專利名稱：純化蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種純化蛋白質(zhì)的方法，更特異地涉及一種從含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)如抗體分子的樣品中去除雜質(zhì)如DNA污染物的方法。
背景技術(shù)：
基因重組技術(shù)的進(jìn)展使穩(wěn)定提供不同蛋白質(zhì)制劑成為可能。特別是，近幾年來(lái)已開發(fā)出比普通藥物更具選擇性的種種重組抗體藥物，并已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。
在這些重組產(chǎn)生的含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的制劑中，需要去除宿主DNA和與病毒污染相關(guān)的雜質(zhì)(如DNA污染物)。根據(jù)目前世界衛(wèi)生組織WHO標(biāo)準(zhǔn)，生物藥物中DNA的量不應(yīng)超過100pgDNA/劑量。為達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)，通常，為去除DNA的目的，用陰離子交換層析、羥基磷灰石層析、或它們的組合處理含有來(lái)自宿主細(xì)胞的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的水性培養(yǎng)基。
特別是，在生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是在哺乳動(dòng)物宿細(xì)胞中重組產(chǎn)生的抗體的情況下，所述水性培養(yǎng)基在用各種類型層析純化前，基于蛋白質(zhì)A或蛋白質(zhì)G與IgG Fc鏈的結(jié)合性質(zhì)，用蛋白質(zhì)A或G上的親和柱層析處理。
例如，在JP KOHYO 5-504579中，使由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的含抗體水性培養(yǎng)基進(jìn)行蛋白質(zhì)A/G柱層析，以將抗體分子吸附到柱上，再用酸性溶液(約0.1M檸檬酸，pH3.0-3.5)洗脫以釋放抗體分子。獲得的酸性洗脫物依次進(jìn)行離子交換柱層析和大小排除柱層析，獲得純的抗體分子。
但是，這些單個(gè)的層析方法和它們的組合費(fèi)時(shí)間，費(fèi)勞力和費(fèi)成本，且復(fù)雜。另外，它們不能提供穩(wěn)定的結(jié)果。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種更簡(jiǎn)單、費(fèi)用更低的純化生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)，尤其是抗體的方法，該方法能確保去除雜質(zhì)如DNA污染物和病毒，并且它能使生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的損失最小化。
本發(fā)明公開作為為克服這些問題所做大量和細(xì)致努力的結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明者獲得了驚人的發(fā)現(xiàn)當(dāng)使樣品在低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH下形成低電導(dǎo)率的水溶液，然后通過過濾器過濾去除產(chǎn)生的顆粒時(shí)，不使用復(fù)雜的層析方法可從含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中高效去除雜質(zhì)如DNA污染物和病毒。這一發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了本發(fā)明的完成。
也就是說，本發(fā)明提供了以下內(nèi)容。
(1)一種去除含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中雜質(zhì)的方法，該方法包括步驟1)使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品形成具有等于或低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH的低電導(dǎo)率水溶液；和2)去除產(chǎn)生的顆粒。
(2)根據(jù)以上(1)的方法，其中所述低電導(dǎo)率水溶液具有以摩爾濃度表示的0～100mM的電導(dǎo)率。
(3)根據(jù)以上(1)或(2)的方法，其中所述低電導(dǎo)率水溶液具有0～0.2的離子強(qiáng)度。
(4)根據(jù)以上(1)至(3)中任一項(xiàng)的方法，其中所述低電導(dǎo)率水溶液具有0～300mS/m的電導(dǎo)率。
(5)根據(jù)以上(1)至(4)中任一項(xiàng)的方法，其中所述溶液選自鹽酸水溶液、檸檬酸水溶液和醋酸水溶液。
(6)根據(jù)以上(1)至(5)中任一項(xiàng)的方法，其中所述水溶液的pH等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，且等于或高于pH2.0。
(7)根據(jù)以上(1)至(6)中任一項(xiàng)的方法，其中所述雜質(zhì)是DNA污染物。
(8)根據(jù)以上(1)至(6)中任一項(xiàng)的方法，其中所述雜質(zhì)是病毒。
(9)根據(jù)以上(7)的方法，其中所述含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)樣品經(jīng)DNA污染物去除處理后具有DNA濃度為22.5pg/ml或更低的DNA污染物。
(10)根據(jù)以上(1)至(9)中任一項(xiàng)的方法，其中所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是抗體。
(11)根據(jù)以上(10)的方法，其中所述抗體為IgG抗體。
(12)根據(jù)以上(10)或(11)的方法，其中所述抗體為人源化單克隆抗體。
(13)根據(jù)以上(12)的方法，其中所述抗體為人源化抗IL-6受體抗體。
(14)根據(jù)以上(12)的方法，其中所述抗體為人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體。
(15)根據(jù)以上(12)的方法，其中所述抗體為人源化抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗-PTHrP抗體)。
(16)根據(jù)以上(1)至(9)中任一項(xiàng)的方法，其中所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子。
(17)根據(jù)以上(1)至(16)中任一項(xiàng)的方法，其中所述顆粒通過濾器過濾去除。
(18)根據(jù)以上(1)的方法，其中步驟1)通過使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)形成低電導(dǎo)率的酸性或堿性水溶液，并將得到的樣品用緩沖液調(diào)節(jié)到等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH來(lái)完成。
(19)根據(jù)以上(1)的方法，其中所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是一種抗體，和其中步驟1)通過使含有抗體的樣品經(jīng)蛋白質(zhì)A或G上的親和層析，用低電導(dǎo)率的酸性水溶液洗脫所述樣品，并用緩沖液調(diào)節(jié)得到的洗脫物至等于或低于所述抗體的等電點(diǎn)的pH來(lái)完成。
(20)根據(jù)以上(18)或(19)的方法，其中所述緩沖液為Tris水溶液。
(21)可通過以上(1)至(20)中任一項(xiàng)的方法獲得的純化的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)。
(22)一種生產(chǎn)醫(yī)療蛋白質(zhì)制劑的方法，該方法包括純化步驟，該純化步驟中使用以上(1)至(20)中任一項(xiàng)的方法。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式利用本發(fā)明方法純化的樣品中含有的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的例子包括，但不限于，造血因子，如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、紅細(xì)胞生成素(EPO)和血小板生成素，細(xì)胞因子如干擾素、IL-1和IL-6、單克隆抗體、組織纖溶酶原激活劑(TPA)、尿激酶、血清白蛋白、血凝因子VIII、凝集素、胰島素和干細(xì)胞生長(zhǎng)因子(SCF)。在這些蛋白質(zhì)中，優(yōu)選的是G-CSF和抗體，包括單克隆抗體，且更優(yōu)選的是單克隆抗體。在利用蛋白質(zhì)A/G親和層析的本發(fā)明實(shí)施方案中，優(yōu)選單克隆抗體用于純化。抗體分成IgG、IgA、IgE、IgD和IgM類，優(yōu)選IgG抗體。
術(shù)語(yǔ)“生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)”是指具有與哺乳動(dòng)物(尤其人類)來(lái)源的相應(yīng)生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)基本相同的生物活性的蛋白質(zhì)。這樣的蛋白質(zhì)可能是天然的，也可能是遺傳重組的，優(yōu)選遺傳重組的。遺傳重組的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)可通過細(xì)菌細(xì)胞如E.coli；酵母細(xì)胞；或動(dòng)物來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、C127細(xì)胞或COS細(xì)胞中的生產(chǎn)來(lái)制備。這樣制備的蛋白質(zhì)在使用前用各種方法進(jìn)行分離和純化。這樣的遺傳重組蛋白質(zhì)包括具有與相應(yīng)天然蛋白質(zhì)相同氨基酸序列的那些及在氨基酸序列中包含缺失、替換或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸，但保留了上文提到的生物學(xué)活性的那些。另外，這樣的蛋白質(zhì)包括用PEG等進(jìn)行化學(xué)修飾的那些。
當(dāng)生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是一種糖蛋白時(shí)，它可能具有任何來(lái)源，優(yōu)選哺乳動(dòng)物來(lái)源的糖鏈。哺乳動(dòng)物來(lái)源包括，如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、BHK細(xì)胞、COS細(xì)胞和人源細(xì)胞，最優(yōu)選CHO細(xì)胞。
當(dāng)生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是EPO時(shí)，可用任何方法制備它，例如，通過各種方法從人尿中獲得或通過遺傳工程技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞如E.coli、酵母細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、BHK細(xì)胞、COS細(xì)胞、人源細(xì)胞或類似細(xì)胞(例如，如JP KOKAI 61-12288中描述的)中生產(chǎn)。在使用前，將這樣制備的EPO用各種方法進(jìn)行提取、分離和純化。另外，EPO可用PEG等進(jìn)行化學(xué)修飾(參考國(guó)際公開No.WO90/12874)。本文使用的EPO還包括起初非糖基化但用PEG等進(jìn)行化學(xué)修飾的那些。同樣，還包括EPO類似物，它們被修飾以在EPO氨基酸序列中有至少一個(gè)另外的N-連接或O-連接糖基化的位點(diǎn)(見，例如，JP KOKAI 08-151398，JP KOHYO08-506023)。不增加糖基化位點(diǎn)的數(shù)量，也可修飾EPO類似物以具有增加的糖鏈如唾液酸的含量，用于增加糖鏈的量。
當(dāng)生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是G-CSF時(shí)，只要它是高度純的，可用任何G-CSF。本發(fā)明使用的G-CSF可用任何方法制備，例如，通過從培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞系獲得或通過用遺傳工程技術(shù)在細(xì)菌細(xì)胞如E.coli；酵母細(xì)胞；或動(dòng)物來(lái)源的培養(yǎng)細(xì)胞如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、C127細(xì)胞或COS細(xì)胞中生產(chǎn)。這樣制備的G-CSF在使用前用各種方法進(jìn)行提取、分離和純化。優(yōu)選的是在E.coli細(xì)胞、酵母細(xì)胞或CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生的那些。最優(yōu)選的是在CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生的那些。另外，G-CSF可用PEG等進(jìn)行化學(xué)修飾(參考國(guó)際公開No.WO90/12874)。
當(dāng)生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是單克隆抗體時(shí)，可用任何方法制備它。原則上，可用已知技術(shù)，按照常規(guī)免疫程序免疫致敏抗原，通過常規(guī)細(xì)胞融合程序?qū)@得的免疫細(xì)胞與已知親本細(xì)胞融合，然后通過常規(guī)篩選程序篩選單克隆抗體產(chǎn)生性細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。
可替代地，從雜交瘤中克隆抗體基因，將該基因整合入合適的載體中，然后將該基因轉(zhuǎn)化入宿主，用基因重組技術(shù)生產(chǎn)抗體分子。由此生產(chǎn)的遺傳重組抗體也可用于本發(fā)明(見，例如，Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，由MACMILLAN PUBLISHERS LTD在英國(guó)出版，1990)。更具體地說，用逆轉(zhuǎn)錄酶從雜交瘤mRNA中合成抗體可變區(qū)(V區(qū))cDNA。獲得編碼靶抗體V區(qū)DNA后，將該DNA與編碼期望的抗體恒定區(qū)(C區(qū))DNA連接并將其整合入表達(dá)載體中?；蛘?，可將編碼抗體V區(qū)的DNA整合入攜帶抗體C區(qū)DNA的表達(dá)載體中。將DNA構(gòu)建體整合入表達(dá)載體中以便它在表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)如增強(qiáng)子或啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。然后用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞進(jìn)行抗體表達(dá)。
本發(fā)明中，使用以弱化對(duì)人異質(zhì)抗原特性為目的的人工修飾的遺傳重組抗體(例如嵌合抗體、人源化抗體)是可能的。這些修飾的抗體可用已知方法制備。嵌合抗體由來(lái)自非人哺乳動(dòng)物(如小鼠)抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)和來(lái)自人抗體重鏈和輕鏈恒定區(qū)組成。為了獲得嵌合抗體，可將編碼這種小鼠抗體可變區(qū)DNA與編碼人抗體恒定區(qū)DNA連接，然后將其整合入表達(dá)載體中，接著轉(zhuǎn)化入宿主進(jìn)行抗體生產(chǎn)。
人源化抗體也被稱為重構(gòu)人抗體，通過嫁接非人哺乳動(dòng)物(如小鼠)抗體互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，替代人抗體的互補(bǔ)決定區(qū)獲得。還已經(jīng)知道用于此目的的標(biāo)準(zhǔn)基因重組程序。更具體地說，通過幾條寡核苷酸的PCR，所述寡核苷酸被制備以具有末端相互重疊的部分，合成了DNA序列，該DNA序列被設(shè)計(jì)允許小鼠抗體的CDRs和人抗體的框架區(qū)(FRs)之間的連接。將由此獲得的DNA序列與編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，并將其整合入表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn)化入宿主用于抗體生產(chǎn)(見歐洲專利公開No.EP 239400和國(guó)際公開No.WO 96/02576)。選擇通過CDRs連接的人抗體FRs以使互補(bǔ)決定區(qū)形成有利抗原結(jié)合位點(diǎn)。如果需要的話，可在抗體可變區(qū)的框架區(qū)中進(jìn)行氨基酸替換，以便重構(gòu)人源化抗體的互補(bǔ)決定區(qū)可形成合適的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Sato，K.et al.，CancerRes.(1993)53，851-856)。
人源化抗-IL-6受體抗體(hPM-1)可作為這類重構(gòu)人源化抗體的優(yōu)選的例子(見國(guó)際公開No.WO92-19759)。除此之外，還優(yōu)選人源化抗-HM1.24抗原單克隆抗體(見國(guó)際公開No.WO98-14580)、人源化抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗-PTHrP抗體；見國(guó)際公開No.WO98-13388)、人源化抗組織因子抗體(見國(guó)際公開No.WO99-51743)及類似抗體用于本發(fā)明。
還已經(jīng)知道獲得人抗體的程序。例如，在體外用期望的抗原或期望的抗原表達(dá)細(xì)胞使人淋巴細(xì)胞致敏，然后使致敏的淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞(如U266)融合，產(chǎn)生具有與抗原結(jié)合活性的期望的人抗體(見JP KOKOKU 01-59878)?；蛘?，用抗原使具有整套人抗體基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物免疫，獲得期望的人抗體(見國(guó)際公開Nos.WO 93/12227、WO92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096和WO 96/33735)。有另外的用人抗體庫(kù)通過淘篩獲得人抗體的技術(shù)。例如，利用噬菌體顯示技術(shù)將每個(gè)人抗體可變區(qū)以單鏈抗體(scFv)形式表達(dá)于噬菌體表面，然后選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。通過分析選擇的噬菌體的基因，測(cè)定與抗原結(jié)合的編碼人抗體可變區(qū)的DNA序列是可能的。一旦鑒定了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，該序列就可被用來(lái)構(gòu)建合適的表達(dá)載體以獲得人抗體。這些技術(shù)已經(jīng)是熟知的，并可在WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438和WO 95/15388中找到。
另外，還優(yōu)選在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中生產(chǎn)的人抗體等。
再者，本發(fā)明使用的抗體包括抗體片段，包括Fab、(Fab’)2、Fc、Fc’和Fd，以及重構(gòu)抗體，包括單價(jià)或多價(jià)單鏈抗體(scFV)。
如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)“含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品”或“含有抗體的樣品”優(yōu)選地意思是指含有通過培養(yǎng)產(chǎn)生的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)分子或抗體分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基可進(jìn)一步進(jìn)行部分純化或其它某些處理。
在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過一種方法去除含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中的雜質(zhì)，所述方法包括步驟1)使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品在等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH下形成低電導(dǎo)率的水溶液；和2)去除產(chǎn)生的顆粒。
只要它不是待純化的靶蛋白，利用本發(fā)明的方法可去除任何作為雜質(zhì)的物質(zhì)。這類雜質(zhì)的例子包括DNA污染物、病毒、蛋白質(zhì)A(由柱子洗出的)、內(nèi)毒素、HCP(宿主細(xì)胞來(lái)源的蛋白質(zhì))、以及培養(yǎng)基成分Hy-Fish(FL)和IGF，優(yōu)選DNA污染物或病毒。如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)“DNA污染物”意思是指存在于含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中的DNA分子。例子包括宿主來(lái)源的DNAs和來(lái)源于污染的病毒DNAs。
對(duì)通過本發(fā)明方法去除的病毒種類沒有特別限制?？扇コ魏尾《荆―NA和RNA病毒。RNA病毒的例子包括逆轉(zhuǎn)錄病毒(如X-MuLV)、呼腸孤病毒(如Reo3)和細(xì)小病毒(如MVM)。通過本發(fā)明方法去除的病毒的說明性例子包括，例如，X-MuLV、PRV、Reo3、MVM、VSV、單純皰疹、CHV、新培斯、流行性腮腺炎、牛痘、麻疹、風(fēng)疹、流感、帶狀皰疹、巨細(xì)胞、副流感、EB、HIV、HA、HB、NANB、ATL、ECHO和細(xì)小病毒，優(yōu)選X-MuLV、Reo 3、MVM和PRV。
如本發(fā)明所使用的，術(shù)語(yǔ)“低電導(dǎo)率水溶液”通常意思是指摩爾濃度為0～100mM，優(yōu)選0～50mM，更優(yōu)選0～30mM的水溶液，或它具有0～0.2，優(yōu)選0～0.12的離子強(qiáng)度，或它具有0～300mS/m，優(yōu)選0～200mS/m，更優(yōu)選于0～150mS/m的電導(dǎo)率。
生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是指所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)在水溶液中沒有明顯凈電荷的pH值。等電點(diǎn)可用本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的方法測(cè)定，例如，通過等電聚焦的方法，該方法中使生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)在不同pH水平的溶液中電泳，測(cè)定蛋白不遷移的pH。等于或低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH優(yōu)選是低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH。
本發(fā)明方法中，當(dāng)雜質(zhì)是DNA分子時(shí)，優(yōu)選將pH調(diào)到等于或低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的水平，以便所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)帶正電荷，而所述DNA分子帶負(fù)電荷。
一般說來(lái)，DNA有很強(qiáng)的負(fù)離子電荷，這些電荷由骨架中的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生(核酸內(nèi)強(qiáng)酸性磷酸二酯鍵內(nèi)發(fā)現(xiàn)的磷酸基團(tuán)具有大約1的pK值)。由于這個(gè)原因，DNA在任何pH下都能帶上負(fù)電荷，因此使用等于或低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的范圍內(nèi)的期望pH是可能的。由于所需的pH水平在不同類型的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)中將是不同的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可用已知的方法，例如，按下面實(shí)施例部分所述的，通過制備多種不同pH的樣品并測(cè)量他們的參數(shù)如％DNA去除和％蛋白質(zhì)回收，選擇等于或低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的范圍內(nèi)的所需pH水平。這樣的pH通常為pH2.0或更高，優(yōu)選pH3.0或更高，尤其優(yōu)選pH4.0或更高。
要證實(shí)DNA分子是否帶負(fù)電荷，可以采用已知的方法，如使用電泳滴定曲線法的那些(ETC)(見Ion Exchange Chromatography Principlesand Methods，Pharmacia(latterly Amersham Biosciences)，pp.52-56)。
此外，在本發(fā)明方法中，還可以使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品形成低電導(dǎo)率的酸性或堿性水溶液，接著用緩沖液調(diào)節(jié)所得樣品至等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過一種方法去除含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中的雜質(zhì)，所述方法包括步驟1)使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品形成低電導(dǎo)率的酸性或堿性水溶液；2)用緩沖液調(diào)節(jié)所得樣品至等于或低于所述生理學(xué)上活性的蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH；3)去除產(chǎn)生的顆粒。
通過本發(fā)明方法去除的雜質(zhì)如上面所述。
如本文所用的，術(shù)語(yǔ)“低電導(dǎo)率的酸性水溶液”意思是指pH2.0至pH3.9，優(yōu)選pH2.0至3.0的水溶液，它具有0至100mM，優(yōu)選0至50mM，更優(yōu)選0至30mM的摩爾濃度，或者它具有0至0.2，優(yōu)選0至0.12的離子強(qiáng)度，或者它具有0至300mS/m，優(yōu)選0至200mS/m，更優(yōu)選0至150mS/m的電導(dǎo)率。所述酸性水溶液可以從鹽酸水溶液、檸檬酸水溶液、醋酸水溶液和其它酸的水溶液中選擇。低電導(dǎo)率的酸性水溶液的種類、電導(dǎo)率和pH將取決于要被純化的生理學(xué)上活性的蛋白質(zhì)或抗體的種類而變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將輕易確定本文所述初步試驗(yàn)中這些參數(shù)的最佳條件。
同樣地，本文所用的術(shù)語(yǔ)“低電導(dǎo)率的堿性水溶液”通常意思是指pH7.5至pH13的水溶液，它具有0至100mM，優(yōu)選0至50mM，更優(yōu)選0至30mM的摩爾濃度，或者它具有0至0.2，優(yōu)選0至0.12的離子強(qiáng)度，或者它具有0至300mS/m，優(yōu)選0至200mS/m，更優(yōu)選0至150mS/m的電導(dǎo)率。這種溶液的pH將取決于要被純化的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)或抗體的種類而變化。
在本發(fā)明方法中，使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品形成低電導(dǎo)率的酸性或堿性水溶液后，用緩沖液調(diào)節(jié)所得樣品至等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH。緩沖液的例子包括Tris-HCl、磷酸鹽、Tris、磷酸氫二鈉和氫氧化鈉。
另外，在本發(fā)明中，在某些情況例如當(dāng)生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是抗體時(shí)，通常使含有抗體的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)A或G上的親和層析，并用低電導(dǎo)率的酸性水溶液洗脫，然后用緩沖液調(diào)節(jié)所得洗脫物至等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的范圍內(nèi)的期望pH。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過一種方法去除含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中的雜質(zhì)，所述方法包括步驟1)使含有抗體的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)A或G上的親和層析，并用低電導(dǎo)率的酸性水溶液洗脫樣品；2)用緩沖液調(diào)節(jié)所得洗脫物至等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH；3)去除產(chǎn)生的顆粒。
通過本發(fā)明方法去除的雜質(zhì)如上面所述。
本方法中所采用的低電導(dǎo)率的酸性水溶液可以是上面列舉的那些中的任何一種。緩沖液的例子包括Tris-HCl、磷酸鹽、Tris、磷酸氫二鈉和氫氧化鈉。
在本發(fā)明方法中，在上面的步驟中被調(diào)節(jié)到等于或低于生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH的溶液，依次，產(chǎn)生顆粒(即形成霧狀)。這些顆?？梢酝ㄟ^濾器過濾而被除去，以確保有效去除雜質(zhì)如DNA污染物。適用于過濾的濾器的例子包括，但不限于，1.0～0.2μm醋酸纖維素濾器系統(tǒng)(Corning)或TFF。
或者，這些顆粒也可以通過離心或其它任何用于有效的顆粒去除的技術(shù)被去除；去除方法不限于用濾器過濾。
沒有被任何特定理論所束縛，本發(fā)明的發(fā)明者估計(jì)當(dāng)雜質(zhì)是DNA分子時(shí)，這些顆粒的每一種是生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)和DNA之間形成的偶聯(lián)物。他們還估計(jì)當(dāng)pH被調(diào)節(jié)到低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，所述蛋白質(zhì)帶正電荷，而DNA分子帶負(fù)電荷，導(dǎo)致DNA和蛋白質(zhì)之間的偶聯(lián)。另外，向低電導(dǎo)率的水溶液的轉(zhuǎn)化將進(jìn)一步增強(qiáng)偶聯(lián)。通過過濾去除顆粒導(dǎo)致生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的丟失少，因?yàn)樗訢NA-生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的形式被去除。但是，這樣小的丟失僅占生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)總量的少數(shù)百分比，約百分之九十的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)可被回收，如下面的本發(fā)明的發(fā)明者還估計(jì)，由于DNA-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物被形成于柱樹脂上，單獨(dú)蛋白質(zhì)A/G柱層析可能不足以確保DNA污染物和生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的有效分離。通過陽(yáng)離子交換層析、陰離子交換層析、羥基磷灰石層析或它們的組合進(jìn)一步純化后，因此純化的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)適用作藥物制劑。
定量DNA試驗(yàn)可通過，但不限于，在試驗(yàn)之前與DNA提取結(jié)合的閾值總DNA試驗(yàn)來(lái)完成。
定量病毒試驗(yàn)可通過，但不限于，TCID50(組織培養(yǎng)感染劑量(50％))試驗(yàn)來(lái)完成，TCID50試驗(yàn)通過檢測(cè)細(xì)胞中的病毒感染性，結(jié)合允許測(cè)定組分中病毒量的RT/Q-PCR和Q-PCR來(lái)測(cè)量。
本發(fā)明現(xiàn)在將被進(jìn)一步描述在下面的實(shí)施例中，不想使這些實(shí)施例限制本發(fā)明的范圍?；谠敿?xì)說明，對(duì)本技術(shù)領(lǐng)域人員來(lái)說，不同的改變和修飾是顯而易見的，這類改變和修飾落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
實(shí)施例實(shí)施例1在純化hPM-1(人源化抗IL-6受體抗體)中用于蛋白質(zhì)A親和層析的緩沖液組成的研究1.1試驗(yàn)程序(1)試驗(yàn)材料(含有抗體的樣品)
含有生產(chǎn)hPM-1抗體的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基(此后縮寫為CM)的樣品，它被離心以去除所述細(xì)胞，并保存于-80℃，通過0.22μm醋酸纖維素(縮寫為CA)過濾系統(tǒng)(CORNING)過濾，并用作純化研究的試驗(yàn)樣品。用國(guó)際公開No.WO92/19759實(shí)施例10中所顯示的人延伸因子Ia啟動(dòng)子(等電點(diǎn)pH9.0)，按JP KOKAI 08-99902參考實(shí)施例2中所描述的制備了hPM-1抗體。
(2)用于檢測(cè)的儀器用于HCl洗脫物HPLCL-6200智能泵(HITACHI)L-4200UV-VIS檢測(cè)儀(HITACHI)D-2500色譜積分儀(HITACHI)柱 HR5/2(Pharmacia)，5mm I.D.×20mm H介質(zhì)POROS 50A(PerSeptive)，0.4mlLot；A250-039，Code；SPECIAL用干顆粒HPLCWaters PrepLC4000系統(tǒng)(Waters)Waters2000系統(tǒng)控制器(Waters)Waters486可調(diào)的吸收檢測(cè)儀(Waters)Waters741數(shù)據(jù)組件(Waters)分光光度計(jì)U-2000(HITACHI)柱XK26(Pharmacia)，26mm I.D.×100mm H介質(zhì) POROS 50A(PerSeptive)，53mlLot；A250-039，Code；SPECIAL(3)分析與檢測(cè)hPM-1檢測(cè)用線性梯度在PLRP-S柱(Polymer Laboratories)上通過反向HPLC檢測(cè)hPM-1。
DNA檢測(cè)通過閾值總DNA試驗(yàn)測(cè)定DNA。在檢測(cè)之前，進(jìn)行DNA抽提(例如，使用DNA抽提試劑盒，Wako Pure Chemicals Industries，Ltd.)。同樣，用閾值總DNA試驗(yàn)試劑盒(Molecular Devices)進(jìn)行測(cè)量。
濁度測(cè)定法通過用分光光度計(jì)U-2000(HITACHI)測(cè)量其在660nm處的吸收監(jiān)測(cè)每種試驗(yàn)樣品的顆粒形成。
1.2.洗脫條件的研究通過測(cè)定hPM-1的％回收和通過洗脫的DNA去除，以用于蛋白質(zhì)A親和層析中的不同緩沖液組合物研究了洗脫條件。使上述含有抗體的樣品按下面表1的條件進(jìn)行上柱。蛋白質(zhì)A樹脂用表1中所示的平衡緩沖液平衡，然后負(fù)載上述含有抗體的樣品，接著進(jìn)行洗滌1，洗滌2，和洗脫。以A280nm監(jiān)測(cè)洗脫譜，以分離蛋白質(zhì)峰。在該表中，C-P緩沖液是指檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液。
表1

沒有觀察到洗脫方法1、2和3色譜之間的差別每種洗脫組分用300mM Tris溶液被調(diào)節(jié)至pH7.0，表明用HCl洗脫(方法2和3)的組分中產(chǎn)生了顆粒。進(jìn)行了進(jìn)一步研究以測(cè)定顆粒形成與hPM-1的％回收或殘余DNA的量之間的相關(guān)性。
為研究顆粒相關(guān)性，來(lái)自洗脫方法2的HCl洗脫物被補(bǔ)充有NaCl，然后進(jìn)行NaCl濃度(0mM、50mM、100mM)與不同因素之間的相關(guān)性分析。在NaCl濃度與不同因素之間相關(guān)性的分析中，過濾和未過濾的樣品按如下方法制備每種補(bǔ)充有NaCl的蛋白質(zhì)A洗脫組分用300mMTris溶液被調(diào)節(jié)至pH7.0，然后通過0.22μm CA過濾器過濾或者不過濾。測(cè)定所述過濾和未過濾樣品的hPM-1的％回收(僅用于過濾的樣品)和殘余DNA的量。
1.3.％回收測(cè)定了單個(gè)洗脫方法的hPM-1的％回收。結(jié)果，洗脫方法1的％回收高達(dá)98.6％。形成對(duì)比的是，洗脫方法2中的％回收在83.8％到97.1％之間，洗脫方法3中的％回收在83.5％至93.7％之間，估計(jì)這些變異是由于研究規(guī)模小(樹脂體積0.4ml)引起的。當(dāng)增加純化規(guī)模時(shí)，證實(shí)hPM-1的％回收穩(wěn)定在90％或更高(洗脫方法2)。因此，還發(fā)現(xiàn)即便在HCl洗脫中，hPM-1的％回收仍然高。
1.4.HCl洗脫物中NaCl濃度和不同因素之間的相關(guān)性表2總結(jié)了HCl洗脫物中NaCl濃度和不同因素之間的相關(guān)性分析。
表2

對(duì)于經(jīng)過濾的樣品，hPM-1的％回收在100mM NaCl時(shí)為88％，在50mM NaCl時(shí)為86％，以及在0mM NaCl時(shí)為81％。在過濾和未過濾的樣品中，在0mM NaCl時(shí)，殘余DNA的量低。特別是，補(bǔ)充有0mM NaCl的過濾的樣品具有非常低的DNA含量，為11pg DNA/mg hPM-1。
具有更高濁度的pH調(diào)節(jié)的樣品過濾后趨向于提供更低的hPM-1的％回收和更少量的殘余DNA。這一結(jié)果提示hPM-1和DNA都參與顆粒形成的高可能性。據(jù)估計(jì)，通過將pH調(diào)節(jié)至7.0，hPM-1和DNA可能相互作用形成顆粒。為獲得更高的hPM-1的％回收，優(yōu)選增加HCl洗脫物中的NaCl濃度。為了降低殘余DNA的量，另一方面，將NaCl補(bǔ)充物排入HCl洗脫物中是可期望的。
實(shí)施例2人源化抗PTHrP抗體的純化含有人源化抗PTHrP抗體的樣品(來(lái)源于CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基，經(jīng)0.45和0.2μm CA SARTOBRAN P濾器(sartorius)過濾)按下面所示的條件通過蛋白質(zhì)A親和柱層析純化，如國(guó)際公開No.WO98/13388中描述的制備了抗PTHrP抗體(等電點(diǎn)pH8.3)。
2.1.實(shí)驗(yàn)條件純化儀器AKTA explorer(Amersham Pharmacia Biotech)柱HR5/5，C10，XK-26(Amersham Pharmacia Biotech)樹脂rProtein A Sepharose Fast Flow加樣培養(yǎng)基(pH6.6至pH7.5)直接加樣洗脫組分的調(diào)節(jié)洗脫組分用1M Tris水溶液調(diào)節(jié)至不同的pH水平，然后通過0.2μm醋酸纖維素(以后縮寫為CA)過濾去除DNA(條件在下面(1))中進(jìn)行研究。
Protein A柱用含150mM NaCl的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)進(jìn)行充分平衡，隨后用前述含抗體的培養(yǎng)基上樣。隨后，柱用含150mMNaCl的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)洗滌以去除未結(jié)合的雜質(zhì)，進(jìn)一步用檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)洗滌以降低電導(dǎo)率，然后用20mM含水檸檬酸洗脫。以A280nm監(jiān)測(cè)洗脫譜以分離蛋白質(zhì)峰。該蛋白質(zhì)A洗脫組分被用于下面的條件研究。
2.2.洗脫物中殘余DNA去除條件的研究為保證有效地去除殘余的DNA，研究了通過濾器過濾的最佳pH。蛋白質(zhì)A洗脫組分用1.0M Tris水溶液調(diào)節(jié)至以下pH水平2.7(未調(diào)節(jié))、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。隨后，讓每個(gè)樣品放置一段時(shí)間，通過0.22μm CA濾器進(jìn)行過濾，然后用1.0M Tris水溶液調(diào)節(jié)至pH7，接著進(jìn)行DNA檢測(cè)。表3列出了所研究的pH水平和放置時(shí)間，以及殘余DNA的量。
表3殘留DNA的去除(單位pg/mL)

(培養(yǎng)基中的DNA6,637,200pg/mL；未過濾樣品中的DNA25，110pg/mL)如表中所示，在pH5.5和pH6.0時(shí)，在讓樣品放置0、6和24小時(shí)的全部情況中，殘留DNA的量低于檢測(cè)限。另外，pH5.5和pH6.0左右，殘余DNA的去除達(dá)到了峰，而在更高和更低的pH水平觀察到了降低的DNA去除的功效。
實(shí)施例3人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體的純化在下面表4中所示的條件下，通過蛋白質(zhì)A親和柱層析純化了含有人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體的樣品(來(lái)源于CHO細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基)。抗HM1.24抗原單克隆抗體按照國(guó)際公開No.WO98/14580中所述進(jìn)行制備(等電點(diǎn)pH9.0)。
3.1.實(shí)驗(yàn)條件柱rProtein A FF，5mL(16mm ID×25mm H)流速5mL/min(150cm/h)樣品培養(yǎng)基直接加樣表4

用含有150mM NaCl的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)充分平衡蛋白質(zhì)A柱，然后用上述含有抗體的培養(yǎng)基上樣。然后，用含有150mMNaCl的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)洗柱，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)，用檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液(pH7.5)進(jìn)一步洗滌以降低電導(dǎo)率，然后用20mM含水檸檬酸洗脫。以A280nm監(jiān)測(cè)洗脫譜以分離蛋白質(zhì)峰，該蛋白質(zhì)A洗脫組分被用于下面的條件研究。
3.2洗脫物中殘余DNA去除條件的研究為保證殘余DNA的有效去除，研究了通過濾器過濾的最佳pH。用1.0M Tris水溶液將蛋白A洗脫組分調(diào)節(jié)到下列pH水平(pH＝4.5-7.5)。隨后，讓每個(gè)樣品放置一段時(shí)間，通過0.22μm CA濾器過濾，然后用1.0M的Tris水溶液調(diào)節(jié)至pH7，接著進(jìn)行DNA測(cè)定以及用于測(cè)定人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體的反向HPLC。表5顯示了DNA檢測(cè)的結(jié)果，而表6顯示了人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體的收率。
表5殘余DNA的去除(單位pg/ml)實(shí)驗(yàn)1

(培養(yǎng)基中的DNA235200pg/ml)實(shí)驗(yàn)2

(培養(yǎng)基中的DNA5448000pg/ml；未過濾樣品中的DNA4330pg/ml)表6通過過濾人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體的％回收

雖然通過蛋白質(zhì)A親和層析純化的樣品仍含有豐富的DNA，實(shí)驗(yàn)1表明，DNA的量隨pH以pH7.5、pH6.5和pH5.5的次序降低而減少，以及在0小時(shí)比在6小時(shí)去除更多DNA的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)2中，在pH＝4.5、5.0和5.5的條件下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)，表明無(wú)論測(cè)試范圍內(nèi)的pH值和放置時(shí)間，都充分去除DNA至相同程度。另外，％回收的計(jì)算表明人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體的少許損失。
實(shí)施例4粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的純化含有G-CSF的樣品(來(lái)源于CHO細(xì)胞培養(yǎng)物；ChugaiPharmaceutical Co.，Ltd.)被用于下面的條件研究(等電點(diǎn)pH5.5-5.7)。
4.1.洗脫物中殘余DNA去除條件的研究為了確保有效去除殘余DNA，研究了通過濾器過濾的最佳pH。將含有G-CSF的樣品稀釋于低電導(dǎo)率的酸性溶液(2.5mM含水HCl)中，并用20％鹽酸進(jìn)一步形成低電導(dǎo)率的酸性水溶液，然后加入樣品DNA。利用1.0M Tris水溶液調(diào)節(jié)如此處理的含有G-CSF的樣品至下面的pH水平(pH＝4.3或6.6)，然后通過0.22μm CA濾器過濾。接著，對(duì)過濾及未過濾的組分進(jìn)行DNA測(cè)定。表7顯示了DNA測(cè)定的結(jié)果。
表7殘余DNA的去除(單位pg/ml)

該研究證實(shí)，當(dāng)在pH4.3過濾樣品時(shí)，富含DNA的含有G-CSF的樣品中的DNA的有效去除，即，殘余DNA的量低于所述試驗(yàn)的檢測(cè)限。
例5病毒去除對(duì)hPM-1(人源化抗IL-6受體抗體)純化的影響5.1實(shí)驗(yàn)材料(含有抗體的樣品)含有產(chǎn)生hPM-1抗體(人源化IL-6受體抗體)的CHO細(xì)胞培養(yǎng)基(CM)的樣品，它經(jīng)離心以去除所述細(xì)胞，并儲(chǔ)存在-80℃，分別補(bǔ)充有X-MuLV、Reo3和MVM，然后通過0.45μm的濾器(Bottle TOP Filter，CORNING)過濾，用作純化研究的試驗(yàn)樣品。如實(shí)施例1中所述制備了hPM-1抗體。用于研究的病毒各自從ATCC(美國(guó)典型培養(yǎng)物中心)獲得。
5.2通過rProtein柱層析純化通過rProtein柱層析純化了在5.1中制備的補(bǔ)充有病毒的樣品。詳細(xì)條件顯示如下樹脂rProteinA Sepharose Fast Flow儀器AKTA explorer100，AKTApurifier柱XK16/20，XK16/40
樹脂高度11.5cm洗脫條件平衡1mol/L NaCl，20mmol/L C-P緩沖液，pH7.5±0.2，電導(dǎo)率8.5±0.5S/m洗滌11mol/L NaCl，20mmol/L C-P緩沖液，pH7.5±0.2，電導(dǎo)率8.5±0.5S/m洗滌210mmol/L C-P緩沖液，pH7.7±0.2，電導(dǎo)率165±20mS/m洗脫2.5mmol/L HCl，pH2.7±0.2，電導(dǎo)率107±10mS/m5.3低pH處理5.2中得到的洗脫組分用1mol/L鹽酸被調(diào)節(jié)至pH3.2±0.1，并在15±5℃放置30分鐘或更長(zhǎng)，然后，用300mmol/L Tris溶液調(diào)節(jié)多個(gè)洗脫組分至pH7.2±0.1，然后用過濾單元在0.03±0.01MPa壓力下過濾所述組分的40.0mL，所述過濾單元裝配有與第一側(cè)面(the primaryside)連接的玻璃纖維過濾器(Millipore)(0.2μm，PALL)，和與第二側(cè)面(the secondary side)連接的BioInert(0.2μm，PALL)(裝配有φ15mm調(diào)節(jié)器的PALL過濾器支架)。
5.4病毒的檢測(cè)所有收集的樣品通過TCID50試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定。在對(duì)X-MuLV和MVM的清除能力試驗(yàn)中，不但利用TCID50試驗(yàn)檢測(cè)這些病毒，TCID50試驗(yàn)是通過檢測(cè)細(xì)胞中的病毒感染性測(cè)定的，而且利用RT/Q-PCR和Q-PCR檢測(cè)這些病毒，RT/Q-PCR和Q-PCR允許組分中病毒量的測(cè)定。
5.5結(jié)果下表中顯示了5.4中檢測(cè)的結(jié)果表8病毒滴度(TICD50試驗(yàn)Log10/mL)

表9病毒滴度(PCRLog10拷貝/5μL)

如上表所示，本發(fā)明的純化過程對(duì)所有試驗(yàn)的病毒，都獲得了很高的LRVs(對(duì)數(shù)減少值)，并且本研究證實(shí)，經(jīng)低pH處理和過濾后，病毒量被去除到低于所述試驗(yàn)檢測(cè)限的水平。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明方法能以非常簡(jiǎn)單的方式有效去除雜質(zhì)，例如DNA污染物和病毒，并在純化生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)，特別是抗體中顯著有利。當(dāng)雜質(zhì)是DNA分子時(shí)，所述方法獲得很低的DNA濃度(例如，22.5pg/ml)，而當(dāng)雜質(zhì)是病毒時(shí)，它獲得很低的病毒滴度(例如，1.03(用log10/mL表示)，如通過TCID50試驗(yàn)測(cè)定)。本發(fā)明方法還能使成本降低并在這一領(lǐng)域中具有巨大意義。
權(quán)利要求
1.去除含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中雜質(zhì)的方法，該方法包括步驟1)使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品形成低電導(dǎo)率和等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH的水溶液；和2)去除產(chǎn)生的顆粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述低電導(dǎo)率的水溶液具有以摩爾濃度表示的0至100mM的電導(dǎo)率。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述低電導(dǎo)率的水溶液具有0至0.2的離子強(qiáng)度。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述低電導(dǎo)率的水溶液具有0至300mS/m的電導(dǎo)率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述水溶液選自鹽酸水溶液、檸檬酸水溶液和醋酸水溶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述水溶液的pH等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)并等于或高于pH2.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述雜質(zhì)是DNA污染物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其中所述雜質(zhì)是病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品經(jīng)過去除DNA污染物的處理后具有22.5pg/ml或更低的DNA濃度的DNA污染物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述抗體是IgG抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求10或11的方法，其中所述抗體是人源化單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是人源化抗IL-6受體抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是人源化抗HM1.24抗原單克隆抗體。
15.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述抗體是人源化抗甲狀旁腺激素相關(guān)肽抗體(抗PTHrP抗體)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)的方法，其中所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是粒細(xì)胞集落刺激因子。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述顆粒通過濾器過濾被去除。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中步驟1)通過使含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品形成低電導(dǎo)率的酸性或堿性水溶液，并且用緩沖液調(diào)節(jié)所得樣品至等于或低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的pH來(lái)完成。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)是抗體，和其中步驟1)通過使含所述抗體的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)A或G上的親和層析，用低電導(dǎo)率的酸性水溶液洗脫所述樣品，并用緩沖液調(diào)節(jié)所得洗脫物至等于或低于所述抗體的等電點(diǎn)的pH來(lái)完成。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19的方法，其中所述緩沖液是Tris水溶液。
21.可通過權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的方法獲得的純化的生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)。
22.一種生產(chǎn)醫(yī)療蛋白質(zhì)制劑的方法，該方法包括純化步驟，該純化步驟中使用權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)的方法。
全文摘要
問題提供一種純化生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)(尤其是抗體)的方法，由此通過簡(jiǎn)單方法確實(shí)能去除雜質(zhì)如DNA污染物和病毒，該方法成本低、生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的損失少。解決手段去除含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)的樣品中雜質(zhì)的方法，該方法包括以下步驟1)制備在低于所述生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的pH值下具有電導(dǎo)率的含有生理學(xué)上活性蛋白質(zhì)樣品的水溶液；和2)去除由此形成的顆粒。
文檔編號(hào)C07K16/00GK1681837SQ0382168
公開日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月11日
發(fā)明者竹田浩三, 越智教道, 石井公惠, 松橋?qū)W, 今村曉則 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社