專利名稱：免疫球蛋白的純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體制備領(lǐng)域，尤其是涉及對抗體進行離析和/或分離的分離基質(zhì)。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明的分離基質(zhì)的色譜柱、采用所述分離基質(zhì)分離抗體的方法、以及從原料中進行大規(guī)模純化抗體的多步驟工藝。
背景免疫系統(tǒng)由很多相互依賴的細(xì)胞類型組成，所述細(xì)胞共同保護機體免受細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒的感染，以及防止腫瘤細(xì)胞的生長。免疫系統(tǒng)的衛(wèi)士為在宿主的血液中不斷漫游的巨噬細(xì)胞。當(dāng)受到感染或免疫激活時，巨噬系統(tǒng)通過吞噬標(biāo)記有被稱為抗原的外來分子的入侵者而產(chǎn)生響應(yīng)。由T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的該現(xiàn)象引發(fā)一連串復(fù)雜的應(yīng)答，其導(dǎo)致B細(xì)胞的激活。而這些B細(xì)胞又產(chǎn)生稱為抗體的蛋白，所述蛋白與外來入侵者結(jié)合?？贵w和抗原之間的結(jié)合標(biāo)志著通過吞噬作用或補體系統(tǒng)的活化導(dǎo)致外來入侵者被破環(huán)。存在有五種不同類型的抗體或免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。它們不僅生理作用不同而且它們的結(jié)構(gòu)也不同。從結(jié)構(gòu)角度而言，IgG抗體為被廣泛研究的一類特殊的免疫球蛋白，其可能是由于它們在成熟免疫應(yīng)答中起著顯著作用。
目前在一系列不同的人和獸醫(yī)診斷、衛(wèi)生保健和治療應(yīng)用中對免疫球蛋白的生物活性進行了研究。事實上，在最近的幾年中，單克隆抗體和重組抗體結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為目前臨床試驗中研究的最大一類蛋白，并且FDA批準(zhǔn)其用于治療和診斷。作為對表達(dá)系統(tǒng)和生產(chǎn)策略的補充，設(shè)計純化方案以簡單、低成本的方式獲得高純度的抗體。
分離免疫球蛋白的傳統(tǒng)方法基于對包括免疫球蛋白的蛋白組分的選擇性可逆沉淀，同時將其它蛋白組分留在溶液中。典型的沉淀劑為乙醇、聚乙二醇、易溶的即抗無序的鹽，例如硫酸銨和磷酸鉀、以及辛酸。典型地，這些沉淀方法得到非常不純的產(chǎn)物，同時耗時、耗力。而且，向原材料中加入沉淀劑使得很難將上清液用于其他目的，從而產(chǎn)生了處理的問題，就大規(guī)模純化免疫球蛋白而言，該問題尤為重要。
離子交換色譜法是一種公知的蛋白分級方法，常用于分離免疫球蛋白。然而，由于帶電的離子交換配體會與所有帶有相反電荷的化合物反應(yīng)，因此，離子交換色譜的選擇性可能會低于其它的色譜分離。
疏水作用色譜法(HIC)是另一種用于分離免疫球蛋白的方法。但是，疏水基質(zhì)要求向原材料中加入易溶鹽，從而有效結(jié)合免疫球蛋白。以連續(xù)或逐步的梯度降低易溶鹽的濃度，所結(jié)合的抗體從基質(zhì)上釋放。如果要求高純度的產(chǎn)品，推薦采用該疏水作用色譜法并結(jié)合進一步的步驟。由此，該方法的一個缺點是需要向原材料中加入易溶鹽，由此向大規(guī)模用戶提出了一個問題而且增加了成本。對于除了細(xì)胞培養(yǎng)上清液之外的原材料，例如乳清、血漿和蛋黃，向原材料中加入易溶鹽在很多情況下在大規(guī)模應(yīng)用中是不允許的，其原因是，所述鹽可能阻止了不含免疫球蛋白的原材料的任意經(jīng)濟上可行的應(yīng)用。大規(guī)模應(yīng)用的一個額外問題是幾千升廢物的處理。
嗜硫吸附色譜法是由J.Porath在1985年(J.Porath等；FBBSLetters，第185卷，第306頁，1985)引入的一種新的用于分離免疫球蛋白的色譜吸附法。在該篇論文中，描述了在0.5M硫酸鉀即易溶鹽的存在下二乙烯砜活化的瓊脂糖如何顯示與免疫球蛋白的特異性結(jié)合，所述瓊脂糖偶聯(lián)有包括游離巰基的不同配體。盡管所描述的用于嗜硫吸附色譜法的基質(zhì)通常顯示了良好的性能，但是由于向原材料中加入易溶鹽以確保免疫球蛋白的有效結(jié)合，會產(chǎn)生上文所述的缺點。
親和色譜法在分離技術(shù)中具有獨特、有效的作用，因為這是唯一一種能夠基于生物功能或各自的化學(xué)結(jié)構(gòu)從而對生物分子進行純化的技術(shù)。高選擇性和高效能使得該技術(shù)理想地適合于將特定物質(zhì)從復(fù)雜的生物混合物中分離出來。在親和色譜法中，待純化的分子被共價連接至不溶支持物上的配體特異性地、可逆地結(jié)合，所述配體包括互補結(jié)合物質(zhì)。在有利于其與所述固定配體特異性結(jié)合的條件下加入樣品。未結(jié)合的物質(zhì)被洗掉，通過將試驗條件改變至有利于其解吸的情況下，可以回收感興趣的物質(zhì)。親和色譜法具有濃縮的效果，其能夠?qū)Υ篌w積的樣品進行非常便利的處理。蛋白A和蛋白G親和色譜法是分離和純化免疫球蛋白的常見而廣泛采用的方法，尤其是分離單克隆抗體，其主要原因是使用方便以及獲得的高純度。
1982年，Colbert等描述了一種蛋白A類材料的基因編碼。在US5151350中，第一次描述了對所述基因的成功克隆和表達(dá)。該基因的克隆及其核苷酸序列的表征使得本領(lǐng)域技術(shù)人員獲得一定量的蛋白A類材料核苷酸序列，從而在不同宿主-病媒系統(tǒng)中進行克隆。所述重組生產(chǎn)的蛋白A類材料及其亞片段具有蛋白A結(jié)合IgG的Fc區(qū)域以及激活多克隆抗體合成的特性。因此，這些物質(zhì)以與蛋白A相同的方式用于色譜法中。在制藥工業(yè)中，重組蛋白A色譜法的一個明顯優(yōu)勢是消除了分離基質(zhì)中含有哺乳動物殘余物的風(fēng)險，以及由此的藥物產(chǎn)品中含有哺乳動物殘余物的風(fēng)險。
US6399750公開了一種結(jié)合IgG的介質(zhì)，尤其是具有基本基質(zhì)和基質(zhì)結(jié)合基團的分離介質(zhì)，所述基團為含有半胱氨酸的重組蛋白A(rProtein A)。該基團的公式為-B-X-rProtein A，其中B為連接基本基質(zhì)的橋，X包括來自rProtein A的雜原子N或S。在一優(yōu)選實施方式中，X為構(gòu)成硫來源的硫醚，C端殘基為rProtein A的半胱氨酸。
市場上具有各種蛋白A色譜產(chǎn)品。例如，Millipore(Billerca，Mass.，USA)提供了用來自金黃色葡萄球菌的蛋白A制成的天然Prosep-A High Capacity，以及采用在大腸桿菌Escherichiacoli中表達(dá)的重組蛋白A制成的PROSEP-rPA High Capacity。PROSEP基質(zhì)由具有互連小孔的玻璃顆粒構(gòu)成。
McCue等(Journal of Chromatography A，989(2003)139-153“Evaluation of protein A chromatography media”)研究了兩種具有不同孔徑大小的蛋白A介質(zhì)，每種均具有多孔玻璃骨架。較小孔徑的材料發(fā)現(xiàn)具有較大的靜態(tài)容量，其提示其原因是具有更大的比表面積以及伴隨的更高配體濃度。較小孔徑的材料還發(fā)現(xiàn)具有更大的動態(tài)結(jié)合能力。
MabSelectTM為Amersham Biosciences(Uppsala，瑞典)的蛋白A的色譜產(chǎn)品，尤其適用于從大體積的原料中捕獲單克隆抗體。所述配體包括通過C末端半胱氨酸偶聯(lián)至交聯(lián)瓊脂糖支持物上的重組蛋白A。MabSelectTM的顆粒中位數(shù)直徑為85um。
WO2004/074211(Amershanm Biosciences AB)涉及一種制備無機顆粒的方法，所述顆粒具有分級的孔結(jié)構(gòu)。因此，該方法不生產(chǎn)有機顆粒，例如碳水化合物顆粒。
US5672276(BioSepra Inc)涉及改進的多孔固體支撐物以及該支撐物的制備方法和應(yīng)用。尤其是，公開了鈍化的多孔聚合物支撐物，其特征在于可逆的高吸收能力，而且基本沒有生物分子的非特異性吸附或者相互作用。種類繁多的非鈍化多孔固體基質(zhì)可以如US5672276中所述進行鈍化。這些多孔基質(zhì)包括(i)無機氧化物支撐物，(ii)“穩(wěn)定化的”無機氧化物支撐物，通過在表面涂覆疏水聚合物的薄保護層從而防止化學(xué)侵析，以及(iii)由有機/聚合物材料單獨構(gòu)成的多孔基質(zhì)，尤其是疏水聚合物。US5672276中描述了由多糖衍生物例如瓊脂糖、葡聚糖和纖維素等衍生物制成的有機離子交換劑具有很多的不足。例如，多糖衍生的離子交換劑在機械強度上不是很穩(wěn)定，不能抗強酸。因此，根據(jù)該參考文獻的經(jīng)鈍化的多孔介質(zhì)被描述與多糖例如碳水化合物材料不同。
最后，Meyer等在“Templating of porous polymeric beads toform porous silica and titania spheres”(Adv.Mater 2002(14)，第23期，第1768-72頁)中描述了無機顆粒。因此，在該參考文獻中沒有公開其上偶聯(lián)有結(jié)合抗體的蛋白配體的碳水化合物顆粒。
然而，不管現(xiàn)有技術(shù)如何，仍然需要另一種分離基質(zhì)以分離抗體或抗體結(jié)構(gòu)，其符合純度、安全性、效能和成本效益的要求。
附圖的簡要描述附

圖1為一示意圖，其中顯示動態(tài)結(jié)合能力(DBC)為根據(jù)本發(fā)明的分離介質(zhì)的保留時間的函數(shù)。為了比較，同時顯示了一個現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品的動態(tài)結(jié)合能力。
本發(fā)明的簡要描述本發(fā)明的一方面是一種分離多克隆或單克隆抗體的新的分離基質(zhì)。其可以通過權(quán)利要求所述實現(xiàn)。
本發(fā)明的另一方面為允許對抗體進行比現(xiàn)有技術(shù)更快速、更有效的純化的分離基質(zhì)。其可以通過所附權(quán)利要求限定的新的分離基質(zhì)來實現(xiàn)，當(dāng)其用于色譜法中時，其結(jié)合能力顯著提高。
本發(fā)明的另一方面為如上所述的分離基質(zhì)，其適于大規(guī)模的操作。更加特殊的方面是所述分離基質(zhì)，其對原料具有顯著提高的結(jié)合能力。
本發(fā)明的另一方面是裝有或填充有根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)的色譜柱。
另一方面是試劑盒，其包括根據(jù)本發(fā)明的色譜柱、適于抗體純化的緩沖液和書面說明。
另一方面是采用根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)將抗體從液體中分離出來的方法。該分離基質(zhì)可以位于根據(jù)本發(fā)明的分離柱中。根據(jù)本發(fā)明的該方法可以用于獲得基本純的特定抗體物質(zhì)，或者獲得已經(jīng)將其中的一種或多種不希望的抗體除去的液體。
通過所附權(quán)利要求和以下描述，本發(fā)明的進一步的實施方式和優(yōu)點將是顯而易見的。
定義本文中，術(shù)語“抗體”或“免疫球蛋白”互換使用。
本文中，術(shù)語“配體”是指能夠與靶化合物例如抗體交互作用的分子或化合物。
本文中，術(shù)語“間隔臂”或“橋”是指將配體與分離基質(zhì)的支撐物間隔開的元件。分離基質(zhì)的支撐物還叫作“基本基質(zhì)”。術(shù)語“分離基質(zhì)”本文中還稱為分離介質(zhì)。
本文中，術(shù)語“抗體結(jié)合蛋白”是指不論結(jié)合機制能夠結(jié)合抗體的蛋白。
術(shù)語“Fc-結(jié)合蛋白”是指能夠結(jié)合抗體的可結(jié)晶部分(Fc)的蛋白，包括例如蛋白A和蛋白G，或其任何保持所述結(jié)合特性的片段或遺傳衍生物或融合蛋白。
術(shù)語“洗脫液”為該領(lǐng)域的常規(guī)含義，即具有適當(dāng)PH和/或離子強度、將一種或多種化學(xué)物從分離基質(zhì)上分離出來的緩沖液。
術(shù)語“Kav”是指凝膠相分布系數(shù)，其是根據(jù)以下公式從對于給定大小的分子的洗脫或保留體積VR(也為Ve)、以及柱的間隙空位體積V0和柱的幾何體積(Vc)計算出的柱的自變量Kav＝(VR-V0)/(Vc-V0)
(參見例如“Handbook of process chromatography，A Guide toOptimization，Scale-Up and Validation”(1997)Academic Press，San Siego.Gail Sofer&Lars Hagel編輯，ISBN0-12-654266-X，368頁)本發(fā)明的詳細(xì)描述第一方面，本發(fā)明涉及由多孔顆粒組成的分離基質(zhì)，該多孔顆粒上固定有抗體結(jié)合蛋白配體，其中對于大小為110kDa的葡聚糖，其表示為Kav的基本基質(zhì)的凝膠相分布系數(shù)大于0.65，中值粒徑為65至84um。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及包括多孔顆粒的分離基質(zhì)，該多孔顆粒上固定有抗體結(jié)合蛋白配體，其中配體密度為5.0-10，中值粒徑為65至84um。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及由多孔顆粒組成的分離基質(zhì)，該多孔顆粒上固定有抗體結(jié)合蛋白配體，其中配體密度為5.0-10mg/ml；對于大小為110kDa的葡聚糖，其表示為Kav的基本基質(zhì)的凝膠相分布系數(shù)大于0.65，中值粒徑為65至84um。
在一個實施方式中，本發(fā)明分離基質(zhì)的配體包括結(jié)合抗體的蛋白，例如蛋白A，G和/或L。在一個實施方式中，所述配體包括Fc結(jié)合蛋白。在最有利的實施方式中，所述Fc結(jié)合蛋白為蛋白A。在最佳實施方式中，所述配體包括非哺乳動物來源的重組蛋白A。在該文中，術(shù)語“包括”蛋白A應(yīng)解釋為包括蛋白A或其功能等同物，其保留了蛋白A結(jié)合IgG的特性。所述重組蛋白A配體可以通過單個或多個連接物偶聯(lián)至顆粒，優(yōu)選通過半胱氨酸。在一替換實施方式中，所述配體包括κ-結(jié)合蛋白，例如蛋白L。
在一特定實施方式中，本發(fā)明分離基質(zhì)的配體包括蛋白A功能結(jié)構(gòu)域的單體、二聚體或多聚體。由此，所述配體可以包括一個或多個域A，B，C，D和E，優(yōu)選域B和/或域C。在一特定實施方式中，所述二聚體或多聚體包括蛋白Z，其為域B的突變形式，參見例如US5143844(Abrahamsen等)。在一有利的實施方式中，其在保持根據(jù)本發(fā)明所獲得的良好結(jié)合能力的同時，有利于定置洗凈(CIP)，所述配體包括一個或多個堿穩(wěn)定的蛋白A功能結(jié)構(gòu)域。由此，在該實施方式中，所述配體包括突變的蛋白，其中一個或多個所述蛋白A結(jié)構(gòu)功能域發(fā)生突變，參見例如WO03/080655(Amersham Biosciences)，該專利通過引用的方式結(jié)合至本文。在一替換實施方式中，配體包括一個或多個蛋白A的域C。該包括堿穩(wěn)定的單聚或多聚配體的分離基質(zhì)很容易由本領(lǐng)域的技術(shù)人員制備得到，例如WO03/080655(AmershamBiosciences)中所述。
在一個替換實施方式中，所述配體為抗體結(jié)合肽。因此，根據(jù)該實施方式的分離基質(zhì)包含固定有抗體結(jié)合蛋白配體的多孔顆粒，其中對于大小為110kDa的葡聚糖，其表示為Kav的基本基質(zhì)的凝膠相分布系數(shù)大于0.65，中值粒徑為65至84um。
所述基本基質(zhì)可以包括由凝膠相分布系數(shù)位于指定值以內(nèi)的任意材料構(gòu)成的多孔顆粒，其動態(tài)結(jié)合能力(DBC)如本文所述顯著提高。在本發(fā)明的另一有利的實施方式中，顆粒即分離基質(zhì)的支撐物由交聯(lián)的碳水化合物材料制成，例如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、konjac、角叉菜多糖、gellan、藻酸鹽等，其很容易通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備得到，例如反懸浮凝膠化(S HjertenBiochim Biophys Acta79(2)，393-398(1964))。在一個實施方式中，所述碳水化合物材料為高度交聯(lián)的瓊脂糖，例如SepharoseTM(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。
在本發(fā)明的最佳實施方式中，所述支撐物為多孔交聯(lián)的瓊脂糖材料，其顯示良好的機械性能，由此允許高速流動而不會產(chǎn)生太高的壓力。在該實施方式中，在凝膠化以前，所述瓊脂糖聚合物已經(jīng)被烯丙基化?？梢愿鶕?jù)US6602990(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)、SE0402322(PCS/SE2005/001408)(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)或SE0501610(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)制備所述瓊脂糖顆粒。在一個有利的實施方式中，顆粒的制備如US6602990中所述，該專利通過引用的方式結(jié)合至本文。簡言之，在形成凝膠之前，將具有一個活化位點和一個非活化位點的雙功能交聯(lián)劑引入瓊脂糖溶液中，并允許其與瓊脂糖的羥基反應(yīng)，由此其化學(xué)結(jié)合于瓊脂糖上。在該方法的第一步中，形成所述多糖的溶液或分散液。然后通過將其水溶液乳化于有機溶劑中形成多糖凝膠，之后激活所述交聯(lián)劑的非活化位點，并與多糖的羥基反應(yīng)。在所述初始交聯(lián)之后，可以通過常規(guī)方法進行進一步的交聯(lián)。
本發(fā)明的分離基質(zhì)的顆粒為多分散的，可以通過范圍為30-140um的粒徑限定，優(yōu)選43-128um，更優(yōu)選70-84um。本領(lǐng)域另一常用的限定粒徑的方式是累積體積分布的中值粒徑(d50v)，對于該分離介質(zhì)而言，其范圍為65-84um，例如大約75um。在另一實施方式中，所述顆粒為單分散的，被限定為粒徑74-76um，例如75um。如本領(lǐng)域所公知的，在過程中很容易控制顆粒大小，從乳液中抽提樣品，在顯微鏡下估計顆粒直徑，接下來調(diào)整攪拌以減小顆粒大小。
根據(jù)本發(fā)明，可以采用任意公知的方法例如環(huán)氧偶合將配體固定至顆粒。在一特定實施方式中，配體密度為5-10mg/ml。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易控制密度，即固定配體的濃度，參見例如Hermanson，GregT.，Mallia，A.Krishna，Smith，Paul K.Immobilized AffinityLigand Techniques，第118頁，Academic Press.ISBN 0-12-342330-9.在該文獻中還描述了蛋白A例如重組蛋白A的固定的特定方法。
因此，在本發(fā)明分離基質(zhì)的一個實施方式中，對于大小為110kDa的葡聚糖，其表示為Kav的顆粒的凝膠相分布系數(shù)大于0.60，優(yōu)選大于0.65。因此，在一個實施方式中，對于大小為110kDa的葡聚糖，其表示為Kav的顆粒的凝膠相分布系數(shù)為0.60-0.90，優(yōu)選0.65-0.85，更優(yōu)選0.65-0.75。本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過調(diào)整固體含量很容易控制所述支撐物的凝膠相分布系數(shù)。采用Kav值而不采用孔徑的準(zhǔn)確值等的原因是，對于水溶膠樣的瓊脂糖，在濕態(tài)下準(zhǔn)確測量孔徑非常難，在水溶膠干燥后估計的孔大小不能真實地反映所述濕的狀態(tài)。
分離基質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力是對分離介質(zhì)是否適合大規(guī)模操作的良好指示，結(jié)合力的增加大大改善了工藝的經(jīng)濟節(jié)約。在一個實施方式中，本發(fā)明為一種分離基質(zhì)，在2.4分鐘的保留時間下，其動態(tài)結(jié)合能力高于40mg抗體/ml分離基質(zhì)。在一特定實施方式中，所述分離基質(zhì)提供了高于35mg/ml分離基質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力，例如在35-50范圍內(nèi)，如大約39-40mg/ml分離基質(zhì)。
因此，如果該分離基質(zhì)與現(xiàn)有技術(shù)例如上述的MabSelectTM產(chǎn)品相比，本發(fā)明的凝膠相分布系數(shù)增加，而顆粒大小降低。即使不是直接相關(guān)，凝膠相分布系數(shù)的增加，即可利用的顆粒體積的增加，通常將伴隨著孔徑的增加。然而，如上所述，McCue等(Journal ofChromatography A，989(2003)139-153“Evaluation of protein Achromatography media”)提出，在所報道的研究中，孔徑的減小增加了動態(tài)結(jié)合能力。因此，本發(fā)明分離基質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力的大幅增加與現(xiàn)有技術(shù)的教導(dǎo)相反，因此是非常出人意料的。
即使本發(fā)明分離基質(zhì)的最優(yōu)選形式是顆粒，但是本發(fā)明也包括其它形式，例如整料、濾片或膜；芯片、表面、毛細(xì)管等。
第二方面，本發(fā)明涉及一包括上述分離基質(zhì)的色譜柱。該柱中含有根據(jù)常規(guī)填充方法填充的基質(zhì)，或裝有以擴展床形式操作的基質(zhì)。對于擴展方式的操作，所述顆粒優(yōu)選提供高密度的填料，如本領(lǐng)域所公知的。在一個有利的實施方式中，所述柱由任意常規(guī)材料例如生物相容塑料構(gòu)成，例如聚丙烯、不銹鋼或玻璃。所述柱可以具有適合于實驗室或大規(guī)模純化和/或抗體探測的大小。在一特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的柱具有l(wèi)uer接頭、管連接件和圓頂螺母。
本發(fā)明還包括用于純化抗體的試劑盒，所述試劑盒包括位于不同腔室中的填充有上述分離基質(zhì)的色譜柱、一個或多個緩沖液和從原料進行大規(guī)模捕獲抗體的書面說明。在一特定實施方式中，該試劑盒還包括luer接頭、管連接件和圓頂螺母。
第三方面，本發(fā)明涉及通過親和色譜法純化抗體的方法，該工藝包括將工藝原料與根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)接觸以吸收抗體，對吸附至分離基質(zhì)上的抗體進行洗滌的選擇性步驟，加入洗脫液從而將抗體從分離介質(zhì)上釋放出來，從洗脫液中回收抗體。采用本方法，可以得到大于35mg抗體/ml分離基質(zhì)，例如大于40mg抗體/ml分離基質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力。由此，當(dāng)實施本方法時，動態(tài)結(jié)合能力可以為35-50mg抗體/ml分離基質(zhì)，例如39-40mg抗體/ml分離基質(zhì)。
本方法可用于從培養(yǎng)液體中和上清液中分離抗體。在一有利的實施方式中，工藝原料包括發(fā)酵液。在該實施方式中，從宿主細(xì)胞蛋白、DNA、病毒、內(nèi)毒素、營養(yǎng)素、細(xì)胞培養(yǎng)基組分例如抗發(fā)泡劑和抗生素、以及與產(chǎn)物相關(guān)的雜質(zhì)例如misfolded樣品和聚合物中純化抗體。在一特定實施方式中，所述原料在與分離基質(zhì)接觸之前，經(jīng)過機械過濾，因此，流動相為澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液。吸附的適宜條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
本方法可以用于純化任何種類的單克隆或多克隆抗體，例如來源于哺乳動物宿主的抗體，例如鼠、嚙齒類動物、靈長類動物和人類，或者來源于培養(yǎng)細(xì)胞的抗體，例如雜交瘤。在一個實施方式中，回收的抗體為人或人源化抗體。在另一實施方式中，所述抗體選自來自小鼠、大鼠、兔、倉鼠、豚鼠、牛、綿羊、山羊、豬和雞的抗體。所述抗體可以為任何類型，即選自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在一個實施方式中，回收的抗體為免疫球蛋白G(IgG)。在一個特殊實施方式中，所述IgG選自人IgG1、人IgG2、人IgG4、人IgGA、人IgGD、人IgGE、人IgGM、小鼠IgG1、小鼠IgG2a、小鼠IgG2b、小鼠IgG3、兔Ig、倉鼠Ig、豚鼠Ig、牛Ig和豬Ig，優(yōu)選人IgG1、人IgG2、人IgG4、小鼠IgG2a、兔Ig和豚鼠Ig。因此，在一個實施方式中，抗體為單克隆抗體。眾所周知，單克隆抗體技術(shù)涉及具有不斷復(fù)制能力的永生細(xì)胞與哺乳動物細(xì)胞的融合以產(chǎn)生抗體。所產(chǎn)生的細(xì)胞融合或“雜交瘤”接下來將產(chǎn)生位于細(xì)胞培養(yǎng)物中的單克隆抗體。在此情況下，應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“抗體”還包括抗體片段和包括抗體或抗體片段的任何融合蛋白。因此，本方法可用于分離免疫球蛋白類分子，其具有蛋白A和/或蛋白G和/或蛋白L結(jié)合免疫球蛋白的性能。
本方法可以作為常規(guī)液相色譜法，其中流動相通過重力和/或泵的作用流經(jīng)分離基質(zhì)。因此，在一個實施方式中，分離基質(zhì)存在于色譜柱中，所述工藝原料和洗脫液流經(jīng)色譜柱。
在一個替換實施方式中，本發(fā)明的該方面涉及通過親和色譜將一個或多個抗體除去以純化液體的方法，該工藝包括將液體與根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)接觸以吸附抗體并回收經(jīng)純化的液體。該實施方式例如可用于液體為血液或血漿的情況，希望從血液或血漿中除去一種或多種抗體從而獲得安全的血液制品。在一個實施方式中，通過加入洗脫液將抗體從分離基質(zhì)上釋放出來，從而制備再次使用的分離基質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明的抗體的吸附和洗脫很容易通過標(biāo)準(zhǔn)條件釋放，例如類似商業(yè)產(chǎn)品所推薦的，參見例如MabSelectTM操作說明書(AmershamBiosciences，Uppsala，瑞典)。因此，通過加入改變分離基質(zhì)的PH的洗脫液可以進行洗脫例如梯度洗脫。
最后一方面，本發(fā)明涉及對抗體進行純化的多步驟工藝，該工藝包括如上所述的捕獲步驟，之后有一個或多個步驟以對抗體進行中間純化和/或精煉。在一個實施方式中，捕獲步驟之后為疏水交互作用和/或離子交換色譜。在一替換的步驟中，捕獲步驟之后為多種陰離子或陽離子交換色譜。在本工藝的最佳實施方式中，捕獲步驟在MabSelectTMXtra(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)上進行。
附圖的詳細(xì)描述附圖1的示意圖中，對于根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)(上部的線)和對于現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)品(下部的點線)，Y軸為動態(tài)結(jié)合能力(DBC)(mg抗體/ml分離基質(zhì))，其為X軸上的保留時間(分鐘)的函數(shù)。其清楚地顯示，根據(jù)本發(fā)明的分離基質(zhì)如何提供高得多的動態(tài)結(jié)合能力，實際上，高大約30％。
實驗部分這些例子僅僅出于闡述的目的，不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的由所附權(quán)利要求所限定的范圍的限制。下文以及本說明書其他地方給出的全部參考文獻通過引用的方式結(jié)合在本文。
實施例1分離基質(zhì)通過US6602990(Amersham Biosciences)公開的懸浮凝膠法制備瓊脂糖顆粒。尤其是，通過本領(lǐng)域公知的原理適當(dāng)調(diào)整固體含量，制備Kav為0.69的顆粒。進一步，通過調(diào)整攪拌的速度和時間，將中值粒徑控制為80um。
對上述顆粒進行環(huán)氧活化，根據(jù)公知的方法，例如Hermanson，GregT.，Mallia，A.Krishna，Smith，Paul K.Immobilizied AffinityLigand Techniques，第118頁，Academic Press.ISBN 0-12-342330-9中所述，通過C端將重組蛋白A(rProtein A)偶聯(lián)至顆粒上。rProteinA配體偶聯(lián)的配體密度為7.3mg/ml。
用于比較的分離基質(zhì)為Amersham Biosciences的MabSelectTM，根據(jù)產(chǎn)品說明，其累計體積分布的中值粒徑為85um。
實施例2動態(tài)結(jié)合能力根據(jù)以下測量如實施例1所述制備的分離基質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力(DBC)在裝有所述產(chǎn)品的兩個柱中裝入中性PH的1.0mg/ml人多克隆IgG。在10％漏過點確定所述能力，結(jié)果如附圖1所示。
裝置柱的填充柱(2) XK16/20 Amersham Biosciences填充池XK16/20 Amersham Biosciences泵25ml/分鐘，例如P-900 Amersham Biosciences安全閥0.3MPaAmersham Biosciences壓力計色譜AKTATMExplorer10或AKT FPLCTM(Amersham Biosciences)分光光度計，雙光束化學(xué)試劑乙醇 99.5％分光光度氯化鈉pa磷酸二氫鈉pa Baker M＝137.99g/mol氫氧化鈉 paProlaboM＝40.00g/mol檸檬酸鈉 paMerck M＝75.07g/mol鹽酸 paGammanorm 165mg/ml Octapharma溶液緩沖液填充液1含有0.25M NaCl的20％(v/v)乙醇填充液220％乙醇吸附緩沖液含有0.15M NaCl的0.020M NaH2PO4，用濃氫氧化鈉溶液將PH調(diào)整至7.4±0.05解吸液用鹽酸將PH調(diào)整至3.0±0.05的0.1M檸檬酸鈉。
IgG樣品溶液用吸附緩沖液稀釋Gammanorm制備1.00±0.01mg/ml的樣品溶液。應(yīng)當(dāng)在280nm處通過分光光度法測量吸光度，檢查樣品溶液(1+1稀釋后)的濃度。采用1.38ml/mg*cm作為吸光度系數(shù)計算正確的濃度。
柱的填充凝膠預(yù)處理對位于玻璃過濾漏斗上的50ml凝膠用填充液1清洗5分鐘。采用真空吸干5分鐘。小心混合，稱取兩份14.3g放于兩個燒杯中。加入～25ml填充液1。
填充將填充池通過連接件安裝至柱上。測量并標(biāo)記所需的床高度。定量轉(zhuǎn)移凝膠，并裝入填充液1。用填充液2以25ml/分鐘填充5分鐘，向下流動的最大壓力為0.3MPa。在流動過程中標(biāo)記床的高度。除去填充池，在凝膠上安裝頂部接頭，以10ml/分鐘的流速流動5分鐘以上。如果需要，將床高度調(diào)整或重填至10.0±0.3cm。
程序裝柱的控制通過注入丙酮溶液通過柱檢查柱的填充，計算所得到的峰的對稱性。制備100mg丙酮/ml吸附緩沖液的溶液。向柱中以5ml/分鐘注入50ul丙酮溶液。采用AKTA系統(tǒng)，或根據(jù)以下描述評價或計算峰不對稱因子峰不對稱因子計算為B/A的絕對值，其中A和B為最大峰高度的保留體積減去10％峰高度的保留體積。如果對稱性在0.80-1.60之間，則所述柱被認(rèn)可。
確定漏過能力所述分析應(yīng)當(dāng)基于在控制的室溫下的兩個柱，23±1℃。以流動相速率為250cm/小時確定漏過能力。根據(jù)6.3部分檢查流速。將吸附緩沖液通過旁路位置，直至達(dá)到穩(wěn)定的基線。自動調(diào)零，加入35ml IgG溶液通過旁路，以得到穩(wěn)定的100％的信號。重要的是，在整個分析過程中流速是一致的。當(dāng)吸附緩沖液再次到達(dá)旁路位置的穩(wěn)定基線之后，用5個柱體積的吸附緩沖液平衡所述柱。自動調(diào)零，以流動相速率250cm/h(8.38ml/分鐘)向柱中加入100個柱體積的IgG溶液。
校準(zhǔn)必須相對于體積分配量對所述色譜系統(tǒng)進行仔細(xì)地校準(zhǔn)。定期根據(jù)儀器手冊進行校準(zhǔn)，并在每次分析前對用于加樣的泵檢查流速。
評價在10％漏過點q10％評價動態(tài)結(jié)合能力。在280nm處檢測UV吸光度。確定并記錄100％UV信號(A100％)，以及對應(yīng)于沒有結(jié)合的IgG亞類(從加樣起60ml處確定)的UV信號(Asub)。柱體積(Vc)和樣品原料的濃度(Co)(兩位小數(shù))也用于計算。
動態(tài)結(jié)合能力計算為直至柱流出物中的IgG濃度為原料中IgG濃度的10％時向柱中裝入的IgG量。所裝入的量對10％漏出之前通過柱的IgG量進行校準(zhǔn)。
q10%=C0VC[Vapp-Vsys-∫VsysVappA(V)-AsubA100%-Asub*dv]]]>其中C0為原料濃度，Vc為柱體積，Vapp為直至10％漏過時加入的體積，Vsys為系統(tǒng)的死體積(不包括柱的死體積)，所述積分為從柱中流出的洗脫液中IgG的總量直至發(fā)生10％漏出，A(V)為給定的加入體積的吸光度值，Asub為非結(jié)合的IgG亞類的吸光度貢獻。單個柱之間的動態(tài)結(jié)合能力的差別不應(yīng)當(dāng)超過1.2mg/ml填充凝膠。
精確度所述能力的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2％。
參考文獻Handbook of Process Chromatography，A Guide toOptimization，Scale-up and validation(1997)，Academic Press，San Diego.Gail Sofer&Lars Hagel編輯，ISBN 0-12-654266-性，308-310頁。
實施例3計算凝膠相分布系數(shù)原理通過凝膠過濾確定根據(jù)實施例1的顆粒的凝膠相分布系數(shù)。將具有不同尺寸的兩個葡聚糖通過填充的HR16/30柱。檢測每個葡聚糖的保留體積，并用來計算Kav，該值用于描述對于特定分子量可用的顆粒體積部分。從Kav值報道了Mp110000的Kav值。
裝置填充柱HR16/30填充管HR16/30泵AKTATMP-900泵*選擇性測試AKTA explorer 10系統(tǒng)*對照 UNICORNTM樣品注Autosampler A-900進樣環(huán)路 200ul泵P-900檢測器Shimadzu RI-檢測器*或等同物化學(xué)試劑填充的流動相為蒸餾水，選擇性測試的流動相為0.20M的位于蒸餾水中的NaCl。
在流動相為蒸餾水的柱中注入2％丙酮，對柱填充進行檢測。
在選擇性測試中采用的葡聚糖為天然葡聚糖5mg/mlAmersham BiosciencesMp＝19630010mg/ml PharmacosmosMp＝66700 8mg/mlPharmacosmos所有的葡聚糖用0.20M NaCl稀釋，除了Mp＝196300用0.25M NaCl稀釋，其用作柱的總體積的標(biāo)記物。
安全指示不需要采取特別的安全預(yù)防措施。
樣品預(yù)處理用0.20M NaCl對位于玻璃過濾器上的凝膠進行清洗，并干燥，直至凝膠發(fā)生開裂。然后將60ml干凝膠溶解于60ml 0.20M NaCl中，形成凝膠漿。
校準(zhǔn)根據(jù)各自的手冊對使用過的儀器進行對照和校準(zhǔn)。
程序一個分析包括填充被測試兩次的一個柱子，即每個葡聚糖注入兩次。
裝柱根據(jù)以下方法對HR16/30柱(Amersham Biosciernces)進行裝柱采用填充連接器，將該柱通過底部接頭連接至填充管。將柱放在柱支架上，填充管位于底部。將填充管接頭與泵連接，并一點一點填充0.5cm水。轉(zhuǎn)移入凝膠漿，填充0.2M NaCl，將過濾器和底部接頭放于柱上。
施加22ml/分鐘的流速，將柱子右旋(turn the column right)，連續(xù)泵送10分鐘。用Pasteur吸液管除去多余的凝膠。將過濾器放于頂部，打開頂部接頭，調(diào)整床表面。施加10ml/分鐘的流速，直至床穩(wěn)定，再次調(diào)整接頭，然后再次施加流速以檢查床的穩(wěn)定性。如果沒有觀察到床的進一步壓縮，則認(rèn)為其穩(wěn)定了。
通過注入2％丙酮溶液(在蒸餾水中)檢測裝柱質(zhì)量。在注入之前不需要達(dá)到平衡，其原因是，流動相沒有改變。在1.2CV期間以150cm/h(5ml/min)洗脫丙酮。從所得到的峰計算板數(shù)和不對稱因子。接受標(biāo)準(zhǔn)板數(shù)＞2400N/m，不對稱性0.7-1.3。
板數(shù)的計算N/LN ＝5.54*(tR/Wh)2tR＝保留時間Wh＝半高時的峰寬L ＝柱高(m)在10％峰高處測量不對稱因子。
選擇性測試在接受裝柱標(biāo)準(zhǔn)之后，可以運行選擇性測試方法，其包括以下步驟1.柱平衡，至少1.5CV 0.20M NaCl2.用A-900自動加樣儀注入200ul葡聚糖3.用1.3CV的流動相進行洗脫。
對于每個葡聚糖或葡聚糖混合物*重復(fù)步驟2和3。
*可以根據(jù)以下方法混合葡聚糖，但是也可以一次注射一個。
混合1天然葡聚糖+Mp66700混合20.25M NaCl中的Mp196300誤差源泵中存在的空氣可以給出錯誤的流速，因此在運行過程中進行控制以使壓力穩(wěn)定是非常重要的。
評價從所得到的色譜圖的RI曲線得到每個葡聚糖的保留體積，其中峰定義為所述葡聚糖的RI最大值。然后從以下公式計算葡聚糖的KavKav＝(VR-V0)/(VC-V0)其中VR＝對于額外柱體積而調(diào)整的經(jīng)洗脫的葡聚糖的保留體積，mlV0＝對于額外柱體積而調(diào)整的間隙體積(天然葡聚糖的保留體積)(ml)VC＝柱的幾何體積(床高，cm·柱的表面積，cm2)然后對葡聚糖進行l(wèi)ogMp對Kav值作圖。每個葡聚糖具有兩個值導(dǎo)致在每個示意圖上有四個值。對兩個葡聚糖進行線性內(nèi)插得到對應(yīng)于所報道的110000分子質(zhì)量(Mp值)的Kav值。
權(quán)利要求
1.一種由多孔碳水化合物顆粒組成的分離基質(zhì)，所述顆粒上固定有抗體結(jié)合蛋白配體，其中所述配體密度為5.0-10mg/ml；以及中值粒徑為65-84um。
2.如權(quán)利要求1所述的分離基質(zhì)，其中對于大小為11kDa的葡聚糖，其表達(dá)為Kav的凝膠相分布系數(shù)大于0.65。
3.如權(quán)利要求1或2所述的分離基質(zhì)，其中對于大小為11kDa的葡聚糖，其表達(dá)為Kav的凝膠相分布系數(shù)為0.65-0.85。
4.如之前任意權(quán)利要求所述的分離基質(zhì)，其中所述配體密度為5.5-9.0mg/ml。
5.如之前任意權(quán)利要求所述的分離基質(zhì)，其中所述中值粒徑為大約75um。
6.如之前任意權(quán)利要求所述的分離基質(zhì)，其中所述顆粒包括交聯(lián)多糖材料。
7.如權(quán)利要求6所述的分離基質(zhì)，其中所述碳水化合物材料為交聯(lián)瓊脂糖。
8.如權(quán)利要求7所述的分離基質(zhì)，其中所述瓊脂糖聚合物在凝膠化之前已經(jīng)烯丙基化。
9.如之前任意權(quán)利要求所述的分離基質(zhì)，其提供了保留時間為2.4分鐘時大于40mg抗體/ml分離基質(zhì)的動態(tài)結(jié)合能力。
10.如之前任意權(quán)利要求所述的分離基質(zhì)，其中所述配體包括Fc結(jié)合蛋白。
11.如權(quán)利要求10所述的分離基質(zhì)，其中所述Fc結(jié)合蛋白為蛋白A。
12.如權(quán)利要求11所述的分離基質(zhì)，其中所述Fc結(jié)合蛋白為非哺乳動物來源所產(chǎn)生的重組蛋白A。
13.如之前任意權(quán)利要求所述的分離基質(zhì)，其中所述配體包括蛋白A功能結(jié)構(gòu)域的單體、二聚體或多聚體。
14.如權(quán)利要求13所述的分離基質(zhì)，其中一個或多個所述蛋白A功能結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變。
15.一種包括如權(quán)利要求1-14任意之一所述的分離基質(zhì)的色譜柱。
16.一種從原料中大規(guī)模捕獲抗體的試劑盒，所述試劑盒包括，位于不同腔室的填充有如權(quán)利要求1-14任意所述的分離基質(zhì)的色譜柱，一個或多個緩沖液和其使用的書面說明書。
17.通過親和色譜純化抗體的方法，該工藝包括將工藝原料與如權(quán)利要求1-14任意所述的分離基質(zhì)接觸，對吸附至分離基質(zhì)上的抗體進行洗滌的任選步驟、加入將抗體從分離基質(zhì)上釋放出來的洗脫液、以及從洗脫液中回收抗體。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述工藝原料包括發(fā)酵液。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中所述原料在與分離基質(zhì)接觸之前經(jīng)過機械過濾。
20.如權(quán)利要求17-19任意所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體。
21.如權(quán)利要求17-120任意所述的方法，其中所述分離基質(zhì)存在于色譜柱中，所述工藝原料和洗脫液通過所述色譜柱。
22.一種通過親和色譜從一種或多種抗體純化液體的方法，該工藝包括將所述液體與如權(quán)利要求1-14任意所述的分離基質(zhì)接觸，以吸收抗體，并回收經(jīng)純化的液體。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其中通過加入洗脫液將所述抗體從分離基質(zhì)中釋放出來，從而制備用于再次使用的分離基質(zhì)。
24.一種對抗體進行純化的多步驟工藝，該工藝包括如權(quán)利要求17-21任意所述的捕獲步驟，之后為對抗體進行中間純化和/或精煉的一個或多個步驟。
25.如權(quán)利要求24所述的工藝，其中所述捕獲步驟之后為疏水交互作用和/或離子交換色譜。
26.如權(quán)利要求120所述的工藝，其中所述捕獲步驟之后為多種形式的陰離子或陽離子交換色譜。
27.如權(quán)利要求24-26任意所述的工藝，其中所述捕獲步驟在MabSelectTMXtra上進行。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種由多孔顆粒組成的分離基質(zhì)，所述顆粒上固定有抗體結(jié)合配體，其中所述配體密度為5.0－10mg/ml；對于大小為11kDa的葡聚糖，其表達(dá)為K
文檔編號B01J39/26GK101087637SQ200580043050
公開日2007年12月12日 申請日期2005年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月14日
發(fā)明者H·伯格, H·J·約翰森, G·馬爾穆奎斯特, P·-M·阿伯格 申請人:通用電氣健康護理生物科學(xué)股份公司