專利名稱：長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法。
背景技術(shù)：
自1992年Adams提出表達(dá)序列標(biāo)簽(expressed sequence tag)和隨后的大規(guī)模表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)的建立，以及生物技術(shù)的發(fā)展和生命科學(xué)發(fā)展的需要，基因芯片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生?；蛐酒?Biochips)的實(shí)質(zhì)就是在面積不大的基片上有序地點(diǎn)陣排列了一系列固定于一定位置地可尋址的生物識(shí)別分子(R.J.Lipshutz et al.，Bio Techniques 19(1995)，442-447；S.P.Fodor et al.，Nature364(1993)，555-556；S.P.Fodor et al.，Science 251(1991)，767-773；A.C.Pease et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(1994)，5022-5026)。由于最初的基因芯片主要是用于DNA序列測定，基因表達(dá)譜鑒定(D.J.Lockhart et al.，Nature Biotechnol.14(1996)，1675-1680)和基因突變體的檢測和分析(Feriotto G，et al.，Hum Mutat1999；13390-400；Hacia J.G.et al.，Nat Genet 1999；21(suppl 1)42-7；Hacia JG，etal.，Nat Genet 1999；22164-7；Nilsson P，et al.，Biotechniques 1999；26308-16)，所以又稱為DNA芯片或基因芯片。目前，這一技術(shù)以擴(kuò)展至免疫反應(yīng)、受體結(jié)合等非核酸領(lǐng)域。如今基因芯片主要包括cDNA微陣列、寡核苷酸微陣列、動(dòng)電微陣列和蛋白質(zhì)芯片等。運(yùn)用基因芯片技術(shù)，將獲得的芯片運(yùn)用雜交技術(shù)和掃描技術(shù)對基因芯片進(jìn)行芯片處理、有效數(shù)據(jù)提取、分析和報(bào)告，可獲得相應(yīng)的基因表達(dá)譜(Gene expression profiling)?；蛐酒蚓哂袕?qiáng)有力性、靈活性、敏感性和相對簡單等特點(diǎn)而被應(yīng)用在許多領(lǐng)域，如DNA序列測定、基因多態(tài)性檢測、新基因的發(fā)現(xiàn)、疫苗和藥物研究(M.J.Cunningham et al.，J.Pharmacol.and Toxicol.Methods 2000；44，291-300)、植物的抗逆性研究(P.M.Schenk，et al.，PNAS2000；9711655-11660)。
基因芯片技術(shù)的發(fā)展勢必帶動(dòng)一大批相應(yīng)技術(shù)的發(fā)展，如基因芯片的信號(hào)檢測方法。目前基因芯片信號(hào)檢測方法主要包括以Cy5/Cy3標(biāo)記的熒光信號(hào)檢測方法和以同位素標(biāo)記的信號(hào)檢測方法，而且這些方法目前大都應(yīng)用于高通量的基因芯片的信號(hào)檢測中，但無論應(yīng)用那種信號(hào)檢測方法，都需要對探針進(jìn)行標(biāo)記，而且應(yīng)用Cy5/Cy3熒光標(biāo)記需要對Cy5和Cy3分別進(jìn)行兩次，用同位素標(biāo)記不僅能夠?qū)Σ僮髡叩娜松硎艿絺Γ€會(huì)對環(huán)境造成核輻射污染。
鑒于此，本發(fā)明提供了一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法。方法的步驟是運(yùn)用特異引物對目的基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增并用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增陽性產(chǎn)物約5μg 100℃煮沸5min變性后，直接放入冰上冷卻3-5min，以備探針雜交用；將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液(pH7.2)進(jìn)行潤濕后，加入預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃進(jìn)行預(yù)雜交1-2小時(shí)；接著加入制備好的5μg變性探針DNA(該探針無需進(jìn)行任何標(biāo)記，如同位素、生物素等)，60℃進(jìn)行雜交10-12小時(shí)；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％SDS)洗滌2次，每次20min，用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗滌15min；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/LEDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE緩沖液漂洗5-10min，重復(fù)2次；在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進(jìn)行信號(hào)檢測。該方法省卻了對探針進(jìn)行標(biāo)記的繁雜程序，特別是避免了同位素標(biāo)記對人體所造成的傷害和對環(huán)境造成的放射污染；應(yīng)用該方法可以克服單純運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增可能造成的假陽性結(jié)果，使所得結(jié)果更靈敏、穩(wěn)定、可靠。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法。方法的步驟為1)運(yùn)用特異引物對待測目的基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增并用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，陽性PCR產(chǎn)物備用；2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物5μg 90-100℃煮沸5-10min進(jìn)行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min；3)將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液，pH7.2，進(jìn)行潤濕后，加入預(yù)雜交液，55-65℃進(jìn)行預(yù)雜交1-2小時(shí)；預(yù)雜交液為0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，重量體積比為7％十二烷基磺酸鈉，重量體積比為1％牛血清白蛋白；4)接著加入步驟2)的5μg變性DNA，55-65℃進(jìn)行雜交10-12小時(shí)；5)用洗膜液I洗滌1-3次，每次15-20min；洗膜液I為2×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；2×SSC為0.3mol/L氯化鈉，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0；
6)用洗膜液II洗滌15-20min；洗膜液II為0.1×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；7)將基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液中染色5-10min；1×TE緩沖液為10mmo/LTris堿，pH8.0；1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；8)用TE緩沖液漂洗5-10min，重復(fù)2-3次；9)在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進(jìn)行信號(hào)檢測。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)該方法省卻了對探針進(jìn)行標(biāo)記的繁雜程序，特別是避免了同位素標(biāo)記對人體所造成的傷害和對環(huán)境造成的放射污染；2)應(yīng)用該方法可以克服單純運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增可能造成的假陽性結(jié)果，使所得結(jié)果更可靠。3)該方法與常規(guī)的檢測方法相比具有高靈敏度和較高的檢出率。


圖1是Nos終止子基因?yàn)樘结橂s交后進(jìn)行染色的結(jié)果，圖中1為Nos終止子，2為NPTII基因，3為CP4-EPSPS基因，4為Bar基因；圖2是用于長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法基因芯片的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是用于長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法基因芯片圖2的方陣結(jié)構(gòu)放大示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例(一)長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的制備如圖2所示，基因芯片是在平面型支撐載體5的平面上被覆有帶正電荷材料的膜6，在該膜層的表面設(shè)有點(diǎn)陣7，在點(diǎn)陣7上排布有如下供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針1)35S啟動(dòng)子，2)FMV35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
點(diǎn)陣7為排布的凹窩狀結(jié)構(gòu)8，點(diǎn)陣7之間保持有空間間隔，所說的各供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針分別被覆于各凹窩狀結(jié)構(gòu)8內(nèi)。帶正電荷材料的膜層6為聚賴氨酸材料或氨基硅烷材料膜層。平面型支撐載體5為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
將預(yù)先合成好的上述的19個(gè)基因的單鏈寡核苷酸片段(長度大于50bp)稀釋成濃度為0.2μg/μl，按照實(shí)驗(yàn)要求將各種濃度、各種不同基因的單鏈寡核苷酸片段排列于96孔PCR板中，用于基因芯片的點(diǎn)制；基因芯片由arrayer(GenomicSolution，USA)機(jī)器手，使用直徑為0.4mm的96針點(diǎn)制，基因芯片載體為尼龍膜(Millipore Nylon N+)，所有的點(diǎn)點(diǎn)制為36×24的一級(jí)方陣，每種基因的三種不同濃度在3×3的二級(jí)陣中平行三次重復(fù)以驗(yàn)證試驗(yàn)的重復(fù)性。
(二)CTAB法抽提轉(zhuǎn)基因大豆DNA用液氮將0.1g轉(zhuǎn)基因大豆磨成粉末，將粉末狀的干物質(zhì)加入400μl預(yù)冷的CTAB提取緩沖液I(50mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)中。加入500μl 65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液II(2％CTAB，50mmol/LTris-Cl，10mmol/L EDTA，800mmol/L NaCl，pH8.0)，1μl 2-巰基乙醇，混勻，65℃保溫30-90min，其間不時(shí)輕緩顛倒混勻。待冷至室溫后加入450μl氯仿/異戊醇，輕緩顛倒混勻至溶液呈乳濁狀。12000rpm離心2min至分相。將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入5μl Rnase A儲(chǔ)液，室溫下保溫30min。依次加入600μl異丙醇及60μl乙酸鈉溶液，輕緩顛倒混勻。12,000rpm離心10min，沉淀DNA。棄上清液后，加入800μl 76％乙醇，12,000rpm離心10min，棄上清液后，再加入100μl 70％乙醇洗滌沉淀，12,000rpm離心5min，沉淀DNA，除去殘留的乙醇。DNA沉淀溶解于100μl TE緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?br> (三)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增總反應(yīng)體系為50μl，10μl上述模板DNA，5μl 10×PCR反應(yīng)緩沖液(500mmol/L KCl，100mmol/L Tris·Cl，在25℃下，pH9.0，1.0％Triton X-100)，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP(每種2.5mmol/L)，0.5μl上游引物(100ng/μl)，0.5μl下游引物(100ng/μl)，1μl Taq DNA聚合酶(5U/μl)，重蒸水25μl，混勻后離心5秒。將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入Taq DNA聚合酶(0.5μl約2.5U)，混勻后稍離心。95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，進(jìn)行PCR。最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min，使反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增充分。PCR擴(kuò)增的引物分別為Nos終止子基因Pnos-F15’GAATCCTGTTGCCGGTCTTG3’Pnos-R15’TTATCCTAGTTTGCGCGCTA3’(四)瓊脂糖凝膠電泳用0.5×TBE電泳緩沖液(45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L EDTA，pH8.0)，配制1％的瓊脂糖凝膠液；加入10mg/ml溴化乙錠(EB)溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應(yīng)的凝膠板；取10μl PCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣緩沖液(0.25％溴酚藍(lán)，40％(w/v)蔗糖水溶液)混勻，用微量移液槍小心加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上，立即接通電源進(jìn)行電泳；當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿約2cm時(shí)，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
(五)分子雜交及信號(hào)檢測聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增產(chǎn)物約5μg 100℃煮沸5min進(jìn)行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min，以備探針雜交用；將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液(pH7.2)進(jìn)行潤濕后，加入預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L EDTA，pH8.0，7％SDS，1％BSA)，60℃進(jìn)行預(yù)雜交1-2小時(shí)；接著加入制備好的5μg變性探針DNA(該探針未進(jìn)行任何標(biāo)記，如同位素、生物素等)，60℃進(jìn)行雜交10-12小時(shí)；用洗膜液I(2×SSC(0.3mol/L NaCl，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0)，0.1％SDS)洗滌2次，每次20min；用洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)洗滌15min；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液(10mmo/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0))中染色5-10min；用TE緩沖液漂洗5-10min，重復(fù)2次；在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進(jìn)行信號(hào)檢測。
權(quán)利要求
1.一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法，其特征在于，方法的步驟為1)運(yùn)用特異引物對待測目的基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增并用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，陽性PCR產(chǎn)物備用；2)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物5μg 90-100℃煮沸5-10min進(jìn)行變性后，直接放入冰上冷卻3-5min；3)將檢測用基因芯片用0.25M的磷酸緩沖液，pH7.2，進(jìn)行潤濕后，加入預(yù)雜交液，55-65℃進(jìn)行預(yù)雜交1-2小時(shí)；預(yù)雜交液為0.25mol/L磷酸緩沖液，pH7.2，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0，重量體積比為7％十二烷基磺酸鈉，重量體積比為1％牛血清白蛋白；4)接著加入步驟2)的5μg變性DNA，55-65℃進(jìn)行雜交10-12小時(shí)；5)用洗膜液I洗滌1-3次，每次15-20min；洗膜液I為2×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；2×SSC為0.3mol/L氯化鈉，0.03mol/L檸檬酸鈉，pH7.0；6)用洗膜液II洗滌15-20min；洗膜液II為0.1×SSC，重量體積比為0.1％十二烷基磺酸鈉；7)將基因芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液中染色5-10min；1×TE緩沖液為10mmo/L Tris堿，pH8.0；1mmol/L 乙二胺四乙酸，pH8.0；8)用TE緩沖液漂洗5-10min，重復(fù)2-3次；9)在254nm紫外光下或熒光顯微鏡下進(jìn)行信號(hào)檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法，其特征在于，所說的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為總反應(yīng)體系為50μl，10μl模板DNA，5μl 10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液，4μl 25mmol/L MgCl2，4μl 4種dNTP，0.5μl 100ng/μl上游引物，0.5μl 100ng/μl下游引物，1μl 5U/μl Taq DNA聚合酶，重蒸水25μl，混勻后離心5秒；10×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液為500mmol/L氯化鉀，100mmol/L Tris堿，pH9.0，重量體積比為1.0％ Triton X-100；4種dNTP為包含各為2.5mmol/L dATP、dCTP、dGTP、dTTP；將混合物在94℃下加熱5min后冰冷，迅速離心數(shù)秒，使管壁上液滴沉至管底，加入2.5U Taq DNA聚合酶，混勻后稍離心；95℃變性5min，用95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35次擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)，進(jìn)行PCR，最后一輪循環(huán)結(jié)束后，于72℃下保溫10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法。其特征在于，所說的瓊脂糖凝膠電泳方法為用0.5×TBE電泳緩沖液配制重量體積比為1％的瓊脂糖凝膠液；0.5×TBE電泳緩沖液為45mmol/L Tris堿，45mmol/L硼酸，1mmol/L乙二胺四乙酸，pH8.0；加入10mg/ml溴化乙錠溶液母液，使其終濃度為0.5μg/ml；用制膠板制備相應(yīng)的凝膠板；取10μl PCR產(chǎn)物與2μl 6×載樣緩沖液混勻；6×載樣緩沖液為重量體積比為0.25％溴酚藍(lán)，重量體積比為40％蔗糖水溶液；用微量移液槍加入凝膠板的樣品槽中；控制電壓保持在60-80V，電流在40-100mA，接通電源進(jìn)行電泳；溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前沿2-3cm時(shí)，停止電泳；在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色并拍照。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法，其特征在于，所述的基因芯片是在平面型支撐載體(5)的平面上被覆有帶正電荷材料的膜(6)，在該膜層的表面設(shè)有點(diǎn)陣(7)，在點(diǎn)陣(7)上排布有如下供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針1)35S啟動(dòng)子，2)FMV35S啟動(dòng)子，3)Nos終止子，4)NPTII基因，5)CryI(AC)基因，6)Cry9c基因，7)改造的CP4-EPSPS基因，8)35s-CTP2，9)CP4-EPSPS基因，10)GOX基因，11)Bar基因，12)Barnase基因，13)Barstar基因，14)CryIA(a)基因，15)Lectin基因，16)Napin基因，17)Zein基因，18)Sad1基因，19)Lat52基因或外源基因片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法，其特征在于所述的點(diǎn)陣(7)為排布的凹窩狀結(jié)構(gòu)(8)，點(diǎn)陣(7)之間保持有空間間隔，所說的各供轉(zhuǎn)基因植物判斷用的外源基因探針分別被覆于各凹窩狀結(jié)構(gòu)(8)內(nèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法，其特征在于，所述的帶正電荷材料的膜層(6)為聚賴氨酸材料或氨基硅烷材料膜層。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法，其特征在于所述的平面型支撐載體(5)為玻片、硅片、尼龍膜或硝酸纖維素膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種長度大于五十個(gè)堿基的寡核苷酸的基因芯片的信號(hào)檢測方法。方法的步驟是目的基因進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增并檢測；陽性產(chǎn)物約5μg100℃煮沸變性，冰上冷卻；將檢測用基因芯片用磷酸緩沖液潤濕后，加入預(yù)雜交液進(jìn)行預(yù)雜交；接著加入制備好的5μg變性DNA，60℃進(jìn)行雜交；用洗膜液I洗滌2次，用洗膜液II洗滌；將芯片放入混有1×SYBR Green I的1×TE緩沖液染色；用TE緩沖液漂洗，重復(fù)2次；紫外光下或熒光顯微鏡下進(jìn)行信號(hào)檢測。該方法省卻了對探針進(jìn)行標(biāo)記的繁雜程序，特別是避免了同位素標(biāo)記對人體所造成的傷害和對環(huán)境造成的放射污染；應(yīng)用該方法可以克服單純運(yùn)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增可能造成的假陽性結(jié)果，使所得結(jié)果更靈敏、穩(wěn)定、可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1661104SQ20041009315
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月17日
發(fā)明者李德葆, 駱紅梅, 戴承恩, 姜玉新, 董海濤 申請人:浙江大學(xué)