專利名稱：：在胞內環(huán)境中表現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性的免疫球蛋白構架及其鑒定方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及蛋白質化學、分子生物學以及免疫學。相關
技術領域：
背景抗體能以高度的特異性和親和力識別并靶向幾乎任何分子。這個特點已被開發(fā)，以便將這些天然蛋白轉變?yōu)橛糜谠\斷和治療應用的強有力的工具。重組DNA技術的進展已推動了抗體基因在廣泛種類的非淋巴細胞中的操作、克隆和表達(Skerra，1988；Martineau，1998；Verma，1998)。已經構建了許多不同的抗體片段，以便最佳地滿足各種應用。保留整個母體免疫球蛋白全部抗原結合能力的最小實體是單鏈Fv片段(scFv)(Bird，1988)。該抗體片段包含由柔性肽接頭連接起來的重鏈和輕鏈可變區(qū)，這使得該蛋白能夠由單個基因表達?？贵w片段較之于完整免疫球蛋白分子具有若干重要的優(yōu)勢。由于分子小，它們在多種表達宿主細胞如大腸桿菌細胞中的表達得以易化、且產量得以提高(Plückthun，1996)。而且，抗體片段允許在體內應用中改善腫瘤穿透力(Yokota，1992)，并且它們能夠與多種用于治療途徑的效應分子共價連接。天然存在的抗體是由漿細胞分泌的，已進化至能夠在胞外氧化環(huán)境中行使功能。為獲得其功能性折疊結構，它們通常需要在不同結構域內形成二硫鍵，這對于免疫球蛋白折疊是至關重要的。與全長抗體形成對照，scFv或Fab抗體片段原則上能夠在任何細胞內部的還原環(huán)境中功能性地表達，并定向到任何區(qū)室，以靶向胞內蛋白，從而引發(fā)特定的生物學效應(Biocca，1991)。的確，有些稱之為內體(intrabodies)的胞內單鏈抗體片段，已被成功地用于調節(jié)不同的生物系統(tǒng)中胞內靶蛋白的功能。從而，針對病毒侵染的抗性已在植物生物技術中得到展示(Tavladoraki，1993；Benvenuto，1995)，內體與HIV蛋白的結合業(yè)已證明(Rondon，1997)，并且與癌基因產物的結合(Biocca，1993；Cochet，1998；Lener，2000)也已有描述。而且胞內抗體在表征目前通過人類基因組測序鑒定到的大量基因的功能方面有希望成為有價值的工具(Richardson，1995；Marasco，1997)。例如，它們可在功能基因組途徑中用于封閉或調節(jié)新近鑒定的蛋白的活性，由此促成對其功能的了解。最后，內體具有診斷和治療應用的潛力，例如在基因治療環(huán)境中。盡管存在極大的前景，功能性內體的產生仍然受限于其不穩(wěn)定性和不可溶性或者聚集的傾向。胞漿的還原環(huán)境防止形成保守的鏈內二硫橋，從而使得高百分比的抗體片段不穩(wěn)定，因此在細胞內無功能(Biocca，1995；Proba，1997)?？贵w片段的穩(wěn)定性和可溶性因此構成了內體在體內作為潛在的蛋白功能調解劑的應用的主要障礙。迄今為止，尚不可預言使得抗體片段在胞內環(huán)境中具備功能的序列要求。因此，急需在廣范圍的不同細胞類型中性能良好的抗體片段，從而可作為用于多種結合特異性的構架。此類構架可用于構建用于胞內篩選的文庫，或者可作為既有抗體結合部分的受體。除了獨特地滿足胞內應用之外，在眾多的胞外和體外應用中，基于極為穩(wěn)定的可變結構域構架的此類抗體片段或完整抗體相比于其它抗體也具有獨特的優(yōu)勢。當此類構架在氧化環(huán)境中產生時，其二硫橋能夠形成，進一步增強其穩(wěn)定性，并使得它們高度抵抗聚集和蛋白酶降解。體內半衰期(及針對聚集和血清蛋白酶降解的抗性)是除了親和力和特異性之外的、使抗體在治療或診斷應用中成功的唯一最為重要的因素(Willuda，1999)?？贵w片段的半衰期可通過共價連接聚合物分子如聚乙二醇(PEG)而進一步得以提高(Weir，2002)。這類穩(wěn)定分子代表了抗體應用的顯著進步，尤其但并不僅當不期望FC功能時?？贵w片段文庫極大的實踐重要性激發(fā)了該領域的研究。Winter(EP0368684)提供了抗體可變區(qū)基因的初始克隆和表達。由這些基因出發(fā)，他建立了在互補決定區(qū)(CDR)以及構架區(qū)具有高度多樣性的巨大抗體文庫。不過，Winter未披露不同構架用于文庫構建的用途。另一方面，Plückthun(EP0859841)教導試圖通過將構架限于有限數(shù)目的合成共有序列而改進文庫設計。包括引入大量合理設計的突變的蛋白質工程的努力以前就提示針對相應共有序列的突變是提高分離的可變免疫球蛋白結構域穩(wěn)定性的合適手段(Ohage1999；Ohage1999以及US5,854,027，特此并入作為參考)。Plückthun(EP0859841)公開了基于這些共有序列進一步優(yōu)化結合親和力的方法。Plückthun專利也承認正在發(fā)生著的有關抗體的知識的增長，因此意欲包括此類文庫設計的遠景發(fā)現(xiàn)。然而，未建議合成共有構架可能的進一步改善。因而Winter、Plückthun及他人(如Soderlind，WO0175091)的教導試圖以CDR的高度多樣性為焦點建立巨大的抗體文庫，用于選擇并在氧化條件下應用所選scFv。然而，所有這些文庫未進行胞內應用優(yōu)化，因而不能用于還原環(huán)境或對所表達的抗體片段的穩(wěn)定性和可溶性提出特殊要求的其它條件下的選擇和應用?？贵w片段在還原環(huán)境如原核和真核細胞的胞漿中表現(xiàn)良好所需的性質尚不清楚。因此胞內抗體或“內體”的應用目前受限于其在還原條件下(可影響其穩(wěn)定性和可溶性能)不可預測的行為(Biocca，1995；Wrn，2000)?，F(xiàn)有專利申請(EP1040201、EP1166121和WO0200729)及出版物(Visintin，1999)涉及以篩選技術為焦點的內體的胞內篩選，但是未公開在真核細胞特別是酵母中有功能、從而可用于本上下文的文庫構建的具體抗體序列。Visintin和Tse獨立地描述了所謂的胞內共有序列(ICS)的分離(Visintin，2002；Tse，2002)。該序列來自于已從酵母抗原-抗體相互作用篩選中分離出的許多序列。然而，由于現(xiàn)有噬菌體展示選擇，胞內篩選的輸入是有嚴重偏差的。因而，在Visintin等的例子中，只有一個輸入序列屬于VH3亞群。公開的共有序列ICS與由Knappik(2000)和EP0859841描述的人類VH3亞群的共有序列完全相同。ICS的62個氨基酸中的60個也與由Steipe以構建具有增強的穩(wěn)定性的可變結構域為基礎而提出的一般人類VH-結構域共有序列相同(美國專利號No.6,262,238，特此并入作為參考)。這些工作依次建立在早期的序列收集(即Kabat，1991)和可變結構域亞群及結構決定簇的定義(Tomlinson，1992；Williams，1996；Chothia，1989和Chothia，1987)的基礎上。然而，由于所述內體選擇的輸入是有嚴重偏差的(即在Visintin等例子中，只有一個VH結構域為VH3)，由胞內篩選分離VH3序列并不是特別令人驚訝。由于其輸入文庫的嚴重偏差，Tse等和Visintin等的工作未能提供對人類可變結構域所有組成部分的全面評價，而這將會由無偏差的查詢提供，并且這是鑒定存在于人類所有組成部分中的有用內體構架所必需的。我們以前曾描述過不依賴于其抗體-結合特異性而允許在酵母中選擇穩(wěn)定且可溶的內體的系統(tǒng)(AufderMaur(2001)，WO0148017)。這個途徑允許有效地篩選scFv文庫和分離特定構架，它們在酵母細胞的還原環(huán)境中是穩(wěn)定且可溶的。目的仍然是實際分離構架序列，并且使用的模式是，第一步中預測何種序列類型將會在還原環(huán)境中最穩(wěn)定，而第二步中通過分析、重組以及進一步的體內和體外實驗鑒定最佳序列。發(fā)明的簡要概述本發(fā)明填補了抗體產生領域缺失的環(huán)節(jié)。它提供了就穩(wěn)定性和可溶性而言具有優(yōu)異特性的抗體可變結構域構架序列。這些對許多相關應用，例如在診斷、治療或研究中是關鍵特點。這些構架可用于移植既有的結合特異性或者用于產生具有高穩(wěn)定性和可溶性的抗體文庫。ScFv文庫被用來分離在酵母細胞的還原環(huán)境中穩(wěn)定且可溶的構架。分離構架的性能隨后在人類細胞系和體外實驗中表征。所述構架可直接作為既有結合特異性的受體主鏈，或者通過一個或多個高變環(huán)的隨機化構建CDR文庫用于還原或其它挑戰(zhàn)性的環(huán)境。分離的可變結構域序列進一步通過對比進行分析，以鑒定優(yōu)選的序列家族。從那些優(yōu)選的可變結構域序列家族中，根據結構分析選擇最佳序列，該結構分析可排除含干擾免疫球蛋白折疊的構架殘基的序列。鑒定的可變結構域序列候選物隨后以所有可能的變化重組，并通過分析其在酵母、哺乳動物細胞和體外的性能挑選最佳的輕鏈和重鏈可變結構域組合。這些優(yōu)化的scFv及組成它們的可變結構域構架，以及其它抗體片段或由其衍生的全抗體，舉例來說，可理想地作為既有結合特異性的受體主鏈，或通過一個或多個高變環(huán)的隨機化構建CDR文庫用于還原或其它挑戰(zhàn)性的環(huán)境。適于胞內應用的抗體從定義上來講更為穩(wěn)定且可溶。從而，它們在胞內環(huán)境外界的應用中的用途也將具有優(yōu)勢。本發(fā)明提供了包括抗體可變結構域構架和單鏈Fv抗體(ScFv)片段的組合物，其可摻入到多種抗體片段或全抗體中。提供了最穩(wěn)定且可溶種類的抗體可變結構域片段，因而最適于胞內應用。也提供了在胞內測定中表現(xiàn)出最高性能的抗體可變結構域和scFv抗體片段的具體構架序列。本發(fā)明也提供了抗體可變結構域和scFv片段中輕鏈和重鏈可變結構域的人造組合的具體構架序列，舉例來說，它們可最理想地用于胞內應用，并且就穩(wěn)定性和可溶性而言在體外表現(xiàn)出最佳性能。本發(fā)明提供具有如下通式結構的單鏈構架試劑NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述單鏈構架可融合于第二蛋白成分，以產生具有如下通式結構的融合構建體NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOHNH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH這些融合構建體中VH和VL區(qū)的取向可以顛倒。在本發(fā)明的另一個實施方案中，可變結構域可摻入到Fab片段中，其可融合于第二蛋白成分，以產生具有如下通式結構的融合構建體NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH及NH2-VL-CL-COOH第二蛋白可融合于重鏈或輕鏈的N-端或C-端。在優(yōu)選的實施方案中，單鏈或Fab構架融合構建體的第二蛋白是直接或通過轉錄激活為胞內測定提供讀出的蛋白。本發(fā)明的另一個目的是提供抗體可變結構域的構架類型以及可變結構域和scFv序列，舉例來說，它們適于從既有抗體上移植高變環(huán)，以便獲得在還原或者其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中具有功能的抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供抗體可變結構域的構架類型以及可變結構域和scFv序列，舉例來說，通過隨機化此類構架的一個或多個高變環(huán)，它們適于建立文庫用在還原或者其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中。本發(fā)明的另一個目的是所公開的序列在鑒定保守殘基和共有序列中的應用。因利用所公開的構架而得的抗體或抗體片段可用作靶確認以及人類、動物和植物疾病的治療、預防和診斷中的試劑。所述抗體可以蛋白或編碼該蛋白的DNA的形式應用，而且不限于胞內應用。附圖簡述圖1顯示了通過lacZ表達的激活而測定的典型的酵母中的“質控”篩選(例如參見實施例1)。在若干不同的篩選中鑒定到所選的陽性菌落(黑色)，并且陽性菌落的相應序列可見于表1和2。所選序列與陽性對照極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰)進行了比較。圖2顯示了通過與極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰)相比的由熒光素酶表達的激活而測定的由典型的酵母“質控”篩選分離的構架(黑色)在人類細胞系Hela中的性能。陽性對照Gal4-VP16(白色)給出了該系統(tǒng)最大可能的轉錄激活水平。熒光素酶活性已就轉染效率進行了校正。圖3顯示了在酵母中通過lacZ表達的激活而測定的優(yōu)良構架組合的體內性能。構架序列(黑色)與陽性對照(極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰))進行了比較。構架的編號如表5所述。圖4顯示了在人類細胞系Hela中通過熒光素酶表達的激活而測定的優(yōu)良構架組合的體內性能，并通過與極為穩(wěn)定的λ-移植物(深灰)的比較進行圖解說明。陽性對照Gal4-VP16(白色)給出了該系統(tǒng)最大可能的轉錄激活水平。熒光素酶活性已就轉染效率進行了校正。圖5顯示了通過酵母菌株釀酒酵母(S.cerevisiae)JPY9胞漿中產生的可溶蛋白的量測定的優(yōu)良構架組合的體內性能。圖6顯示了所選構架組合在大腸桿菌(E.coli)周質中的表達行為。箭頭標示對應于這些scFv構架的條帶位置。圖7顯示了在三種人類細胞系(Hela(黑色)、Saos-2(深灰)及HEK293(白色))中通過熒光素酶表達的激活而測定的所選優(yōu)良構架組合的體內性能，并通過與極為穩(wěn)定的λ-移植物的比較進行圖解說明。陽性對照Gal4-VP16給出了該系統(tǒng)最大可能的轉錄激活水平。熒光素酶活性已就轉染效率進行了校正。圖8代表如在PBS-緩沖液中所示的通過溫育前后存在的單體蛋白的量而定量的所選構架組合在37℃對聚集的抗性。圖表A代表構架2.4和5.2，而圖表B代表構架4.4、6.4和7.3。圖9代表通過延長溫育前后存在的可溶性全長蛋白的量而定量的所選構架組合在37℃人類血清中對蛋白酶降解聚集的抗性。圖10顯示了在酵母相互作用測定中通過lacZ表達的激活而測定的兩個所選結合物對Fab-環(huán)境下新構架7.3的性能。Fab-鏈的表達始于位于ars/cen或2微米載體之上的雙向半乳糖誘導型啟動子。所述Fab載體的表達產生抗體輕鏈和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白。結合物定向于人類球樣激酶1(hPLK1)。與該靶的結合和與無關抗原的非特異性結合以及未隨機化的構架7.3的結合進行了比較。注意作為參照包括在內的相應scFv是由肌動蛋白啟動子(2微米)表達的。圖11顯示了通過酵母菌株JPY9胞漿中產生的可溶蛋白的量測定的所述scFv構架在Fab-環(huán)境下的體內性能。Gal4-AD-scFv融合子(肌動蛋白/2微米)的表達與相應的Fab-構建體的表達并與作為Fab的母體構架7.3進行了比較，兩者均來自兩個不同的載體(Gal-誘導型、ars/cen和2微米)。Fab載體的表達產生抗體輕鏈和VH-CH1-Gal4-AD融合蛋白，它在該印跡中檢測。表1顯示了由多種酵母“質控”篩選挑選出的所有VH-結構域構架序列的對比。表2顯示了由多種酵母“質控”篩選挑選出的所有VL-結構域構架序列的對比。表3顯示了從文庫中隨機挑取的序列的對比。表4顯示了由“質控”系統(tǒng)分離到的序列中VH-和VL-結構域亞類頻率的統(tǒng)計分析。只考慮隨后在定量酵母測定中發(fā)現(xiàn)是陽性的那些序列。所選序列與由有限數(shù)目的隨機序列(表3)確定的未選文庫進行了比較。表5顯示了用于進一步重組和評價最佳scFv組合的序列以及它們各自的縮寫(abb.)、來源和亞家族。發(fā)明詳述除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語具有如本發(fā)明所屬
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的普通技術人員所通常理解的相同的含義。盡管類似于或等同于本文所述那些的方法和材料可用于實施或檢驗本發(fā)明，合適的方法和材料還是描述于下文。特此將文中提及的所有出版物、專利申請、專利及其它參考文獻全文并入作為參考。如有沖突，將以本說明書(包括定義)為準。另外，所述材料、方法和實施例僅用于舉例說明，而并非旨在限制。如本文所用，“同一性”是指兩多肽、分子或兩核酸之間的序列相似性。當兩相比序列的某位置都被同一堿基或氨基酸單體亞單位占據時(例如，兩DNA分子中每一個的某位置都被腺嘌呤占據，或者兩多肽中每一個的某位置都賴氨酸占據)，則相應分子在該位置上是一致的。兩序列間的“百分比同一性”是兩序列共有的匹配位置數(shù)目除以比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)，例如，如果兩序列10個位置中有6個匹配，則這兩個序列具有60％的同一性。作為離子，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50％的同源性(總共6個位置上有3個匹配)。一般而言，當兩序列比對可得出最大同源性時就進行比較。此類對比可利用例如Needleman等，J.MolBiol.48443-453(1970)的方法提供，通過計算機程序例如Alignprogram(DNAstar，Inc.)方便地執(zhí)行?！跋嗨啤毙蛄惺悄切┰诒葘r享有相同和相似氨基酸殘基的序列，其中相似殘基是比對的參照序列中相應氨基酸殘基的保守取代或者“許可的點突變”。就這點而言，參照序列殘基的“保守取代”是被與對應參照殘基物理上或功能上類似，如具有相似大小、形狀、電荷、化學特性，包括形成共價鍵或氫鍵的能力等的殘基取代。因而，“保守取代修飾”的序列是與參照序列或野生型序列的差異在于存在一個或多個保守取代或許可的點突變的序列。兩序列間的“陽性百分比”是含兩序列共有的匹配殘基或保守取代的位置數(shù)目除以比較的位置數(shù)目×100的函數(shù)。例如，如果兩序列10個位置中有6個匹配，且10個位置中有2個含保守取代，則這兩個序列具有80％的陽性同源。“VH結構域”是指免疫球蛋白分子重鏈的可變部分?！癡L結構域”是指免疫球蛋白分子輕鏈的可變部分。VH或VL“亞型”是指通過如Knappik(2000)中所定義的相應共有序列所定義的亞型。術語“亞家族”或“亞類”作為“亞型”的同義詞使用。如本文所用的術語“亞型”是指與代表其亞型的相應共有序列享有高度同一性和相似性的序列。某一可變結構域序列是否屬于某“亞型”是通過將該序列與相應結構域的所有已知人類生殖系區(qū)段、或者定義的共有序列比對，并隨后鑒定最大同源性確定的。確定同源性和通過利用查詢矩陣例如BLOSUM(Henikoff1992)對序列分類的方法是本領域技術人員眾所周知的。如本文所用的“氨基酸共有序列”是指氨基酸序列，它可利用至少兩個或優(yōu)選更多比對的氨基酸序列矩陣產生，并且考慮到比對中的空缺，有可能確定各位置上最頻繁的氨基酸殘基。共有序列是包括了各位置上最頻繁表示的氨基酸的序列。如果在單個位置上等同地表示兩個或多個氨基酸，則共有序列包括兩個或所有那些氨基酸。蛋白的氨基酸序列可在多種水平分析。例如，保守或變異可表現(xiàn)在單殘基水平、多殘基水平、具有空缺的多殘基水平等。殘基可表現(xiàn)出相同殘基的保守或者可以在分類的水平上保守。氨基酸分類的實例包括極性但不帶電荷的R基團(絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺和谷氨酰胺)；帶正電荷的R基團(賴氨酸、精氨酸和組氨酸)；帶負電荷的R基團(谷氨酸和天門冬氨酸)；疏水R基團(丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、纈氨酸和酪氨酸)；以及特殊氨基酸(半胱氨酸、甘氨酸和脯氨酸)。其它分類是本領域技術人員公知的，并且可利用結構決定簇或其它數(shù)據定義，以評估可取代性。就該意義而言，可取代氨基酸可以指能夠被取代并維持該位置上的功能保守性的任何氨基酸。如本文所用的“多核苷酸共有序列”是指核苷酸序列，它可利用至少兩個或優(yōu)選更多比對的核酸序列矩陣產生，并且考慮到對比中的空缺，有可能確定各位置上最頻繁的核苷酸。共有序列是包括了各位置上最頻繁表示的核苷酸的序列。如果在單個位置上等同地表示兩個或多個核苷酸，則共有序列包括兩個或所有那些核苷酸。如本文所用的“結構亞-元件”是指蛋白或多肽內與該分子限定的結構或功能部分對應的一段氨基酸殘基。這些可以是環(huán)(即抗體的CDR環(huán))或者蛋白或多肽內任何其它二級或功能結構(即結構域、α-螺旋、β-片層、抗體構架區(qū)等)。結構亞元件可利用相似或同源多肽的已知結構或者通過利用上文提及的比對氨基酸序列的矩陣鑒定。這里各位置上的變異是確定屬于某一結構亞元件(如抗體高變區(qū))的一段氨基酸殘基的基礎。如本文所用的“亞序列”是指編碼至少一個結構亞元件的基因模塊。它未必一定與結構亞元件相同。如本文所用的“抗體CDR”是指抗體的互補決定區(qū)，其由如Kabat等(1991)所定義的抗原結合環(huán)組成。例如，抗體Fv片段的兩可變結構域中的每一個都含3個CDR。如本文所用的“抗體”是“免疫球蛋白”的同義詞。根據本發(fā)明的抗體可以是完整免疫球蛋白或其片段，包括免疫球蛋白的至少一個可變結構域，例如單可變結構域，F(xiàn)v(Skerra，1988)、scFv(Bird，1988；Huston，1988)、Fab、(Fab′)2或本領域技術人員眾所周知的其它片段。如本文所用的“抗體構架”是指可變結構域VL或VH的一部分，它起著該可變結構域抗原結合環(huán)的支架的作用(Kabat等，1991)。合理設計的scFv片段已證明了scFv片段的熱動力學穩(wěn)定性與其體內性能之間清楚的關聯(lián)(Wrn，2000；AufderMaur，2001)。利用最近研發(fā)的命名為“質控”的系統(tǒng)(AufderMaur，2001)，已分離到適于胞內應用的特定抗體可變結構域構架序列(表1和2)、描述了特征(圖1和2)并進一步改善(圖3至9及表3)。如同我們以前的實驗中所觀察到的那樣，在胞內測定中所選的性能良好的構架表現(xiàn)出高的體外穩(wěn)定性，如通過其37℃抗聚集和蛋白酶降解所證明的那樣(圖8和9)。而且，形成了允許在更廣基礎上根據其構架亞家族(表4)選擇用于胞內應用的構架的模式。文中公開了可用于胞內應用的特定抗體可變結構域，還有通用模式。一方面，這允許利用這些序列作為移植實驗的構架供體以獲得保留了環(huán)供體的結合特異性的功能性內體。另外，可利用公開的序列作為構架構建抗體文庫。此類文庫適用于還原條件下的胞內選擇系統(tǒng)，例如原核和真核細胞系統(tǒng)。另外，所公開的序列可用于鑒定例如保守序列或殘基或基序。結構亞元件的移植，例如抗體結合環(huán)的移植(如Jung，1997)，還有抗體或其片段文庫的制備(如Vaughan，1996；Knappik，2000)已有詳細描述，并且是本領域技術人員眾所周知的。由于胞內應用將抗體片段暴露于極為不利的條件下(即升高的溫度、還原環(huán)境)，而本發(fā)明公開的序列獲得了使之抵抗最不利條件的特點。因此，當與“普通”序列相比時，這里公開的序列具有出色的穩(wěn)定性和可溶性，如通過其對聚集和蛋白酶降解的抗性所證明的那樣(圖8和9)。這些特點，連同其優(yōu)良的表達產率，使得所公開的抗體構架序列獨特地不僅適于胞內應用，而且尤其適于所有其中極需關注長半衰期、耐用性和制備的容易性的治療和診斷應用。本發(fā)明使得可能設計包括至少抗體的可變部分、可用于還原或其它挑戰(zhàn)性環(huán)境下的應用的多肽序列。在第一實施方案中，本發(fā)明提供了可用于胞內應用的抗體構架序列集合(表1和2)。在第一步中，利用酵母質控系統(tǒng)不依賴于結合親和力地篩選多種序列的文庫。分離的序列可在酵母和哺乳動物細胞中評價其胞內性能(圖1和2)。在本發(fā)明的一個實施方案中，對分離序列的集合通過比對進行分析，以鑒定抗體可變結構域亞類和適用于胞內應用的共有序列。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，對上述抗體構架序列的集合進一步通過相互比對和亞家族分類進行分析。屬于一個亞型的所有構架就其在酵母和在哺乳動物細胞中的胞內性能進行比較(圖1和2，作為實例)，并就其氨基酸序列中相對于各亞型共有序列所發(fā)生的陰性、中性或陽性交換進行比較。本領域技術人員能夠根據免疫球蛋白結構域中特定交換殘基的結構環(huán)境區(qū)別陽性、中性和陰性變化。隨后，選擇表現(xiàn)出最佳胞內性能的可變抗體結構域構架序列，并且其與相應亞型共有序列相比沒有陰性交換。優(yōu)選地，挑選進一步含有據認為是陽性氨基酸交換的序列。在另一優(yōu)選的實施方案中，所選的重鏈和輕鏈抗體可變結構域隨后以所有可能的組合重組為scFv片段，以鑒定具有最高穩(wěn)定性和可溶性的組合。為了這個目的，對新的重組scFv片段進行有關在酵母(圖3)和在哺乳動物細胞系(圖4和7)的胞內相互作用測定中還原條件下的性能以及有關在酵母中的可溶性胞內表達(圖5)的評價。對有希望的組合進一步通過分析大腸桿菌中的周質表達(圖6)、升高的溫度下對聚集的抗性(圖8)以及在人類血清中于37℃延長溫育后對聚集和蛋白酶降解的抗性(圖9)進行有關氧化條件下的行為的評價。這些數(shù)據被用來鑒定最適于胞內或氧化條件下的任何特定應用的scFv構架。本文公開的所選且優(yōu)化了的構架序列不僅在胞內應用中，而且在所有可得益于scFv提高的穩(wěn)定性和/或可溶性的應用中都具有顯著的優(yōu)勢。實例有在診斷應用中需要以高濃度長期貯存，以及37℃血清中延長的功能半衰期(例如象治療應用中所需的那樣)。根據本發(fā)明的一個方面，提供了包括具有如下通式結構的單鏈構架的內體構架NH2-VL-接頭-VH-COOH；或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VH構架為1a、1b或3亞型。在另一個實施方案中，上述單鏈構架中VH和VL區(qū)的取向顛倒。根據本發(fā)明的一個方面，提供了包括具有如下通式結構的單鏈構架的內體構架NH2-VL-接頭-VH-COOH；或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VH構架為1a、1b或3亞型，且VL構架為λ1、λ3或κ1亞型。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了融合于第二蛋白成分的單鏈構架，以產生具有如下通式結構的融合構建體NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOH；或NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH其中VH構架為1a、1b或3亞型，且VL構架為λ1、λ3或κ1亞型。在另一個實施方案中，這些融合構建體中VH和VL區(qū)的取向可以顛倒。在另一個實施方案中，可變結構域可摻入到Fab片段中，所述片段可另外融合于第二蛋白成分，以產生具有如下通式結構的融合構建體NH2-VH-CH-第二蛋白-COOH和NH2-VL-CL-COOH所述第二蛋白可融合于重鏈或輕鏈的N-端或C-端。如本文所公開的，胞內應用中存在著對亞型為3及1a和1b的VH構架極強的偏好。至于輕鏈可變結構域(VL)，κ1構架在數(shù)量上具有清楚的偏好，但λ1和3也被富集。因此，這些構架亞型，即與κ1、λ3VL結構域相組合的VH1a、1b和3最適合用于胞內應用以及需要scFv折疊性質的其它應用。因此，為了降低還原環(huán)境中無功能分子的數(shù)量，用于胞內篩選系統(tǒng)的文庫應當優(yōu)選由這些構架亞型的混合物構建。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明抗體片段的VH結構域為1a、1b或3亞群。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明抗體片段的VL結構域為κ1、λ1或3亞群。在優(yōu)選的實施方案中，用作為構架的抗體片段選自如表5所示的1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4和6.4。在本發(fā)明的一個實施方案中，至少兩個并且優(yōu)選多個構架被鑒定然后予以分析。當?shù)鞍仔蛄斜舜吮葘r，可建立蛋白序列的數(shù)據庫。則該比對可用于定義例如在序列和結構排列上(如果該信息可用的話)都表現(xiàn)出高度相似性的殘基、亞元件、亞序列或構架序列亞群。亞元件的長度優(yōu)選，但并非僅在1個氨基酸(例如酶活性位點中的一個殘基或結構決定殘基)和150個氨基酸(例如完整蛋白結構域)的范圍之內。最優(yōu)選的是，長度范圍在3和25個氨基酸之間，例如最常見于抗體CDR環(huán)中的。在另一個實施方案中，合成了由分析推測的共有核酸序列。這可通過本領域熟練從業(yè)人員眾所周知的多種方法中的任何一種，例如通過全基因合成或通過以PCR為基礎的途徑實現(xiàn)。在另一個實施方案中，所述核酸序列被克隆到載體中。載體可以是測序載體、表達載體或展示(如噬菌體展示)載體，所有這些都是本領域技術人員眾所周知的。載體可包含一個核酸序列或在不同或同一操縱子中的兩個或多個核酸序列。在最后一種情況下，它們可單獨或作為連續(xù)的序列克隆。在一個實施方案中，多肽具有特定物種的模式特征。例如，這可通過由僅僅一個種類的同源蛋白的集合，優(yōu)選由人類蛋白集合推斷共有序列而實現(xiàn)。本發(fā)明另一實施方案涉及通過提供編碼如上所述的多肽和附加成分的DNA序列而得的融合蛋白。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了核酸序列、含所述核酸序列的載體、含所述載體的宿主細胞以及根據本文所述方法可獲得的多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了合成或以其它方式在本發(fā)明的核酸序列末端安置限制性位點，以使其能夠克隆到合適的載體中。在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了與編碼所述多肽的核酸序列相容的載體系統(tǒng)。所述載體包括限制性位點，這將是，舉例來說，在該載體系統(tǒng)中獨一無二的，并且就摻入到編碼所述多肽的核酸序列中的限制性位點而言基本上是唯一的，除了例如該核酸序列克隆到載體中所必需的限制性位點之外。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，包括一個或多個核酸序列、重組載體、多肽和根據上述方法的載體，以及例如用于產生所述多肽的合適的宿主細胞。所有上述本發(fā)明的實施方案可利用本領域技術人員公知的分子生物學標準技術完成。在另一個實施方案中，核酸序列是能夠編碼本發(fā)明的多肽的任何序列。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸用于基因治療。在另一個實施方案中，單鏈構架是(表5)中1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4任一序列的變體，其中如本文所用的“變體”是指表現(xiàn)出90％或更大的同一性、同時又保持增強的穩(wěn)定性的序列。在另一個實施方案中，單鏈構架是(表5)中1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4任一序列的衍生物，其中如本文所用的“衍生物”是指僅保持了對于該分子功能和穩(wěn)定性至關重要的那些氨基酸的序列。如實施例3中所述的構架中孤立的中性或陽性交換不被認為是與本發(fā)明的抗體構架相關的變化。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述單鏈構架融合于第二蛋白，其中該蛋白為胞內測定提供了讀出。所述讀出可以是直接的，例如以與可檢測的蛋白如可通過熒光觀察的GFP(綠色熒光蛋白)、增強的藍色熒光蛋白、增強的黃色熒光蛋白、增強的青色熒光蛋白或者具有不同檢測方法的其它融合伴侶融合的形式?；蛘?，所述讀出可通過報告基因的轉錄激活實現(xiàn)，其中scFv-融合蛋白的融合伴侶是轉錄激活劑，例如Gal4激活結構域，或者DNA-結合蛋白，例如LexA或Gal4DNA-結合結構域，其激活酶例如β-半乳糖苷酶、熒光素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、氯霉素乙?；D移酶等報告基因的轉錄，這轉錄提供了讀出。提供讀出的融合蛋白是本領域技術人員眾所周知的。本發(fā)明的另一個實施方案是包括本文所述的構架的抗體。本發(fā)明的另一個實施方案是本發(fā)明抗體的應用。本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案是抗體可變結構域的所述構架類別以及可變結構域和scFv序列用于從既有抗體上移植高變環(huán)的用途，以獲得在還原或其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中有功能的抗體。本發(fā)明另一個進一步優(yōu)選的實施方案是抗體可變結構域的所述構架類別以及可變結構域和scFv序列的用途，例如通過此類構架的一個或多個高變環(huán)的隨機化，用于建立文庫，應用于還原或或其它挑戰(zhàn)性環(huán)境中。對本領域普通技術人員將會顯而易見的是，文中所述的本發(fā)明的分子可用于診斷和治療應用、靶確認以及基因治療。本發(fā)明可通過如下實施例舉例說明，其并不旨在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。參考文獻Agatep，R.，Kirkpatrick，D.1，.，Parchaliuk，R.A.，Woods和Gietz，R.D.(1998).″TransformationofSaccharomycescerevisiaebylithiumacetate/single-strandedcarrierDNA/polyethyleneglycolprotocol.″Technical.TipsOnline(http//tto.trends.corn).AufderMaur，A.，Escher，D.和Barberis，A.(2001).″Antigen-independentselectionofstableintracellularsingle-chainantibodies.″FEBSLett508407-412.Benvenuto，E.和Tavladoraki，P.(1995).″Immunotherapyofplantviraldiseases.″TrendsMicrobiol3(7)272-5.Biocca，S.和Cattaneo，A.(1995).″Intracellularimmunizationantibodytargetingtosubcellularcompartments.″TrendsCellBiol5248-252.Biocca，S.，DiLuzio，A.，Werge，T.和Cattaneo，A.(1991).″Intracellularimmunizationexpressionofantibodydomainsinthecytoplasmandinthenucleusofmairurtaliancells.″Cytotechnology5Suppl149-50.Biocca，S.，Pierandrei-Amaldi，P.和Catta-neo，A.(1993).″Intracellularexpressionofanti-p21rassinglechainFvfragmentsinhibitsmeioticmaturationofxenopusoocytes.″BiochernBiophysResCoinmun197(2)422-7.Biocca，S.，Ruberti，F(xiàn).，Tafani，M.，Pierandrei-Amaldi，P.和Cattaneo，A.(1995).″RedoxstateofsinglechainFvfragmentstargetedtotheendoplasmicreticulum，cytosolandmitochond.ria.″Rio/Technology13(10)1110-5.Bird，R.E.，liardinan，K.D.，Jacobson，J.W.，Johnson，S.，Kaufman，B.M.，Lee，S.M.，Lee，T.，Pope，S.H.，Riordan，G.S.和Whitlow，I-E.(1988).″Single-35chainantigen-bindingproteins.″Science242(4877)423-6Chothia，C.和Lesk，A.N.(1987).″Canonicalstructuresforthehypervariableregionsofimmuno-globulins.″J..Tylol.Biol.196(4)901-17.Chothia，C.，Lesk，A.N.，Tramontano，A.，Le5vitt，N.，Smith-Gill，S.J.，Air，G.，Sheriff，S.，Pad-lan，E.A.，Davies，D.，Tulip，W.R.，Colman，W.R.，Spinelli，S.，Alzari，P.N.和Poljak，R.J.(1989).″Conformationsofimmunoglobulinhypervariableregions.″J.Mol.Biol.342877-883.Johnson，G.，Kabat，E.A.和Wu，T.T.(1996).kabatdatabaseofsequencesofproteinsofimmunologicalinterest.WEIR′SHandbookofexperimantalInurtu-nologyIImmunochemistryandMolecularImmunology.Cambridge，NA，BlackwellScienceInv6.1-6.21.Kabat，E.A.，Wu，T.T.，Perry，H.N.，Gottesman，K.S.和Foeller，C.(1991).Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest.NIHPublication91-3242.Wasinghton，DC，USDepartmentofhealthandhumanservi-ces.Knappik，A.，Ge，L.，Honegger，A.，Pack，P.，F(xiàn)ischer，N.，Wellnhofer，G.，Hoess，A.，Wolle，J.，Pluckthun，A.和Virnekas，B.(2000).″Fullysynthetichumancombinatorialantibodylibraries(HuCAL)basedonmodularconsensusframeworksandCDRsrandomizedwithtrinucleotides.″JMolBiol296(1)57-86.Cochet，D.，Kenigsberg，N.，Delumeau，I.，Virone-Dddos，A.，Nulton，N.C.，F(xiàn)ridinan，W.H.，Schweighoffer，F(xiàn).，Teillaud，J.L.和Tocque，B.(1998).″Intracellularexpressionofanantibodyfragment-neutralizingp21raspromotestumorregression.″CancerRes58(6)1170-6.Corpet，F(xiàn).(1988).″Nultalin.Multiplese-quencealignmentwithhierarchicalclustering.″NucleicAcidsRes16(22)10881-10890.Cox，J.P.，Tomlinson，I.N.和Winter，G.(1994).″Adirectoryofhumangerm-lineVkappasegmentsrevealsast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hainFVfragment″CancerResearch595758-5767.Wrn，A.和Pliickthun，A.(1999).″DifferentequilibriumstabilitybehaviorofscFvfragmentsidentification，classification，andimprovementbyproteinengineering″Biochemistry388739-8750.本發(fā)明在如下非限制性的實施例中進一步舉例說明。實施例1通過在酵母“質控”系統(tǒng)中篩選人類文庫而選擇內體構架由“質控”系統(tǒng)篩選穩(wěn)定的構架基本上如AufderMaur詳細描述的那樣進行(WO0148017，AufderMaur2001，特此分別并入作為參考)。用于表達scFv-融合構建體以在酵母中進行篩選的質粒衍生自pESBA-Act(Wrn，2000)。它含有用于釀酒酵母(S.cerevisiae)轉化選擇的酵母TRP1基因，以及2微米復制起點以確保高拷貝數(shù)。而且它具有用于強表達的組成型肌動蛋白啟動子，以及GAL11轉錄終止序列，兩者由多克隆位點隔開。對于細菌系統(tǒng)的操作，它也具有細菌復制起點和amp抗性基因。Gal4激活結構域(AD氨基酸768-881)最初是利用pGAD424(Clontech)作為模板，用包括位于Gal4-ADN-端的SV40T-抗原核定位信號的引物通過PCR擴增的。編碼Gal11P氨基酸263-352的DNA片段通過PCR擴增，并以正確讀碼框克隆到SV40-NLS-Gal4-AD構建體的N-端。人類scFv文庫，是由別處描述的人脾細胞cDNA擴增的(Welschhof，1995；Krebber，1997；deHaard，1999)，通過SfiI位點以正確讀碼框克隆到該融合構建體的N-端，并且取向為VL-接頭-VH，其中接頭具有序列(GGGS)4。從而表達產生具有通式結構scFv-Gal11p-SV40NLS-Gal4AD的融合蛋白。在酵母菌株釀酒酵母YDE172(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385gal4Δ11)(AufderMaur，2001)中實施篩選，所述菌株通過將取向相異的LacZ和HIS3報告基因在來自Gal1-GAL10調控序列的天然UASG調節(jié)之下整合到his3Δ200基因座而衍生自菌株JPY9(Escher，2000)。該報告系統(tǒng)的轉錄激活是繼其Gal11P部分與Gal4-DNA-結合結構域(DBD，氨基酸1-100)特異性相互作用之后，由scFv-融合構建體的Gal4-AD部分介導的。所述Gal4-DBD由第二質粒pMP83的表達提供。它含用于釀酒酵母轉化選擇的酵母LEU2基因以及ARSCEN復制起點。而且，它具有用于強表達的組成型肌動蛋白啟動子以及GAL11轉錄終止序列。對于細菌系統(tǒng)的操作，它也具有細菌復制起點和amp抗性基因。對于篩選，酵母菌株釀酒酵母YDE172由作為位于載體pESBA-Act2之上的融合構建體的scFv-文庫共轉化，而pMP83-載體提供Gal4-DBD。使用標準醋酸鋰轉化方案(Agatep，1998)。在轉化之后，將細胞涂布于含80mM3-氨基三唑的漏失(dropout)平板(-Trp/-Leu/-His)。在于30℃溫育3天后挑取菌落，并在含80mM3-氨基三唑的漏失平板(-Trp/-Leu/-His)上重新劃線。重新長出的菌落通過在含底物X-Gal板的濾紙測定中的藍色形成進行LacZ-表達測試。取陽性菌落用于進一步的分析，包括從酵母中分離scFv-攜帶質粒、轉化大腸桿菌DH5α、從大腸桿菌單菌落中分離質粒、并重新轉化到新鮮制備的酵母菌株YDE172中用于下文所述的測定。所有方法根據本領域普通技術人員眾所周知的標準操作實施。另外，利用了改良的篩選操作，其中scFv直接融合于DNA-結合結構域(LexA氨基酸1-202)和激活結構域(Gal4，氨基酸768-881)，以產生具有如下結構的融合構建體scFv-LexA-NLS-Gal4AD。用于表達scFv-融合構建體以在酵母中進行篩選的質粒衍生自pESBA-Act2。它含有用于釀酒酵母(S.cerevisiae)轉化選擇的酵母TRP1基因，以及2微米復制起點以確保高拷貝數(shù)。而且它具有組成型肌動蛋白啟動子(用于強表達)和GAL11轉錄終止序列，兩者由多克隆位點隔開。對于細菌系統(tǒng)的操作，它也具有細菌復制起點和amp抗性基因。篩選在酵母菌株釀酒酵母ImmunaLHB(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385)中實施，該菌株通過在具有六LexA-結合位點的雙向啟動子(整合型報告質粒pDE200，Escher2000)調控之下將取向相異的LacZ和HIS3報告基因整合到his3Δ200基因座、并將處于具有八LexA-結合位點的啟動子(來自EGY48)調控之下的LEU2報告基因整合到leu2Δ1基因座而衍生自菌株JPY5。該報告系統(tǒng)的轉錄激活是由scFv-融合構建體的Gal4-AD部分介導的。篩選基本上如上文所述利用漏失培養(yǎng)基(-Trp/-Leu/-His)和高達40mM的3-氨基三唑濃度實施。實施例2體內性能評價a)酵母中對于酵母中所選構架性能的定量分析(圖1和3)，釀酒酵母菌株ImmunaLHB用作為pESBA-ACt2載體之上的LexA-Gal4-AD-融合構建體的分離的scFvs按照標準醋酸鋰轉化方案(Agatep，1998)轉化。轉化后，將細胞涂布于漏失平板(-Trp)上。平行接種來自數(shù)個菌落劃線的2ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)的過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在1ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)中稀釋至600nm(OD600)0.7的光密度。它們接著于30℃培養(yǎng)2小時。對于測定，取100μl細胞培養(yǎng)物，與900μl緩沖液、45μl氯仿和30μl0.1％SDS混合，震蕩并于室溫下溫育5分鐘。顯色通過添加0.2mlONPG(4mg/ml)起始，并由0.5mlNa2CO3(1M)終止。活性通過考慮所測培養(yǎng)物的OD600以及顯色的溫育時間和所用的培養(yǎng)物體積計算。對至少等同于或優(yōu)于陽性對照(以前描述的極為穩(wěn)定的λ-移植物(Wrn，2000；AufderMaur，2001))的菌落進行測序，以鑒定構架亞型(構架亞型根據Tomlinson，(1992)，Cox，(1994)和Williams，(1996)定義)。測序揭示了對某些構架亞型驚人的偏好。對于重鏈可變結構域(VH)，構架亞型2和6從未見過，并且亞型4在陽性菌落中顯著減少。分離序列的性能經酵母胞內測定校正后，胞內應用不僅對亞型3，而且還有1a和1b的VH構架都具有極其強烈的偏好。關于輕鏈可變結構域(VL)，對κ1、λ1和λ3亞型的構架具有清楚的偏好(表4)。這些構架亞型，即與κ1、λ1和λ3VL結構域組合的VH1a、1b和3因此最佳地滿足胞內用途以及就scFv折疊特性而言具有嚴格要求的其它應用。用于胞內篩選系統(tǒng)的文庫應當，例如，優(yōu)選僅由這些構架亞型的混合物構件，以減少在還原環(huán)境下無功能分子的數(shù)量。b)哺乳動物細胞中利用Hela細胞系進行人類細胞中所選構架性能的定量分析(圖2、4和7)。熒光素酶報告基因由共轉染的pGL3(Promega)報告質粒提供，其含有處于天然Gal4UAS調控之下的熒光素酶。用于瞬時轉染的哺乳動物表達載體含有Gal4(1-147)，融合于VP16-AD的C-端，處于CMV啟動子的調控之下。分離的scFv以正確的讀碼框克隆到Gal4(1-147)-VP16-融合子的C-端，以便經表達產生Gal4(1-147)-VP16-scFv-融合蛋白。細胞在DMEM中培養(yǎng)，補充有2.5％FCS和2mM1-谷氨酰胺。瞬時轉染根據Polyfect-方案(Qiagen)實施，在60mm組織培養(yǎng)板中利用0.01-0.1μg含scFv-構建體的載體，0.5μgCMV啟動子驅動的Gal4(1-147)-VP16-scFv表達質粒和0.5μgLacZ表達載體用作為轉染效率的參照。細胞在轉染后24-48小時收獲，重懸于1000μl緩沖液中，并通過三次凍融循環(huán)裂解。細胞裂解物離心，對上清利用熒光素酶測定液(Promega)進行熒光素酶活性測定，并根據標準方案測定LacZ活性。所得的熒光素酶活性由LacZ活性校正，以說明轉染效率的變化。實施例3序列比較的多重比對和分析為闡明適用于胞內應用的構架序列的通用模式，分離所有陽性菌落(即在質控系統(tǒng)的選擇條件下生長的那些菌落)，并對編碼scFv的部分進行測序。隨后，scFv以其輕鏈和重鏈組分進行劃分，以允許根據Honegger(2001)結構調整的免疫球蛋白結構域編號策略對各自的結構域進行比對(表1和2)。為允許對所得的數(shù)據加以闡述，建立了代表所選文庫的比對(表3)。為獲得未選的序列，文庫在不表達scFv基因的大腸桿菌細胞中轉化，并隨機挑取菌落用于質粒分離和scFv-序列的測序。文庫如期涵蓋了人類抗體的所有組成部分，因而就特定亞型而言沒有偏差，與由通常見于人類的表達模式所預期的不同。VH和VL序列根據其亞群分組。亞群特異性共有序列的改變被突出顯示。本領域技術人員能夠根據特定交換殘基的結構環(huán)境來辨別陽性、中性和陰性改變(如Honegger，2001)。屬于特定氨基酸組別的殘基交換為同組的殘基一般確認為中性交換。屬于指向蛋白疏水核心的疏水氨基酸組的殘基交換為極性但不帶電荷或者帶正或負電荷的氨基酸組的氨基酸將會是非常不利的，因為不飽和的氫供體/受體位點干擾疏水核心的密堆積。此種改變因此被認為是陰性的。屬于位于免疫球蛋白結構域表面的極性但不帶電荷組的殘基交換為帶正或負電荷組的氨基酸是非常有利的，因為蛋白的可溶性得以提高。此種改變因此確認是陽性的，而由極性交換為疏水殘基是非常不利的，因為蛋白的可溶性下降，因此確認是陰性的。在具有保守正Φ-角的位置處，任何氨基酸交換為甘氨酸確認是陽性的，而甘氨酸交換為任何氨基酸確認是陰性的，因為甘氨酸是唯一能夠形成正Φ-角的氨基酸。因帶正或負電荷的殘基組的氨基酸交換為不帶電荷的氨基酸所致的位置45-53、45-100、77-100以及108-137之間保守鹽橋的喪失導致熱動力學穩(wěn)定性下降，因此認為是陰性的。最后，我們挑選了在質控期間優(yōu)選的7個VL結構域和4個VH結構域(即表現(xiàn)出共有序列的最少陰性和最多陽性交換且涵蓋亞群)，并且每一個在酵母中都表現(xiàn)出高的體內性能。序列總結于表5，并且包括兩個Vκ1(kI27(1.x)和kIII25(2.x))、兩個Vκ3(kIV103(3.x)和kIV135(5.x))、一個Vλ1(kIV107(4.x))、兩個Vλ3(a33(7.x)和a43(6.x))、一個VH1b(a33(x.3))和三個VH3(afw10(x.2)、a43(x.4)和a44(x.1))。這些VL和VH結構域被改組，給出22個scFv形式的新組合(1.1、2.1、3.1、4.1、5.1、1.2、2.2、3.2、4.2、5.2、1.3、2.3、3.3、4.3、5.3、7.3、1.4、2.4、3.4、4.4、5.4、6.4)。實施例4改組的結構域的體內性能評價a)在酵母和哺乳動物細胞胞內測定中的性能如實施例2所述的那樣對這22個組合測試了其在酵母和哺乳動物細胞中的體內性能(圖3和4)。b)可溶性蛋白在酵母中還原條件下的表達為比較可溶性蛋白在還原條件下表達后的產量，所選的構架作為與Gal4AD的融合蛋白在酵母釀酒酵母的胞漿中表達。位于pESBA-Act2載體上的融合構建體具有通式結構Gal4AD-scFv。它們被如上所述轉化到酵母釀酒酵母菌株JPY9中，并涂布于-Trp漏失平板中。接種來自含數(shù)個菌落的劃線的5ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在50ml漏失培養(yǎng)基(-Trp)中稀釋至600nm(OD600)0.5的光密度。它們于30℃培養(yǎng)5小時。對于天然細胞提取物，離心收集2.5ml標準化至OD600為3的細胞培養(yǎng)物，液氮中冷凍，隨后重懸于含蛋白酶抑制劑(PMSF)的75μlY-PER(Pierce)中。重懸的細胞沉淀震蕩片刻，并于20℃溫育(輕搖)20分鐘。不溶和聚集的物質在eppendorf離心機中于4℃以最大速度離心10分鐘沉淀。上清與上樣染料混合，加熱到100℃5分鐘，然后在12％SDS-PAGE上分離?？扇苄訥al4AD-scFv融合構建體由蛋白質印跡通過用抗-Gal4AD單克隆鼠抗體(SantaCruzBiotechnology)作為一抗、而抗-鼠-過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)作為二抗、并利用化學發(fā)光底物(Pierce)檢測Gal4-部分而顯現(xiàn)(圖5)。SDS-PAGE和蛋白質印跡操作是本領域普通技術人員眾所周知的。c)在大腸桿菌周質中的表達行為為評價在大腸桿菌中的周質表達(圖6)，將分離的scFv-構架克隆到帶有cam抗性基因(catR)和lacI阻遏基因(Krebber，1997)的細菌載體上，其中N-端具有pelB-前導序列，而C-端具有his-標簽，處于lac啟動子/操縱子調控之下。感受態(tài)大腸桿菌JM83用這些質粒轉化。在50ml含35mg/l氯霉素的dYT-培養(yǎng)基搖瓶中以1∶40接種過夜培養(yǎng)物，并于30℃溫育。細胞在OD600為0.8時用1mMIPTG誘導，并在誘導3小時之后通過離心收集。沉淀重懸于50mMTris，pH7.5，500mMNaCl中，并標準化至OD600為10。對每個scFv片段樣品或直接(總提取物)分析或在超聲破碎再離心后(可溶性級分)通過SDS-PAGE進行分析?？扇艿鞍椎暮坑煽捡R斯亮蘭染色的凝膠估計。實施例5具有優(yōu)良特性的5個組合用于胞外用途的詳細評價選取五個組合作為實例，它們在酵母和哺乳動物胞內測定中表現(xiàn)出良好性能，在酵母和大腸桿菌表達期間產生可溶性蛋白，并且涵蓋了在質控期間偏好選擇的亞群(2.4、4.4、5.2、6.4和7.3，詳見表5)。我們更為詳細地分析這些組合，以進一步評價其在還原以及氧化條件下的用途。a)在不同哺乳動物細胞的胞內測定中的性能五個組合在人類細胞中性能的定量分析利用Hela細胞并且額外利用人骨肉瘤細胞系Saos-2和人胚腎細胞系HEK293如實施例2所進行的那樣實施(圖7)。b)體外表達和純化的性能為評價體外性能，將五個優(yōu)良組合在大腸桿菌周質中表達(圖6)。在0.1l含35mg/l氯霉素的dYT-培養(yǎng)基搖瓶中以1∶40接種過夜培養(yǎng)物，并于30℃溫育。細胞在OD550為1.5時用1mMIPTG誘導，并在誘導2小時之后通過離心收集。為純化scFv，將細胞沉淀重懸并通過超聲裂解。在可溶蛋白的含量由考馬斯亮蘭染色的凝膠估計。在SS34中以20krpm、4℃離心30分鐘之后，將上清以pH7.5施加到Ni-MC-親合柱(Hi-TrapTMChelatingHP，1ml，AmershamPharmacia)上，并利用來自AmershaxnPharmacia的ktaBasic系統(tǒng)由200mM咪唑洗脫。scFv片段的純度大于98％，如通過SDS-PAGE所測定的(數(shù)據未顯示)。純化蛋白的濃度利用計算的280nm處的消光系數(shù)確定?？扇苄约兓鞍椎漠a量以OD600為10的1升培養(yǎng)物體積標準化，并且從8到超過55mg不等。聚集抗性聚集抗性已證明與體外的熱動力學穩(wěn)定性(Wrn，1999)以及小鼠異種移植腫瘤模型的腫瘤定位效率(Willuda，1999)有關。為了測試穩(wěn)定性、聚集抗性以及解折疊可逆性，處于50mMTris，pH7.5，100mMNaCl中濃度為6μM的200μl純化蛋白樣品或于4℃保存4天或37℃4天或4℃3天，緊接著在100℃溫育15或60分鐘，緩慢冷卻至室溫，并于4℃過夜溫育。每個樣品的寡聚狀態(tài)隨后在由50mMTris，pH7.5，100mMNaCl平衡的凝膠過濾柱上分析，以估計聚集體相對于單體物質的含量(圖8)。將蛋白以100μl的體積在ktaBasic系統(tǒng)(AmershainPharmacia)中以1ml/分的流速注入Superdex-75柱(AmershamPharmacia)中。蛋白酶降解抗性為確定分離的構架就蛋白酶降解而言的穩(wěn)定性(對于治療應用很重要的一個參數(shù))，我們在人類血清中于37℃溫育純化的構架(圖9)。將濃度為50μM的純化的his-標記的scFv-蛋白(見上文)在人類血清中稀釋10倍，至90％血清中的終濃度5μM。樣品然后在37℃溫育3天或1天，或者直接取來上樣。在上樣前，不溶和聚集的物質在eppendorf離心機中于4℃以最大速度離心10分鐘沉淀。上清由上樣染料稀釋6倍，以降低上樣到凝膠上的血清的量，100℃加熱5分鐘，然后在12％SDS-PAGE上分離?？扇苄詇is-標記的scFv片段由蛋白質印跡通過用抗-his單克隆鼠抗體(Qiagen)作為一抗、而抗-鼠-過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)作為二抗、并利用化學發(fā)光底物(Pierce)檢測his-標簽觀察。SDS-PAGE和蛋白質印跡操作是本領域普通技術人員眾所周知的。實施例6通過在酵母交互作用篩選系統(tǒng)中在構架7.3中篩選隨機化的CDR-文庫來選擇抗原結合劑用交互作用系統(tǒng)篩選抗原結合劑基本上如以前所詳述的那樣進行(AufderMaur，2002)。用于表達scFv-融合構建體以在酵母中進行篩選的質粒衍生自pESBA-Act2。它含有酵母TRP1營養(yǎng)標記和2微米復制起點。而且它具有用于強表達的組成型肌動蛋白啟動子和GAL11轉錄終止序列，兩者由多克隆位點隔開。對于細菌系統(tǒng)的操作，它也具有細菌復制起點和amp抗性基因。Gal4激活結構域(AD氨基酸768-881)最初是利用pGAD424(Clontech)作為模板，用包括位于Gal4-ADN-端的SV40T-抗原核定位信號在內的引物通過PCR擴增的。scFv文庫利用引物隨機化VH的CDR3內的7個氨基酸通過PCR擴增scFv-構架7.3而獲得。所得的PCR產物以正確讀碼框克隆進構架7.3中，以VL-接頭-VH的取向存在于載體中，作為Gal4-AD的C-端融合物。從而表達產生具有通式結構Gal4-AD-scFv的融合蛋白。在酵母菌株釀酒酵母ImmunaLHB(MATαura3-52leu2Δ1trp1d63his3Δ200lys2Δ385)中實施篩選。它通過將處于具有六個LexA-結合位點的雙向啟動子調控之下的取向相異的LacZ和HIS3報告基因(整合型報告質粒pDE200，Escher2000)整合到his3Δ200基因座、并將處于具有八個LexA-結合位點的啟動子(來自EGY48)調控之下的LEU2報告基因整合到leu2Δ1基因座而衍生自菌株JPY5。該報告系統(tǒng)的轉錄激活是繼其scFv部分與誘餌-融合蛋白的抗原部分特異性相互作用之后，由scFv-融合構建體的Gal4-AD部分介導的。誘餌-融合蛋白由融合于DNA-結合LexA蛋白C-端的人類球樣激酶1的激酶結構域(hPlk1-KD)組成。激酶結構域(氨基酸2-332)由hPlk1cDNA利用上游引物5′-tgctctagaagtgctgcagtgactgcag-3′(Seq.Id.No.12)和下游引物5′-ggttgtcgacttacaggctgctgggagcaatcg-3′(Seq.Id.No.13)進行PCR擴增。所得的PCR產物通過XbaI和SalI被克隆到的誘餌載體中LexA的C-端。誘餌載體含有URA3營養(yǎng)標記和ArsCen復制起點。誘餌-融合蛋白的表達由組成型活性的肌動蛋白啟動子驅動。轉錄通過GAL11終止序列終止。誘餌蛋白也攜帶用于在細菌系統(tǒng)中增殖的細菌復制起點和amp抗性基因。對于篩選，酵母菌株釀酒酵母ImmunaLHB由作為位于載體pESBA-Act2之上Gal4-AD的融合物的scFv-文庫以及提供LexA-hPLK1-KD融合子的誘餌載體按照標準醋酸鋰轉化方案(Agatep，1998)共轉化。在轉化之后，將細胞涂布于漏失平板(-Trp/-Leu/-Ura)。于30℃溫育3到5天后挑取菌落，并在漏失平板(-Trp/-Leu/-Ura)上重新劃線。重新長出的菌落通過在含底物X-Gal板的濾紙測定中的藍色形成進行LacZ-表達測試。取陽性菌落用于進一步的分析，包括從酵母中分離攜帶scFv的質粒、轉化大腸桿菌DH5α、從大腸桿菌單菌落中分離質粒、測序并重新轉化到新鮮制備的酵母菌株ImmunaLHB中用于下文所述的測定。所有方法根據本領域普通技術人員眾所周知的標準操作實施。實施例7來自新scFv構架的Fab構建體體內性能的評價為評價在不同抗體形式中使用穩(wěn)定可變結構域構架的有益效果，構建Fab表達載體用于酵母相互作用的篩選。a)用于酵母胞內篩選的Fab構建體構建了兩個不同的表達載體以允許不同的表達水平。所述載體以yEplac112(2微米)或yCplac22(ars/cen)主鏈(Gietz，1988)為基礎。兩者都含有酵母TRP1營養(yǎng)標記、可誘導的雙向Gal1/Gal10啟動子、用于細菌系統(tǒng)操作的細菌復制起點以及amp抗性基因。在一個方向上，構架7.3的VH結構域被克隆到包括C-端半胱氨酸的IgG1的CH1-結構域的N-端，緊接著是接頭和包括SV40T-抗原在內的Gal4激活結構域(AD氨基酸768-881)。在另一側，構架7.3的VL結構域被克隆到包括C-端半胱氨酸的CL(λ)結構域的N-端。終止子為重鏈側的Gal11終止子以及輕鏈側的Cyclin1終止子。b)酵母胞內測定中的性能為定量分析酵母中scFv和Fab形式的抗原結合劑的性能(圖1和3)，釀酒酵母菌株ImmunaLHB由作為載體pESBA-Act2上的Gal4-AD-融合物構建體的分離的scFv以及含LexA-hPLK-KD融合子的誘餌載體按照標準醋酸鋰轉化方案(Agatep，1998)共轉化。在轉化之后，將細胞涂布于漏失平板(-Trp，-Ura，Glc)。平行接種來自數(shù)個菌落劃線的2ml漏失培養(yǎng)基(-Trp，-Ura，Glc)過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在1ml漏失培養(yǎng)基(-Trp，-Ura，Glc)中稀釋至600nm(OD600)0.7的光密度。它們于30℃培養(yǎng)5小時。測定如上文所述進行。C)酵母中還原條件下可溶性蛋白的表達為比較可溶性蛋白在還原條件下表達后的產量，scFv和Fab構建體、連同hPLK1-KD-誘餌載體，如上文所述在酵母菌釀酒酵母的胞漿中表達。它們如上文所述被轉化到酵母菌株YDE173中，并涂布于含葡萄糖的-Trp、-Ura漏失平板上。接種來自含數(shù)個菌落的劃線的5ml漏失培養(yǎng)基(-Trp，-Ura，Glc)過夜培養(yǎng)物，并于30℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)物在YPAG中稀釋至600nm(OD600)0.5的光密度。它們于30℃培養(yǎng)7.5小時。測定如上文所述進行。對于天然細胞提取物，離心收集2.5ml標準化至OD600為3的細胞培養(yǎng)物，液氮中冷凍，隨后重懸于75μlY-PER(Pierce)中。重懸的細胞沉淀震蕩片刻，并于20℃輕搖溫育20分鐘。隨后不溶和聚集的物質在eppendorf離心機中于4℃以最大速度離心10分鐘沉淀。上清與上樣染料混合，100℃加熱5分鐘，并在12％SDS-PAGE上分離?？扇苄訥al4AD-scFv融合物和融合于Gal4-AD的Fab重鏈部分由蛋白質印跡通過用抗-Gal4-AD單克隆鼠抗體(SantaCruzBiotechnology)作為一抗、而抗-鼠-過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)作為二抗、并利用化學發(fā)光底物(Pierce)檢測Gal4-成分的顯現(xiàn)(圖11)。SDS-PAGE和蛋白質印跡操作是本領域普通技術人員眾所周知的。序列表<110>ESBATECHAG<120>在胞內環(huán)境中表現(xiàn)出增強的穩(wěn)定性的免疫球蛋白構架及其鑒定方法<130>08420PC<150>US60/382,649<151>2002-05-22<150>US60/438,246<151>2003-01-03<160>13<170>PatentInversion3.1<210>1<211>107<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>1GluIleValMetThrGlnSerProSerThrLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValIleIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTrp202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrLysAlaSerSerLeuGluSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyAlaGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580AspAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTyrLysSerTyrTrpThr859095PheGlyGlnGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105<210>2<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>2GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerValGly151015AspArgValThrLeuThrCysArgAlaSerGlnGlyIleArgAsnGlu202530LeuAlaTrpTyrGlnGlnArgProGlyLysAlaProLysArgLeuIle354045TyrAlaGlySerIleLeuGlnSerGlyValProSerArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleSerSerLeuGlnPro65707580GluAspValAlaValTyrTyrCysGlnGlnTyrTyrSerLeuProTyr859095MetPheGlyGlnGlyThrLysValAspIleLysArg100105<210>3<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>3GluIleValMetThrGlnSerProAlaThrLeuSerValSerProGly151015GluSerAlaAlaLeuSerCysArgAlaSerGlnGlyValSerThrAsn202530ValAlaTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrGlyAlaThrThrArgAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrGluPheThrLeuThrIleAsnSerLeuGlnSer65707580GluAspPheAlaAlaTyrTyrCysGlnGlnTyrLysHisTrpProPro859095TrpThrPheGlyGlnGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>4<211>111<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>4GlnSerValLeuThrGlnProProSerValSerAlaAlaProGlyGln151015LysValThrIleSerCysSerGlySerThrSerAsnIleGlyAspAsn202530TyrValSerTrpTyrGlnGlnLeuProGlyThrAlaProGlnLeuLeu354045IleTyrAspAsnThrLysArgProSerGlyIleProAspArgPheSer505560GlySerLysSerGlyThrSerAlaThrLeuGlyIleThrGlyLeuGln65707580ThrGlyAspGluAlaAspTyrTyrCysGlyThrTrpAspSerSerLeu859095SerGlyValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105110<210>5<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>5GluIleValLeuThrGlnSerProAlaThrLeuSerLeuSerProGly151015GluArgAlaThrLeuSerCysArgAlaSerGlnThrLeuThrHisTyr202530LeuAlaTrpThrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProArgLeuLeuIle354045TyrAspThrSerLysArgAlaThrGlyValProAlaArgPheSerGly505560SerGlySerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerSerLeuGluPro65707580GluAspSerAlaLeuTyrTyrCysGlnGlnArgAsnSerTrpProHis859095ThrPheGlyGlyGlyThrLysLeuGluIleLysArg100105<210>6<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>6SerTyrValLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGln151015ThrAlaThrValThrCysGlyGlyAsnAsnIleGlySerLysSerVal202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuValValTyr354045AspAspSerAspArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrIleArgArgValGluAlaGly65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspSerSerSerAspHis859095AsnValPheGlySerGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>7<211>109<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>7LeuProValLeuThrGlnProProSerValSerValAlaProGlyGln151015ThrAlaArgIleSerCysGlyGlyAsnAsnIleGluThrIleSerVal202530HisTrpTyrGlnGlnLysProGlyGlnAlaProValLeuVa1ValSer354045AspAspSerValArgProSerGlyIleProGluArgPheSerGlySer505560AsnSerGlyAsnThrAlaThrLeuThrIleSerArgValGluAlaGly65707580AspGluAlaAspTyrTyrCysGlnValTrpAspSerSerSerAspTyr859095ValValPheGlyGlyGlyThrLysLeuThrValLeuGly100105<210>8<211>124<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>8GlnValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaAlaHisValLeuArgPheLeuGluTrpLeuProAspAlaPheAsp100105110IleTrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>9<211>108<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>9GluIleValLeuThrGlnSerProSerSerLeuSerAlaSerLeuGly151015AspArgValThrIleThrCysArgAlaSerGlnSerIleSerSerTyr202530LeuAsnTrpTyrGlnGlnLysProGlyLysAlaProLysLeuLeuIle354045TyrAlaAlaSerSerSerGlnSerGlyValProSerArgPheArgGly505560SerGluSerGlyThrAspPheThrLeuThrIleSerAsnLeuGlnPro65707580GluAspPheAlaThrTyrTyrCysGlnGlnSerTyrArgThrProPhe859095ThrPheGlyProGlyThrLysValGluIleLysArg100105<210>10<211>123<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>10ValGlnLeuValGlnSerGlyAlaGluValLysLysProGlyAlaSer151015ValLysValSerCysThrAlaSerGlyTyrSerPheThrGlyTyrPhe202530LeuHisTrpValArgGlnAlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMetGly354045ArgIleAsnProAspSerGlyAspThrIleTyrAlaGlnLysPheGln505560AspArgValThrLeuThrArgAspThrSerIleGlyThrValTyrMet65707580GluLeuThrSerLeuThrSerAspAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgValProArgGlyThrTyrLeuAspProTrpAspTyrPheAspTyr100105110TrpGlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>11<211>122<212>PRT<213>人工序列<220><223>抗體構架<400>11GluValGlnLeuValGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530AlaMetSerTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerGlySerGlyGlySerThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaLysAspAlaGlyIleAlaValAlaGlyThrGlyPheAspTyrTrp100105110GlyGlnGlyThrLeuValThrValSerSer115120<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>12tgctctagaagtgctgcagtgactgcag28<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>13ggttgtcgacttacaggctgctgggagcaatcg3權利要求1.單鏈構架，具有如下通式結構NH2-VL-接頭-VH-COOH；或NH2-VH-接頭-VL-COOH其中VH構架為1a、1b或3亞型。2.融合于第二蛋白成分的單鏈構架，以產生具有如下通式結構的融合構建體NH2-VL-接頭-VH-第二蛋白-COOH；或NH2-第二蛋白-VL-接頭-VH-COOH其中VH構架為1a、1b或3亞型。3.權利要求1或2的單鏈構架，其中VH和VL區(qū)的取向顛倒。4.根據權利要求1至3的單鏈構架，其中VL構架為κ1、λ1或3型。5.根據權利要求2的單鏈構架，其中第二蛋白為胞內測定提供讀出信息。6.單鏈構架，選自下組AH、BH、CH、DH、EH、FH、GH、AI、BI、CI、DI、EI、FI、GI、AJ、BJ、CJ、DJ、EJ、FJ、GJ、AK、BK、CK、DK、EK、FK及GK其中A為氨基酸序列(Seq.Id.No.1)EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYKSYWTFGQGTKLTVLG；B為氨基酸序列(Seq.Id.No.2)EIVLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGIRNELAWYQQRPGKAPKRLIYAGSILQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDVAVYYCQQYYSLPYMFGQGTKVDIKR；C為氨基酸序列(Seq.Id.No.3)EIVMTQSPATLSVSPGESAALSCRASQGVSTNVAWYQQKPGQAPRLLIYGATTRASGVPARFSGSGSGTEFTLTINSLQSEDFAAYYCQQYKHWPPWTFGQGTKVEIKR；D為氨基酸序列(Seq.Id.No.4)QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSTSNIGDNYVSWYQQLPGTAPQLLIYDNTKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSGVVFGGGTKLTVLG；E為氨基酸序列(Seq.Id.No.5)EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQTLTHYLAWYQQKPGQAPRLLIYDTSKRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDSALYYCQQRNSWPHTFGGGTKLEIKR；F為氨基酸序列(Seq.Id.No.6)SYVLTQPPSVSVAPGQTATVTCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIRRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHNVFGSGTKVEIKR；G為氨基酸序列(Seq.Id.No.7)LPVLTQPPSVSVAPGQTARISCGGNNIETISVHWYQQKPGQAPVLVVSDDSVRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVVFGGGTKLTVLG；H為氨基酸序列(Seq.Id.No.8)QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAAHVLRFLEWLPDAFDIWGQGTLVTVSS；I為氨基酸序列(Seq.Id.No.9)EIVLTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSSQSGVPSRFRGSESGTDFTLTISNLQPEDFATYYCQQSYRTPFTFGPGTKVEIKR；J為氨基酸序列(Seq.Id.No.10)VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGYSFTGYFLHWVRQAPGQGLEWMGRINPDSGDTIYAQKFQDRVTLTRDTSIGTVYMELTSLTSDDTAVYYCARVPRGTYLDPWDYFDYWGQGTLVTVSS；且K為氨基酸序列(Seq.Id.No.11)EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDAGIAVAGTGFDYWGQGTLVTVSS。7.單鏈構架，選自根據權利要求6的單鏈構架的變體。8.單鏈構架，選自根據權利要求6的單鏈構架的衍生物。9.根據權利要求1-7或17-18中任一項的單鏈構架、抗體或抗體片段在靶確認、診斷應用、文庫構建或治療應用中的用途。10.至少兩個構架序列在鑒定保守構架殘基種類中的用途。11.根據權利要求10的用途，其中保守構架殘基種類選自下組極性但不帶電荷的R基團；帶正電荷的R基團；帶負電荷的R基團；疏水R基團；及特定氨基酸。12.至少兩個構架序列在鑒定至少一個保守構架序列中的用途。13.根據權利要求12的用途，其中保守構架序列為2-5個殘基。14.根據權利要求12的用途，其中保守構架序列為5-10個殘基。15.根據權利要求12的用途，其中保守構架序列為10-25個殘基。16.根據權利要求12-15的用途，其中保守構架序列具有缺口。17.抗體，包括來自根據權利要求1-8中任一項的單鏈構架的VL或VH或兩者兼而有之。18.抗體片段，包括來自根據權利要求1-8中任一項的單鏈構架的VL或VH或兩者兼而有之。19.核酸，能夠編碼根據權利要求1-8中任一項的單鏈構架。20.載體，包含根據權利要求19的核酸。21.宿主細胞，包含根據權利要求19的核酸。22.根據權利要求19的核酸在基因治療中的用途。全文摘要本發(fā)明提供了組合物，其可作為用于創(chuàng)建極為穩(wěn)定且可溶的單鏈Fv抗體片段的構架。這些構架經胞內性能選擇，因而可理想地適用于創(chuàng)建scFv抗體片段或scFv抗體文庫，以用于其中穩(wěn)定性和可溶性為抗體片段性能的限制因素的應用，例如在細胞的還原環(huán)境中。此類構架也可用于鑒定表現(xiàn)出增強的可溶性和穩(wěn)定性的高度保守殘基及共有序列。文檔編號C07K16/18GK1662556SQ03814626公開日2005年8月31日申請日期2003年5月21日優(yōu)先權日2002年5月22日發(fā)明者K·緹索特,S·艾沃特,A·奧弗德爾茂爾,A·巴伯里斯,D·艾施爾申請人:艾斯巴技術股份公司