專利名稱：發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說，本發(fā)明涉及新的人發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志(expressed sequence tag，EST)。
背景技術(shù)：
發(fā)育相關(guān)蛋白一直是人們研究的重點(diǎn)，為了尋找發(fā)育相關(guān)蛋白，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)研究具有與發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志(expressed sequence tag，EST)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的人發(fā)育相關(guān)的EST。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的人發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志，該已表達(dá)序列標(biāo)志具有SEQ ID NO1-40中任一所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)含有本發(fā)明上述的發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明上述的EST或多核苷酸。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
具體實(shí)施例方式
在本發(fā)明中，術(shù)語“發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志”、或“發(fā)育相關(guān)的EST”可互換使用，都指具有人發(fā)育相關(guān)的EST核苷酸序列(SEQ ID NO1-40)核酸分子。
如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個(gè)序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時(shí)加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時(shí)才發(fā)生雜交。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個(gè)核苷酸，較好是至少30個(gè)核苷酸，更好是至少50個(gè)核苷酸，最好是至少100個(gè)核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或分離編碼發(fā)育相關(guān)的EST的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質(zhì)。
本發(fā)明的人發(fā)育相關(guān)的EST核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時(shí)。通常，通過先合成多個(gè)小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的EST。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時(shí)，可優(yōu)選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴(kuò)增法)，用于PCR的引物可根據(jù)本文所公開的本發(fā)明的序列信息適當(dāng)?shù)剡x擇，并可用常規(guī)方法合成。可用常規(guī)方法如通過凝膠電泳分離和純化擴(kuò)增的DNA/RNA片段。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體。
本發(fā)明中，人發(fā)育相關(guān)的EST多核苷酸序列可插入到重組表達(dá)載體中。術(shù)語“重組表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。表達(dá)載體的一個(gè)重要特征是通常含有復(fù)制起點(diǎn)、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯控制元件。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達(dá)本發(fā)明的EST所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在上面的方法中的重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
本發(fā)明的EST序列對染色體鑒定也是有價(jià)值的。簡而言之，根據(jù)本發(fā)明發(fā)育相關(guān)的EST的cDNA制備PCR引物(優(yōu)選15-35bp)，可以將序列定位于染色體上。然后，將這些引物用于PCR篩選含各條人染色體的體細(xì)胞雜合細(xì)胞。只有那些含有相應(yīng)于引物的人基因的雜合細(xì)胞會產(chǎn)生擴(kuò)增的片段。
一旦序列被定位到準(zhǔn)確的染色體位置，此序列在染色體上的物理位置就可以與基因圖數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)可見于例如，V.Mckusick，MendelianInheritance in Man(可通過與Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary聯(lián)機(jī)獲得)。然后可通過連鎖分析，確定基因與業(yè)已定位到染色體區(qū)域上的疾病之間的關(guān)系。
本發(fā)明的EST序列對于尋找各種發(fā)育相關(guān)基因特別有用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人發(fā)育相關(guān)EST的克隆1.組織分離(Tissue isolation)組織來源于自然死亡的胎兒，置于液氮中冷凍保存。
2.mRNA的分離(mRNA isolation)取出組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至50ml新管，抽提總RNA(TRIzol Reagents，Gibco，NY，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量。用帶Oligo d(T)的纖維素柱分離總RNA中的mRNA，定量。
3.cDNA文庫的構(gòu)建(Construction of cDNA library)以mRNA為模板，合成雙鏈cDNA，反轉(zhuǎn)錄引物見SEQ ID NO1。補(bǔ)平末端后，加含EcoRI切點(diǎn)的接頭，接頭序列分別見SEQ ID NO1-40和3。磷酸化EcoRI末端后，用XhoI限制性內(nèi)切酶消化1.5小時(shí)，再進(jìn)行片段分離。過柱篩選長度＞500bp的片段，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，無菌水溶解，連接至Uni-ZAP XR載體(Stratagene，CA9203，USA)，以Zap-cDNA Gigapack III Gold CloningKit(Stratagene，CA9203，USA)進(jìn)行包裝，宿主菌使用XL 1-Blue MRF’(Stratagene，CA9203，USA)細(xì)菌。涂板并測定滴度。
4.測序及數(shù)據(jù)庫建立(Seqencing and Database Constructing)挑選文庫中有外源片段插入的克隆，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒(Qiagen，Germany)，用T3和T7作為3’端和5’端的通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行EST大規(guī)模測序。測序結(jié)果用FACTURA軟件去除載體序列，傳輸?shù)絊UN Ultra 450 Server上進(jìn)行下一步的處理。所有的序列信息再用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(Genebank+EMBL)，將無同源性或同源性低于95％的序列視為新基因建立數(shù)據(jù)庫。
結(jié)果，對建立胎兒cDNA文庫進(jìn)行大規(guī)模測序，共獲得表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed Sequence Tag，EST)序列4200條。除去核糖體RNA、線粒體序列、重復(fù)序列等，共獲得了3,394(81.4％)高質(zhì)量的EST，并提交GeneBank，接受號是CD236662-CD240055，其中82個(gè)新的EST。
對其中40個(gè)EST進(jìn)行了組織表達(dá)譜的分析，即運(yùn)用Blast、Cluster分析和RT-PCR試驗(yàn)等方法，確認(rèn)它們?yōu)樾翬ST，并可見大多數(shù)EST非廣泛表達(dá)，一些EST只局限于垂體和睪丸等少數(shù)組織，如CD239423、CD239425、CD238497、CD238482；一些EST則只局限于垂體和腦，如CD237004、CD236818和CD237414；一些EST則只局限于垂體、腦和腎，如CD236823、CD238082、CD237741、CD238773、CD236971、CD237973、CD237696；一些EST則只局限于垂體、腦、腎和胸腺，如CD237332、CD239533、CD239894、CD237875、CD236973、CD236982、CD236975。
這些新的EST很可能代表某些關(guān)鍵的基因，在組織發(fā)育或功能發(fā)揮上具有重要作用。
這40種人發(fā)育相關(guān)的EST的核苷酸序列如表1所示表1








在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海人類基因組研究中心<120>發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志<130>037002<160>40<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>424<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1tatttgttag gatgcctgaa gtcttcattt ccaacaggag aaagccacaa aacacttgtg 60gttctgaaag cagcctgctg ttaacatgag ttatgtgaat ctgatctata atcttacctg120acatttggaa ctcaaatatt ttccttattt ctccaaaaca attaaaatat ttagtctcac180ttcattttat gagacataaa tagctatata agtactctgt aattactgta cattgtaaca240aatgacctca taaatacatt gtaatgtccc atgtaattac atggtacatc ctgtctttga300gatggctgct ctgagattga aagcctgctg gtttcagaga ttaattactt agggcctaat360ttgacagttt gcttgaagat aggccgctgt taatagccac ttctgtggtt tcataaaaaa420aaaa 424<210>2<211>729<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>2aaatcatcaa gaagaaattc tggaaatcta aaacactgta acagtgtgaa gaatgcctct 60gatggtctca tcaatcaact ggacacagaa tctgtggact tgaaaaatct gaatgtttgc120agatgcatca tgtgtcttag gctactgtag aaattactgg tctctgatgt ctggccctga180ggtctgggct gtggctgtgt ttgtctttat attcacctgg agactgacca agtggtacag240cagcaagctc tgccccaggt cagttggtct gatcttacag acagaaaaga acctggcgct300tacttcactg tcttcttgca ttctgaccaa cgttcaaagt aatttgttgt catggtgcca360atgtgattga cgtgaaatag gaactattat ttttctatgg gaaagaaatg gagaacttta420caaagtcctt ccctactatg gacataactt tatagtgttc cttctaatcc ttaaggggat480ctaagaggct gataagtgcc cagaaggaag aattatcaat aagtttatta gtcttccaac540tttgatgatt gagactctta tttgttttaa gcaagatctc ttatgctcac caggacatga600atcagtggag aaatggtggt gtgctctgaa tatgggctct tactacctga atctagggtc660aggaaacaaa ctctttgtat aaaacctaca atcaccggtt ctaatgtgaa cctgtgttcc720tctttatta729<210>3<211>617<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>3atcccccttt tgaaaatggg ggaactaagt tatggaatat aatttatata aagtcacata 60gctgggaaat gatggaacca aggttcaaat ccaggcagtc tggcctcaga gctggcaggt120gaacccttcc acggggcttc cttcctccct gttcccaccc cattagtgag ggaggagata180cagagtagtg cagtgtgatc tagacatgga atcagatttg gattccaacc ccagctccga240cccctactct ctgtgctact ttaggcaact cccttagcat ctctcggctt cattttcccc300
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權(quán)利要求
1.一種分離的人發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志，其特征在于，該已表達(dá)序列標(biāo)志具有SEQ ID NO1-40中任一所示的核苷酸序列。
2.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)含有權(quán)利要求1所述的發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
3.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求2所述的多核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的發(fā)育相關(guān)的已表達(dá)序列標(biāo)志(EST)，這些EST來源于人胎兒cDNA文庫。這些新的EST代表某些關(guān)鍵的基因，在組織發(fā)育或功能發(fā)揮上具有重要作用。本發(fā)明還公開了這種發(fā)育相關(guān)的EST的用途。
文檔編號C07H21/00GK1618963SQ20031010876
公開日2005年5月25日 申請日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者劉鋒, 曾令春, 祁小飛, 韓澤廣 申請人:上海人類基因組研究中心