩沖液B 25％-35％(30分鐘，60℃)，流速10ml/分鐘。產(chǎn)率29mg(17％)。
附圖2A及其TIC(總離子色譜圖)圖中顯示了Py-Im聚酰胺(化合物4b)的結(jié)構(gòu)且附圖2B中顯示了電噴射離子化質(zhì)譜。作為錯(cuò)配物，使用具有Ac-PPP-β-IPP-γ-PPP-β-COOH結(jié)構(gòu)的聚酰胺，它為上述化合物4b，其中與?；噜彽腎被P取代。
(3)hVSMC細(xì)胞培養(yǎng)hVSMC獲自Clonetics(Walkersville，MD)。在含有10％牛血清(Gibco Life Technologies，Gaithersburg，MD)、100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)hVSMC。通過用在不含Ca2+和不含Mg2+的磷酸緩沖鹽水(PBS)中的0.05％胰蛋白酶(Gibco)進(jìn)行胰蛋白酶處理使細(xì)胞傳代并且在75-cm2組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。將培養(yǎng)基每隔4或5天更換一次，并且在5-10代過程中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
(4)在培養(yǎng)的hVSMC中FITC-標(biāo)記的聚酰胺類的培育以105/cm2的密度將傳代的hVSMC在24-孔瓶中培養(yǎng)24小時(shí)。以10-9M的濃度將FITC-標(biāo)記的聚酰胺類直接加入到培養(yǎng)基中并且在熒光顯微鏡下每隔1小時(shí)觀察一次。
(5)凝膠移動(dòng)檢測合成寡核苷酸，退火并生產(chǎn)相應(yīng)于hTGF-β1啟動(dòng)子從-548到-537的堿基對(duì)的12種雙鏈寡核苷酸(附圖1A)。使用[γ-32P]-ATP，應(yīng)用T4多核苷酸激酶標(biāo)記雙鏈DNAs，并且在37℃下和在結(jié)合緩沖液(40mMTris，pH 7.9，250mM NaCl，25mM EDTA，25mM DTT，100mM KCl)中與聚酰胺類或錯(cuò)配的聚酰胺類一起培育15分鐘。通過20％聚丙烯酰胺凝膠對(duì)由此獲得的復(fù)合物進(jìn)行電泳并通過放射自顯影術(shù)觀察。
(6)在hTGF-β1啟動(dòng)子控制下的熒光素酶基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建分離含有來源于質(zhì)粒phTBG 101(非專利對(duì)比文件10)的hTGF-β1啟動(dòng)子的2.2kb片段并插入熒光素酶報(bào)道基因編碼區(qū)上游處的pGL3堿性質(zhì)粒(Promega，Madison，WI)。通過光譜分析與限制酶分析并測序鑒定構(gòu)建質(zhì)粒的精確結(jié)構(gòu)。
(7)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用海拉細(xì)胞的細(xì)胞核提取物和體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。25微升的反應(yīng)混合物由100ng DNA模板、8U海拉細(xì)胞核提取物、各400μM的3種未標(biāo)記的核苷酸三磷酸(UTP、CTP、GTP)、25μM γ-32P-ATP(5ci/mmol，NEM Life ScienceProducts)、含有20mM羥乙基哌啶基(piperadinyl)乙磺酸(HEPES)、100mM KCl、4.0mM MgCl2、20％甘油、0.2mM EDTA和0.6mM苯甲基磺酰氟的轉(zhuǎn)錄緩沖液(pH 7.9)組成。用SphI(New Engl and BioLabs，Beverly，MA)切割轉(zhuǎn)錄用模板DNA。在30℃下將轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物培育60分鐘后，通過添加175μM海拉提取物終止溶液(0.3M Tris-HCl，pH7.0，0.3M乙酸鈉，0.5％ SDS，2.0mM EDTA，3μg/ml tRNA)終止反應(yīng)且然后用苯酚-氯仿-異戊醇進(jìn)行提取并且用乙醇進(jìn)行沉淀。將樣品重新懸浮于98％甲醛上樣染料中并在90℃下加熱10分鐘后在7M脲6％聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳。干燥凝膠并通過放射自顯影術(shù)觀察帶。
(8)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和熒光素酶檢測在有10％ CS存在下在24孔平板中以10-5/cm2的密度培養(yǎng)hVSMC細(xì)胞。24小時(shí)后，按照制造商指定的方法，在滅菌培養(yǎng)基中1μg DNA存在下使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染物試劑(GibcoBRL)轉(zhuǎn)染hTGF-β1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)道基因。將細(xì)胞與DNA脂質(zhì)體復(fù)合物一起培育6小時(shí)且然后將培養(yǎng)基更換成1ml新鮮的完全培養(yǎng)基。在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，在有或沒有聚酰胺或錯(cuò)配聚酰胺存在下的含有0.5％ CS的培養(yǎng)基中將細(xì)胞培育24小時(shí)。在處理結(jié)束時(shí)，除去培養(yǎng)基并刮取細(xì)胞且懸浮于150μl被動(dòng)裂解緩沖液中。在簡短離心后，使用雙重-熒光素酶報(bào)道基因測定系統(tǒng)(Promega，Madison，WI)測定細(xì)胞提取物中的熒光素酶活性。將100微升熒光素酶底物加入到20μl提取物中?；旌虾螅瑢⒃摲磻?yīng)混合物放入發(fā)光計(jì)(Turner Designs-Bioblock，Illkirch，F(xiàn)rance)，并且測定室溫下發(fā)射10秒的光。
(9)用于生長因子mRNA的RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試驗(yàn)用PBS洗滌培養(yǎng)的細(xì)胞，溶于800μL RNAzolB(BiotexLaboratories，Inc.，Houston，TX)，與80μL氯仿混合并離心。將無色的上部水相與等體積的異丙醇混合以沉淀RNA。用500μL的75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次，并且在干燥后溶于10μL TE緩沖液。在65℃下變性15分鐘后，在室溫下用在0.5ml DNA酶緩沖液(20mM Tris-HClpH 8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl2)中的0.5U DNA酶(Gibco)將RNA樣品處理45分鐘。通過添加0.5ml 0.5M EDTA并在98℃下加熱10分鐘使DNA酶變性。
使用在10mM Tris-HCl(pH 8.3)，5mM MgCl2，50mM KCl，1mM脫氧NTPs和2.5μM隨機(jī)六聚物中的2.5U/20μL鳥類成髓細(xì)胞白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Takara Biochemicals，Osaka，Japan)對(duì)等量的RNA等分試樣(1μg/20μL)逆轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNAs。通過與10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、4mM MgCl2、0.025U/μL Taq DNA聚合酶(TakaraBiochemicals，Osaka，Japan)和各0.2μM上游有義引物和下游反義引物混合將2微升稀釋的cDNA產(chǎn)物制成25μl。將有義引物(5′-ATCAGAGCTCCGAGAAGCGGTACC-3′)(SEQ ID NO4)和反義引物(5′-GTCCACTTGCAGTGTTATCCTG-3′)(SEQ ID NO5)用于hTGF-β1 mRNA的PCR擴(kuò)增。就人18S核糖體RNA而言，將有義引物(5′-TCAAGAACGAAAGTCGGACG-3′)(SEQ ID NO6)和反義引物(5′-GGACATCTAAGGGCATCACA-3′)(SEQ ID NO7)用作內(nèi)部對(duì)照。使用自動(dòng)熱調(diào)節(jié)器(Perkin Elmer，F(xiàn)oster，CA)進(jìn)行PCR。PCR條件為起始變性，在94℃下2分鐘；在94℃下變性1分鐘、在58℃下退火1分鐘和在72℃下延伸1分鐘的30個(gè)循環(huán)；在72℃下1分鐘的最終延伸。作為內(nèi)部對(duì)照，在每次反應(yīng)中均包括使用用于18S rRNA的引物的PCR。為了證實(shí)通過PCR無法擴(kuò)增基因組DNA，不使用逆轉(zhuǎn)錄酶且使用引物組進(jìn)行對(duì)照RT-PCR實(shí)驗(yàn)。在任意反應(yīng)中，均沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。為了對(duì)mRNA的半定量分析，監(jiān)測PCR的動(dòng)力學(xué)特性。在各種樣品中比較在凝膠上可檢測到PCR產(chǎn)物的循環(huán)次數(shù)。擴(kuò)增連續(xù)稀釋10-倍(100、10和1ng)的cDNA樣品。通過增加cDNA的量，PCR產(chǎn)物在早期循環(huán)時(shí)可檢測到。相應(yīng)于各靶mRNA的PCR產(chǎn)物的量在20-35個(gè)循環(huán)時(shí)均呈線性增加。在1.5％瓊脂糖凝膠上通過電泳分離5微摩爾(μM)PCR產(chǎn)物。通過使用NIH軟件的計(jì)算機(jī)分析測定帶的強(qiáng)度。
(10)細(xì)胞制備和蛋白質(zhì)印跡分析將試驗(yàn)VSMC和對(duì)照VSMC在6-孔平板中培育24小時(shí)，用PBS洗滌兩次并在300μL裂解緩沖液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟，1μg/mL抑肽酶，1％ Triton X-100)中培育30分鐘。將細(xì)胞刮入1.5mL試管并離心且收集上清液。通過Bradford蛋白質(zhì)試驗(yàn)，使用BIO-RAD蛋白質(zhì)測定試劑盒(Bio-Rad Lab，Hercules，CA)測定上清液中的蛋白質(zhì)含量。上清液含有20μg總蛋白質(zhì)，使其在100℃下和加樣緩沖液中變性3分鐘，在10％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜上。將該膜在室溫下與對(duì)hTGF-β1具有特異性的小鼠單克隆抗體(1∶500)(R&D systems，Minneapolis，MN)一起培育且然后在室溫下與按1∶2000的抗-小鼠HRP綴合次級(jí)抗體一起培育1小時(shí)。在充分洗滌后，將膜與電化學(xué)發(fā)光底物(Amersham Life Service，Buckinghamshire，UK)一起培育并暴露在X-光片中。
(11)統(tǒng)計(jì)分析將結(jié)果表示為平均值±SEM。通過斯氏t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)平均值中差異的顯著性。將P＜0.05視為顯著性。
II.結(jié)果(1)合成聚酰胺與雙鏈寡核苷酸的結(jié)合首先檢查合成的Py-Im聚酰胺類(化合物4a和4b)是否可以結(jié)合相應(yīng)的堿基對(duì)。聚酰胺類中的任一種能夠結(jié)合相應(yīng)的12個(gè)堿基對(duì)的雙鏈寡核苷酸(附圖3，泳道2-4)，而錯(cuò)配聚酰胺無法結(jié)合這些寡核苷酸(附圖3，泳道1)。
(2)合成聚酰胺通過細(xì)胞膜的滲透性和引入細(xì)胞核為了證實(shí)將合成化合物引入細(xì)胞核并使其在穩(wěn)定條件下保留在活細(xì)胞中，用FITC標(biāo)記Py-Im聚酰胺類。當(dāng)以10-9M的濃度在培養(yǎng)基中將FITC標(biāo)記的聚酰胺類培育2小時(shí)時(shí)，在以高密度培養(yǎng)的hVSMC的細(xì)胞核中檢測到了這種FITC(附圖4)。FITC標(biāo)記的聚酰胺在細(xì)胞核中的這種高度蓄積是因基因組中的非特異性結(jié)合所致，并且這種化合物在細(xì)胞質(zhì)中的濃度極低。
(3)合成聚酰胺類對(duì)hTGF-β1啟動(dòng)子活性的抑制體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)在有海拉細(xì)胞核提取物和hTGF-β1啟動(dòng)子存在下轉(zhuǎn)錄DNA密碼。由于合成的聚酰胺類(pol)結(jié)合hTGF-β1啟動(dòng)子從-544到-538的堿基對(duì)，所以它們減少轉(zhuǎn)錄。另一方面，錯(cuò)配聚酰胺(Mis)不會(huì)表現(xiàn)出對(duì)轉(zhuǎn)錄分子形成的任何顯著作用(附圖5)。
在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，hTGF-β1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)編碼熒光素酶的報(bào)道基因且該基因在培養(yǎng)的hVSMC中得到表達(dá)。12-O-十四?；?佛波醇-13-乙酰轉(zhuǎn)移酶(TPA)刺激熒光素酶蛋白的表達(dá)。與10-9M聚酰胺一起培育顯著減量調(diào)節(jié)了熒光素酶的表達(dá)，而錯(cuò)配的聚酰胺對(duì)熒光素酶基因的表達(dá)沒有影響(附圖6)。
(4)合成聚酰胺類對(duì)hVSMC中hTGF-β1 mRNA的抑制為了觀察體內(nèi)聚酰胺對(duì)hTGF-β1基因表達(dá)的作用，將培養(yǎng)的hVSMC與10-9M聚酰胺一起培育24小時(shí)。使用RT-PCR法分析hTGF-β1 mRNA。將TPA用作陽性對(duì)照。50ng/mL的TPA顯著刺激hTGF-β1 mRNA的表達(dá)。本發(fā)明的聚酰胺(pol)抑制TPA誘導(dǎo)的hTGF-β1 mRNA的表達(dá)，而錯(cuò)配的聚酰胺(Mis)沒有這種作用(附圖7)。
(5)合成聚酰胺對(duì)hVSMC中hTGF-β1蛋白表達(dá)的作用本發(fā)明者檢查了合成的聚酰胺(pol)對(duì)hVSMC中hTGF-β1表達(dá)的作用。10-9M合成的聚酰胺抑制培育24小時(shí)后hTGF-β1蛋白的表達(dá)，而錯(cuò)配的聚酰胺(Mis)沒有這種作用(附圖8)。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明的TGF-β基因表達(dá)抑制劑用作與TGF-β產(chǎn)生相關(guān)的疾病的治療藥物。
序列表中的自由正文SEQ ID NO4有義引物SEQ ID NO5反義引物SEQ ID NO6有義引物SEQ ID NO7反義引物序列表序列表<110>NIHON UNIVERSITY<120>TGF-β活性控制劑<130>W1799<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>22<212>DNA<213>人類<400>1taaaggagag caattcttac ag 22<210>2<211>12<212>DNA<213>人類<400>2gcaattctta ca 12<210>3<211>7<212>DNA<213>人類<400>3ttcttac7<210>4<211>24<212>DNA<213>人工
<220>
<223>有義引物<400>4atcagagctc cgagaagcgg tacc 24<210>5<211>22<212>DNA<213>人工<220>
<223>反義引物<400>5gtccacttgc agtgttatcc tg 22<210>6<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>有義引物<400>6tcaagaacga aagtcggacg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工<220>
<223>反義引物<400>7ggacatctaa gggcatcaca 20<210>8
<211>37<212>DNA<213>人類<400>8cagtaaagga gagcaattct tacaggtgtc tgcctcc 37<210>9<211>37<212>DNA<213>人類<400>9ggaggcagac acctgtaaga attgctctcc tttactg 3權(quán)利要求
1.TGF-β基因表達(dá)抑制劑，包含吡咯-咪唑聚酰胺，該吡咯-咪唑聚酰胺含有N-甲基吡咯單元(下文也稱作Py)、N-甲基咪唑單元(下文也稱作Im)和γ-氨基丁酸酯單元，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺可以在雙螺旋區(qū)(下文稱作靶區(qū))的小溝中的γ-氨基丁酸酯單元處折疊成U-形構(gòu)象，其中所述的雙螺旋區(qū)包含下列人轉(zhuǎn)化生長因子β1(下文也稱作hTGF-β1)啟動(dòng)子中從-557到-536的堿基序列(SEQ ID NO1)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈TAAAGGAGAGCAATTCTTACAG其中Py/Im對(duì)相應(yīng)于C-G堿基對(duì)，Im/Py對(duì)相應(yīng)于G-C堿基對(duì)，并且Py/Py對(duì)相應(yīng)于A-T堿基對(duì)和T-A堿基對(duì)。
2.權(quán)利要求1所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，進(jìn)一步包含β-丙氨酸單元。
3.權(quán)利要求1或2所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的靶區(qū)為雙螺旋區(qū)，它包含如下hTGF-β1啟動(dòng)子中從-548到-537的堿基序列(SEQ ID NO2)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈GCAATTCTTACA。
4.權(quán)利要求3所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的靶區(qū)為雙螺旋區(qū)，它包含如下hTGF-β1啟動(dòng)子中從-544到-538的堿基序列(SEQ ID NO3)的部分或全部及其互補(bǔ)鏈TTCTTAC。
5.權(quán)利要求1所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺由如下通式表示[通式1]
6.權(quán)利要求5所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺的末端羧基形成酰胺。
7.權(quán)利要求6所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的酰胺為與N，N-二甲氨基丙胺形成的酰胺。
8.權(quán)利要求5-7中任意一項(xiàng)所述的TGF-β基因表達(dá)抑制劑，其中所述的吡咯-咪唑聚酰胺與FITC(異硫氰酸熒光素)形成共軛物。
9.由如下通式表示的吡咯-咪唑聚酰胺[通式2]
全文摘要
TGF－β基因表達(dá)抑制劑，含有吡咯－咪唑聚酰胺，它帶有N－甲基吡咯單元(下文也稱作Py)、N－甲基咪唑單元(下文也稱作Im)和γ－氨基丁酸酯單元，該吡咯－咪唑聚酰胺可以在雙螺旋區(qū)(下文稱作靶區(qū))的小溝中的γ－氨基丁酸酯單元處折疊成U－形構(gòu)象，其中所述的雙螺旋區(qū)含有作為全部或部分的相應(yīng)于人轉(zhuǎn)化生長因子β1(下文也稱作hTGF－β1)啟動(dòng)子堿基序列中－557到－536上的序列的互補(bǔ)鏈TAAAGGAGAGCAATTCT－TACAG，其中Py/Im對(duì)相應(yīng)于C－G堿基對(duì)，Im/Py對(duì)相應(yīng)于G－C堿基對(duì)，并且Py/Py對(duì)分別相應(yīng)于A－T堿基對(duì)和T－A堿基對(duì)。
文檔編號(hào)C07K5/027GK1845733SQ200480025429
公開日2006年10月11日 申請(qǐng)日期2004年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月4日
發(fā)明者福田升, 岸岡博文, 杉山弘 申請(qǐng)人:學(xué)校法人日本大學(xué), 基因生物系統(tǒng)株式會(huì)社