專利名稱：通過使用半抗體生物傳感器形成穩(wěn)態(tài)環(huán)用于檢測和調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子(vegf)的方法 ...的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及化學生物傳感器，或者更具體地涉及固定并聯(lián)板化學生物傳感器和電容陣列，以及使用固定的單克隆半抗體制造它們的方法。
背景技術：
在正常生理發(fā)育中，VEGF是胚胎發(fā)生(血管生成(vasculogenesis))和成體血管形成(血管發(fā)生(angiogenesis))中血管發(fā)育的關鍵調(diào)節(jié)物。VEGF和VEGF-受體蛋白家族的成員具有不同、但重疊的配體-受體特異性、細胞類型表達和功能。VEGF-受體活化反過來又可調(diào)節(jié)身體中促進內(nèi)皮細胞生長、遷移和存活的信號傳遞過程網(wǎng)絡。VEGF還在發(fā)生于多種疾病(包括癌癥)的病理性血管發(fā)生中起關鍵作用。VEGF和Flk-l/KDR RTK已被認為是病理性血管發(fā)生(包括腫瘤新血管形成)所需的關鍵的內(nèi)皮細胞-特異性因子信號傳遞通路。在腫瘤發(fā)展中，激活VEGF通路可促進腫瘤血管形成、加速腫瘤生長和轉移。異常VEGF功能還與包括動脈粥樣硬化、銀屑病、年齡相關性黃斑變性、糖尿病失明、類風濕性關節(jié)炎和甲狀腺功能亢進的其他疾病相關。對血管發(fā)生的生物學理解的進展已經(jīng)導致開發(fā)了數(shù)種治療形式，用于抑制VEGF酪氨酸激酶信號傳遞通路。在正在生長的腫瘤中，抑制VEGF酪氨酸激酶信號傳遞通路可阻斷新血管形成，導致腫瘤生長停滯或消退。人腫瘤的生長和轉移的發(fā)生依賴于血管的從新形成，以實現(xiàn)低氧腫瘤微環(huán)境并向其提供養(yǎng)分。新血管形成受到靶向受體酪氨酸激酶(RTK)的特異性生長因子的嚴格調(diào)控。通過使用人源化單克隆抗體貝伐單抗(bevacizumab)
(Avastin , Genentech/Roche)以及靶向VEGF受體(VEGF-R)酪氨酸激酶的兩種激酶抑制劑索拉非尼(sorafenib, Nexavar; Bayer)和舒尼替尼(sunitinib, Sutent, Pfizer)阻斷VEGF的初步努力開始在人癌癥患者中顯示出希望，這凸顯了優(yōu)化VEGF阻斷對神經(jīng)系統(tǒng)癌癥的重要性。許多的這些形式正在臨床研究中被調(diào)查以評價它們治療多種形式的人癌癥的可能性，但這類研究的能力受限于這樣的事實，即不容易進行VEGF水平和VEGF轉導趨向的局部實時體內(nèi)測量。已知可連續(xù)監(jiān)測其周圍環(huán)境以提供背景統(tǒng)計并對不健康狀態(tài)提出警示的生物傳感器被用于醫(yī)學技術中。在本申請中，尋求微量溶液以使所述生物傳感器的成本和影響最小，并使其使用壽命最大。在治療持續(xù)期間由于監(jiān)控腫瘤生長和消除過程的內(nèi)在需求，使用一次性使用的生物傳感器具有局限性?，F(xiàn)有技術對“生物傳感器”主題的討論是廣泛和深遠的。有許多生物傳感器的實例(例如重量分析生物傳感器(gravimetric biosensor))。檢測基礎是當各種分析物連接至共振元件時發(fā)生的共振器共振頻率降低。生物分析物的分析物特異性是通過用配體功能化(處理)所述共振器的暴露表面而被賦予的，所述配體可識別并結合所述靶分析物。靶生物分析物的合適結合實體的實例包括抗體、受體、凝集素、適體和寡核苷酸?，F(xiàn)有技術中存在的一種類型的生物傳感器是重量分析生物傳感器，其中固定的結合基團位于膜表面上的一個或多個區(qū)域。所述固定的結合基團的位置、大小、區(qū)域和固定密度被設計為，使觀察到的由所述靶分析物結合引起的所述膜頻率和/或幅度的改變最大化。這繼而使通過隨后基于特異性和非特異性結合的所有組合的所述膜頻率和/或幅度改變而可觀察到的區(qū)別最大化。該區(qū)別可以采取三種形式Ca)所述膜共振頻率的變化，(b)較高階諧振的出現(xiàn)或消失，或者(c )振幅衰變率的變化。在這類生物傳感器中，單個的膜可以由多個用于驅動和用于傳感目的的可單獨尋址元件組成。這使得可特異性激活所選擇的較高階振動模式并且能夠同時振動驅動警報電路或類似裝置。聲波分析——其可用于重量分析傳感器——的原理是公知的，其在文獻中已經(jīng)出現(xiàn)十年以上。分子相互作用可以通過生物大分子的極化率而用電子方法檢測，通過使用熒光標簽而用光學方法檢測，通過使用放射性標記的標簽而用放射測量法檢測，或者用聲學方法檢測。最近，基于MEMS的傳感器已被納入生物技術和生物醫(yī)學領域。聲學生物傳感器的應用包括細胞檢測、葡萄糖生物傳感、抗體-抗原識別和蛋白質(zhì)吸附檢測。20世紀50年代后期以來，壓電石英晶體微天平(QCM)已經(jīng)被用于檢測氣相和液相分析物。QCM技術在最近被應用于生物分析物。QCM已被用于跟蹤蛋白質(zhì)對未修飾的和修飾的石英晶體表面電極的非特異性吸附。將抗體固定于所述晶體表面可賦予分析物以特異性。需要一種裝置，其具有的結構可用于構建用于無標記檢測VEGF雜交的固態(tài)生物傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
提供如下本發(fā)明所列舉的實施方案概要以幫助理解本發(fā)明特有的一些創(chuàng)新特征，但不是意欲進行全面描述?？梢酝ㄟ^將整個說明書、權利要求書、附圖和摘要作為一個整體而獲得對本發(fā)明各個方面的全面了解。對本領域普通技術人員來說，一旦閱讀本說明書，本發(fā)明的其他目標和優(yōu)點就會明顯。本發(fā)明列舉的實施方案的內(nèi)容涉及通過使用固態(tài)制造技術的集成平臺連同與被稱為人源化單克隆抗體的蛋白元件(被選擇用于以高親和性力結合特定特異性靶蛋白靶標)的集成平臺構建的生物傳感器。具體地，從轉移區(qū)域取得的腫瘤流體中發(fā)現(xiàn)的VEGF分子和固定的a-VEGF mhAb之間的雜交改變了傳感器電極的電化學性質(zhì),這種改變可通過所述裝置的電路來檢測。本發(fā)明列舉的實施方案的目標是通過測量VEGF分子與所述電容器極板的結合率而將腫瘤發(fā)生的生長速率與所述腫瘤流體中的VEGF水平相關聯(lián)，并用所述VEGF傳感的向量/趨勢計劃所述化學療法的過程。所述電容器極板以互相交叉模式(interdigitated pattern)排列以使給定傳感器體積的檢測表面積最大化?？删_提供對VEGF水平的實時反饋的植入體內(nèi)裝置對于任何精細調(diào)節(jié)的抗血管發(fā)生治療是至關重要的，使得系統(tǒng)可被邏輯地調(diào)節(jié)，并減少或改變抗血管發(fā)生試劑的攝入。本發(fā)明列舉的實施方案通過在已知時間范圍內(nèi)模擬VEGF結合到VEGF單克隆抗體的過程來測量VEGF水平，并提供適合的VEGF水平反饋，用于受調(diào)節(jié)的藥物和化學療法反饋回路。呈現(xiàn)了所提出的VEGF檢測器的制造，使用了技術和設備中所取得的顯著改進用于制造微型裝置，并因此概述了微機械設備的使用。硅制造和高精機械的改進開辟了用于研究和開發(fā)應用的現(xiàn)稱為微電子機械系統(tǒng)(MEMS)的領域。隨后開發(fā)的微型閥、泵、槽和熱交換器使得可操作極其小的流體體積。與集成電路(IC)和MEMS領域中改善的大規(guī)模制造技術相結合，微流體和微化學系統(tǒng)被應用于實現(xiàn)本發(fā)明列舉的實施方案。本發(fā)明列舉的實施方案包括具有可在單個流體樣品上操作的多個裝置的協(xié)同且可變通的傳感器系統(tǒng)。所述裝置可以借助板載處理邏輯塊進行全自動化學分析。所述列舉的實施方案包括一種具有如下結構的裝置，所述結構可用于構建用于無標記檢測VEGF雜交的固態(tài)生物傳感器。這個裝置是通過以下方式實現(xiàn)形成以互相交叉模式排列的并聯(lián)電容器的矩陣陣列，以達到對于最小電化學變化的高比值信號，并伴隨電等值，從而可實現(xiàn)低成本、便攜、完全集成的裝置。用于檢測興趣分子存在的生物傳感器可應用于多個領域，包括醫(yī)學診斷、生物醫(yī)學研究以及生物和化學戰(zhàn)爭中所用試劑的檢測。存在對具有高敏感性的廉價、袖珍傳感器的需求，所述傳感器用于實時地在體內(nèi)、無標記環(huán)境中檢測VEGF分子，目的是報告狀態(tài)例如濃度水平的趨勢，并進一步使得可以形成閉合反饋回路以使用藥物有效地調(diào)節(jié)(減弱、改變)所述生物活性。一般而言，生物靶復合體由可通過催化表面增強底物(例如單克隆抗體)形成的種子物質(zhì)加上標簽。然后，所述靶復合體可以結合至包括有VEGF標記物的捕獲劑。然后，通過還原固定的捕獲分子例如VEGF單克隆半抗體(a-VEGF mhAb)而在所述種子物質(zhì)上生成所述底物。因此，在一個實施方案中，提供了一種生物靶復合體，其包括與第一特異性結合成員締合的靶分析物。所述靶復合體進一步包括與所述第一特異性結合成員結合形成靶復合體的第二特異性結合成員。所述第二特異性結合成員包括適用于催化表面增強的a-VEGFmhAb底物形成的種子顆粒(seed particle)。在另一個實施方案中，適于結合任何已知的癌癥標志物的任何種子顆粒都可使用本公開的方法被附著到所述靶復合體上。隨后，所述復合體底物可以借助所述電子電路而活化，以提供所必需的阻抗效應變化。這些重要目標和其他重要目標根據(jù)如下對本發(fā)明的描述將變得明顯。本發(fā)明的一個實施方案的目的是提供流體電池，所述流體電池被配置以使VEGF樣品可在芯片的活性表面流動。流體流過所述傳感器的速率是受控制的，使得可以實現(xiàn)VEGF分子在所述流體中與所述固定的a-VEGF mhAb的雜交和去雜交。詳細計算所述雜交能量是去雜交并洗去所述VEGF分子以使所述傳感器可重復用于進一步檢測的計劃的一部分。所述裝置還需要通過使用基于適于結合VEGF單克隆抗體的電化學結合機制來檢測所述VEGF分子的存在。當血液或腫瘤流體流過所述生物傳感器時，漂浮的VEGF抗原將被所述表面固定的VEGF半抗體捕獲，其中所述半抗體的抗原結合位點(稱為Fab)特異性結合到所述抗原的表位位點。所述結合是由下述力的組合驅動和決定的靜電鍵、氫鍵、范德華力、疏水力和芳香η鍵。在具體的進一步開發(fā)中，本發(fā)明中至少一個實施方案的方法有利地利用電化學檢測的方法，特別是將氧化還原循環(huán)與單克隆抗體標記物結合以產(chǎn)生半抗體。連接a-VEGFmAb的兩條重鏈的二硫鍵可被選擇性地切割以產(chǎn)生兩個a-VEGF mhAb,所述a-VEGF mhAb具有完整的結合位點和反應性巰基并可以以位點特異的方式共軛結合到VEGF。由單個VEGF mAb產(chǎn)生兩個半抗體的目的是降低所述固定的a-VEGF mhAb的Fab和VEGF之間的結合親和力水平。該結合親和力水平小于報道的VEGF與a-VEGF mAb鍵之間的結合親和力水平(Kd=3. 4±0· 9ηΜ)。本發(fā)明進一步的目的是利用a-VEGF mhAb半抗體分子，因為a_VEGF mhAb和VEGF結合親和力低于所述生物傳感器表面形成中所產(chǎn)生的所有其他鍵的結合親和力。因為aVEGF mhAb和VEGF之間的鍵的親和力具有高特異性但是其親和力弱于本發(fā)明中呈現(xiàn)的其他鍵，所以所述VEGF分子可從它們與aVEGF mhAb分子的鍵“釋放”以使得所述生物傳感器表面可被重復使用多次。該“釋放”是通過在所述生物傳感器板上引入小的電流以提供能源，并通過本發(fā)明公開的壓電微流體泵產(chǎn)生的流體流而產(chǎn)生的。另一項開發(fā)是制備具有馬來酰亞胺封端的自組裝單層(SAM)的硅表面，使得所述a-VEGF mhAb可直接結合到該表面并且以方向特異的方式固定到所述Si02表面。該化學反應將保持所述a-VEGF mhAb的抗原結合位點朝向外部。所述a-VEGF mhAb在所述底物上的涂敷密度將通過制備過程中hAb的濃度確定。本發(fā)明的一個實施方案的目的是產(chǎn)生具有電極性的傳感器，目的是自然地吸引VEGF分子本身帶的負電荷，同時進一步調(diào)整所述電路的閾電壓。所述新的傳感器應該用優(yōu)選涂敷有P-Si底物的絕緣電極構建，以幫助將所述VEGF分子帶到所述電極的表面并增強所述VEGF分子和抗體之間的親和力。本發(fā)明的另一個目的是能夠反轉所述電極性，目的是從所述固定的a-VEGF mhAb排斥并釋放VEGF。所述電極性產(chǎn)生的力使得它可以克服VEGF與a-VEGF mhAb之間由于靜電鍵、氫鍵、范德華力、疏水作用力和芳香π鍵的結合，但小于多種連接分子之間的共價鍵。本發(fā)明實施方案之一的另一個目的是一種具有并聯(lián)電極陣列的裝置，所述并聯(lián)電極陣列以互相交叉模式排列，以最大化VEGF雜交的表面面積并提高檢測敏感度。本發(fā)明的多個實施方案涉及用于多重生物測定的信號放大方法，所述方法使用至少一個裝置來監(jiān)測所述芯片的矩陣陣列位置上的VEGF分子雜交。所述裝置應裝配有計算裝置，目的是在所述時間范圍內(nèi)提供傳感輸出，從而檢測、報告并形成穩(wěn)態(tài)環(huán)以指導醫(yī)藥劑的治療性介入。所述裝置周期性地`測量、儲存并報告?zhèn)鞲休敵鲭娭?，所述電值與VEGF分子和固定的a-VEGF mhAb的雜交有關。本發(fā)明的一個實施方案是體內(nèi)檢測VEGF分子，這不僅提供了腫瘤負荷的當前狀態(tài)信息，而且VEGF分子隨時間的趨勢可用于反映化學治療劑和生物學反應調(diào)節(jié)劑(BRM)的效力，用于腫瘤負荷降低和消除的目的。本發(fā)明一個實施方案的一個目標是通過無線電設備實時監(jiān)測與腫瘤負荷的當前狀態(tài)信息相關的VEGF檢測傳感輸出。所述裝置應裝配有被批準用于經(jīng)皮無線電頻率(RF)通信的醫(yī)學植入式通信服務(MICS)無線電設備。本發(fā)明的另一個實施方案是用泵控制所述VEGF分子在所述芯片的矩陣陣列位置上的雜交。在本發(fā)明至少一個實施方案的排列上存在至少一個用于控制液體流速的裝置及相關控制裝置。為此具體目的，在至少一個實施方案中，所述傳感器芯片被連接到包括精密泵的微流體系統(tǒng)。所述液體流控制的一個具體能力是允許在檢測完成后將所述去雜交的VEGF分子從所述電極沖掉，這使得所述傳感器可重復使用。


附圖——其中同樣的參考數(shù)字在所有各個視圖中是指相同或功能相似的元件并且其被納入說明書中并形成說明書的一部分——進一步舉例說明本發(fā)明，并且與具體實施方式
一起用于解釋本發(fā)明的原理。圖1是所述裝置的正投影截面圖，含所述電子檢測模塊的示意圖。圖1A是本發(fā)明一個實施方案的電學示意圖，描繪來自所述電容器陣列的等效電極-電解質(zhì)節(jié)點的一個單元。圖2是VEGF檢測器的電容排列的橫截面等軸視圖。圖2A是電容VEGF傳感器的正投影俯視圖。圖3描繪了帶有組成型雜交元件的VEGF傳感器。圖3A描繪了被VEGF單克隆半抗體(a-VEGF mhAb)功能化之前的馬來酰亞胺封端的 SAM。圖3B示出了將VEGF單克隆抗體(a_VEGF mAb)分裂成兩個半抗體的選擇性還原過程。圖3C示出了包括馬來酰亞胺-巰基共軛以產(chǎn)生a-VEGF mhAb功能化的SiO2底物的自發(fā)反應。圖4是所述生物傳感器電容器陣列的橫截面圖，其矩陣陣列設計包括包圍腔(chamber containment)。圖4A為所述電容器矩陣陣列的示意圖，其描繪了所述等效電路。圖5示出了配置在送遞裝置框圖內(nèi)的VEGF檢測器的設計。圖5A是優(yōu)選實施方案的示意性框圖——生物傳感器被納入作為檢測、分析和報告系統(tǒng)的一部分。圖5B是使用所述生物傳感器的優(yōu)選實施方案時形成的穩(wěn)態(tài)環(huán)的示意性框圖。定義本文使用的所有技術術語、科學術語或其他術語具有的含義與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同。提供下述定義意在闡明或解釋所定義術語的普通含義，而不應解釋為限制或縮小這些術語含義的范圍。雖然與本文描述的方法和材料類似或等價的任何方法和材料均可用于實施或測試本發(fā)明，但將還是描述所述方法、裝置和材料。本文提及的所有出版物通過引用的方式納入本文，目的是為了描述并公開所述出版物中報告的可能用于本發(fā)明的材料和方法。本文中任何內(nèi)容都不能被解釋為承認本發(fā)明由于在先發(fā)明而沒有資格早于這些公開物。本文使用的“人源化VEGF單克隆半抗體”是指通過三(2-羧乙基)膦(TCEP)將連接兩條重鏈的二硫鍵切割后所產(chǎn)生的兩個單克隆抗體片段。所產(chǎn)生的半抗體(hAb)具有完整的結合位點和反應性巰基。這些hAb保留了它們的靶向能力，但其尺寸較小，可以以位點特異的方式共軛以及與所述馬來酰亞胺封端的Si02表面反應。本文使用的“ VEGF-A和VEGF單克隆抗體雜交”是指VEGFl與VEGF單克隆抗體11雜交的過程，是通過VEGF-A和VEGF單克隆半抗體之間的分子識別來實現(xiàn)的。所述人源化VEGF單克隆抗體(rhuMab VEGF;貝伐單抗；Avastin神)與VEGF結合的親和力與原始抗體與VEGF結合的親和力(Kd約O. 5nM)非常相似。與其小鼠對應物相同，貝伐單抗結合并中和所有的人VEGF-A同種型和生物活性的蛋白水解片段。貝伐單抗的結合表位已通過Fab-配體復合體的晶體結構分析被確定。該分析預測人VEGF中的Gly88對于結合貝伐單抗是必需的，并且該殘基還構成貝伐單抗結合的種特異性的基礎，因為在小鼠和大鼠中VEGF的相應位點發(fā)現(xiàn)的是絲氨酸殘基。貝伐單抗不中和VEGF基因家族的其他成員例如VEGF-B或VEGF-C。貝伐單抗在幾個物種中的藥物代謝動力學性質(zhì)此前已有記載，并且其與典型的人源化單克隆抗體一致。貝伐單抗在人體內(nèi)的終末半衰期是17-21天。重要地，迄今為止進行的任何臨床試驗中都沒有發(fā)現(xiàn)對貝伐單抗的抗體反應證據(jù)，這驗證了其人源化的成功。本文使用的“VEGF單克隆半抗體固定”是指所述半抗體結合到所述表面的過程，其中馬來酰亞胺-巰基偶聯(lián)快速并自發(fā)地發(fā)生。所述馬來酰亞胺封端的Si02底物會與抗VEGF hAb溶液以需要的濃度孵育2小時。所述hAb會以方向特異的方式自發(fā)地偶聯(lián)到所述底物表面。如圖3所示，抗原結合位點將保持向外。所述VEGF hAb的濃度將被用于控制所述底物上的Mb涂敷密度。孵育后，用PBS緩沖液沖洗所述底物以除去所有未共軛的化合物。本文使用的“表征VEGF半抗體固定”是指通過使用熒光測量來確認并定量所述偶聯(lián)反應的過程。在TCEP還原之前，用Alex-488熒光團共價標記CEA mAb。為確認所保留的熒光是由于馬來酰亞胺-巰基共軛而不是VEGF hAb或未切割的mAb的非特異性吸收，使用完整的mAb作為陰性對照以確保用PBS緩沖液沖洗之后mAB不會吸收并粘附到所述底物。然后，VEGF蛋白將被用 于進一步評估所述固定的VEGF hAb的結合敏感度和特異性。本文使用的“表面修飾”是指制備Si02表面14的過程，其為，首先用piranha溶液(H2S04:H202=3:1 (v/v))處理20min，然后用蒸餾水沖洗以完全清潔所述表面。然后，將所述底物浸入50%乙醇溶液(Et0H:H20=50:50(V/V) )2小時以完全水合所述表面。然后，再用piranha溶液處理所述水合表面20min,并用蒸懼水洗漆。所述整個過程將導致Si02表面的完全羥基化以形成氫氧化硅(SiOH)表面。用氮氣干燥所得的SiOH底物并將其保存在-20°C用于后續(xù)使用。然后，在SiOH底物上合成馬來酰亞胺封端的SAM。簡單地通過浸潰過程，用1M3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液處理所述SiOH底物lhr。這將形成胺(-NH2)封端的自組裝單層(SAM)。該-NH2封端的SAM能夠容易地與活化的羧酸反應，用于進一步修飾所述表面。在優(yōu)選的實施方案中，將所述-NH2封端的SAM與IM琥珀酰亞胺基_4_(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)的二甲基亞砜(DMSO)溶液孵育2hr，然后用蒸餾水洗去未反應的化合物。該過程將導致形成具有馬來酰亞胺封端的功能性表面基團的SAM。然后，這些馬來酰亞胺封端的SAM可自發(fā)地與具有一個或多個游離的巰基官能團的任何類型的生物分子(例如蛋白質(zhì)、肽、半抗體和其他抗體片段)反應，并因此將所述生物分子固定到所述底物表面上。為制備清潔且高質(zhì)量的SAM，需要用蒸餾水洗滌所形成的SAM并將其在連續(xù)的氮氣流下干燥，然后儲存在_20°C用于后續(xù)使用。將所述表面在室溫下以MeOH/HCl(1/1)清潔30分鐘，以超純水(Mill1-Q Gradient A1018. 2ΜΩ )沖洗，并以氬氣干燥。在下一步驟中，在氣相或液相中通過使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)的硅烷化步驟將所述表面用NH2基團修飾。為了進行氣相硅烷化，將所述芯片置于含有幾滴甲硅烷的干燥器中。將所述干燥器密封并加熱至超過100°C，使所述芯片在低壓(約lmbar)下與甲硅烷蒸氣反應1-2小時。本文使用的“表面表征”是指例如原子力顯微鏡(AFM)、掃描電鏡(SEM)和X-射線光電子能譜(XPS)的方法。可通過使用傅里葉變換紅外(FT-1R)光譜法監(jiān)測形成SAM的每一步的證據(jù)，該方法將提供所述SAM中官能團的特征信號。本文使用的“靶分析物”是指測試樣品中有待于使用本發(fā)明檢測的物質(zhì)。所述分析物可以是存在其天然捕獲劑(例如抗體、多肽、DNA、RNA、細胞、病毒等)或可制備其捕獲劑的任何物質(zhì)，并且在測定中所述靶分析物可結合一個或多個捕獲劑?！鞍蟹治鑫铩边€包括任何抗原性物質(zhì)、抗體及其結合物。所述靶分析物可包括蛋白、肽、氨基酸、碳水化合物、激素、甾體、維生素、藥物(包括出于治療目的給予的藥物以及出于非法目的給予的藥物)、細菌、病毒和任意上述物質(zhì)的代謝物或抗體。本文使用的“靶分析物類似物”是指可與分析物捕獲劑交叉反應的物質(zhì)，盡管其反應程度可能較所述靶分析物本身更強或更弱。所述靶分析物類似物可包括修飾的靶分析物以及所述靶分析物分子的片段部分或合成部分，只要所述靶分析物類似物具有至少一個與所述興趣靶分析物相同的表位位點。本文使用的“捕獲劑”是能夠結合靶分析物或靶試劑的分子或化合物，其可直接或間接附著于基本上為固體的材料。所述捕獲劑可以是存在其天然靶分析物(例如抗體、多肽、DNA、RNA、細胞、病毒等)或可制備其靶分析物的任何物質(zhì)，并且在測定中所述捕獲劑可結合一個或多個祀分析物。本文使用的“測試樣品”是指含有有待于使用本發(fā)明檢測和測定的靶分析物的樣品。除所述靶分析物以外，所述檢測樣品還可含有其他組分，可具有液體或固體的物理屬性，并可為任意大小或體積，所述測試樣品包括例如移動的液體流。所述測試樣品可含有除所述靶分析物以外的任何物質(zhì)，只要所述其他物質(zhì)不干擾所述靶分析物與所述捕獲劑的結合或第一結合成員與第二結合成員的特異性結合。測試樣品的實例包括但不限于血清、血漿、痰、精液、尿、其他體液，以及環(huán)境樣本例如地下水或廢水、土壤浸出物、空氣和殺蟲劑殘留物。本文使用的“方法和試劑”(出于分析和測試本發(fā)明裝置的目的，發(fā)明人采用并使用了 HS Lee et al.，2008文章中提供的/[目息，目的是鑒定所述方法)是指試劑,例如3_氨基丙基二乙氧基硅烷(APDES)、琥珀酐(SA)、碳酸鈉(SC)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)片劑、十二烷基硫酸鈉(SDS)U-乙基-3-[3-( 二甲氨基)丙基]碳二亞胺(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(硫代 _NHS)、氫氧化鈉(NaOH)、氯化鈉(NaCl) (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO)。人VEGF165 (Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA)作為檢測蛋白。據(jù)報道，編碼人VEGF165的cDNA被亞克隆至表達載體中并在酵母中表達。據(jù)報道，重組人VEGF165同型二聚體被進一步純化并保存在含有O. 1%BSA的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，pH7. 4)中。本文使用的“合成VEGF單克隆抗體”是指通過化學過程將人源化的VEGF抗體切成兩半。摩爾量超過所述VEGF單克隆抗體(mAb)摩爾濃度3倍的三(2-羧乙基)膦(TCEP)將被用作還原劑。在室溫下，將所述TCEP還原劑與所述VEGF mAb在PBS緩沖液中混合2hr。所述TCEP將選擇性地切割連接mAB的兩條重鏈的二硫鍵，并產(chǎn)生兩個VEGF半抗體(hAb)。所得的hAb具有完整的結合位點和反應性巰基。這些hAb保留了它們的靶向能力，但其大小較小且能夠以位點特異的方式共軛。在本研究中，所得的hAb可直接(未經(jīng)預先純化)用于與所述馬來酰亞胺封端的Si02表面反應。本文使用的“表征VEGF單克隆半抗體”是指確定所合成的半抗體?？墒褂檬榛蛩徕c聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)優(yōu)化所述選擇性還原過程。為確認hAb的產(chǎn)生并優(yōu)化所述選擇性還原過程，將VEGF mAb與不同摩爾量的過量TCEP混合2hr，然后分離并可視化。具體地，使用NovexSureLockXcell電泳系統(tǒng)(Invitrogen)在Tris-乙酸電泳緩沖液中在SDS-PAGE3-8%Tris-乙酸10孔迷你凝膠上分離所述切割的mAb。所述樣品將在150V電泳Ihr,將所產(chǎn)生的聚丙烯酰胺凝膠在SimplyBlueTM (Invitrogen)中過夜染色以可視化。為定量所述hAb的濃度，可將Alexa Fluor488熒光探針預共軛到所述mAb，然后進行還原。然后，可測量來自hAb的熒光強度，并與標準曲線化比較。本文使用的“合成的VEGF半抗體的結合親和力”是指使用表面等離子共振(SPR)分析(Kang et al.，2008)來分析兩個生物分子之間的相互作用。本文使用的“穩(wěn)態(tài)控制機制”是指這樣的概念，即所述生物傳感器測量變量的至少三個相互依賴的組件是被調(diào)節(jié)的受體是傳感組件，雜交的VEGF分子改變所述電容負荷，因此監(jiān)測環(huán)境改變并對其作出反應。所述受體感受刺激，其發(fā)送信息到控制電路——設定變量維持范圍的組件。所述控制電路決定對所述刺激的合適反應。然后，所述控制電路發(fā)送信號至接收來自所述控制電路的信號的效應器。在接收到所述信號后，發(fā)生變化，以通過用正反饋增強所述信號或者用負反饋削弱所需信號來校正偏差。本文使用的“血管發(fā)生”是指包括從已存在的血管生長新血管的生理過程。盡管有一些對術語的爭論，但是血管發(fā)生是用于自發(fā)血管形成的術語，內(nèi)填作用(intussusception)是用于通過分裂已存在的血管而形成新血管的術語。本文使用的“信號轉導”是指將對細胞的機械/化學刺激轉變?yōu)樘禺愋约毎磻臋C制。信號轉導始于到達接收器的信號，終于細胞功能改變。本文使用的“酪氨酸激酶”是指可將ATP中的磷酸基團轉移到蛋白的酪氨酸殘基的酶。酪氨酸激酶是更大類的蛋白激酶的亞組。通過激酶來磷酸化蛋白質(zhì)是信號轉導中的重要機制，用于調(diào)節(jié)酶活性。本文使用的“微電子機械系統(tǒng)(MEMS)”是指非常小的技術，其在納米尺度合并到納米電子機械系統(tǒng)(NEMS)和納米技術。MEMS由介于I微米到100微米(即0. 00lmm到0.1mm)大小的組件組成，并且MEMS裝置的大小通常介于20微米(百萬分之二十米)到I毫米。它們通常由處理數(shù)據(jù)的中樞單元、微處理器和數(shù)個與外部相互作用的組件(例如微傳感器)組成。本文使用的“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物，通常具有20個或更少的堿基。雖然它們可由更長的片段通過鍵斷裂而形成，但是現(xiàn)在更常見的是通過聚合單個的核苷酸前體來合成。自動化合成儀可合成具有多達160到200個堿基的寡核苷酸。本文使用的“凝集素”是指對自身糖基具有高度特異性的糖結合蛋白。它們在涉及細胞和蛋白質(zhì)的生物識別現(xiàn)象中發(fā)揮作用。例如，一些病毒在感染期間使用凝集素將其自身附著到宿主生物的細胞。本文使用的“適體”是指結合到具體靶分子的寡核酸分子或肽分子。適體通常通過從大的隨機序列庫中選擇它們而產(chǎn)生，但是天然適體也存在于核糖開關中。適體可用于基礎研究和作為大分子藥物用于臨床目的。適體可在其靶分子的存在下與核酶結合以自切害I]。這些化合物分子具有其他的研究、工業(yè)和臨床用途。本文使用的“肽”是指由α-氨基酸以確定的順序連接而形成的短的聚合物。一個氨基酸殘基和下一個氨基酸殘基之間的連接稱為酰胺鍵或肽鍵。
本文使用的“共振”是指系統(tǒng)在某些頻率下比在其他頻率下以更大的振幅振動的趨勢。這些頻率被稱為該系統(tǒng)的共振頻率。在這些頻率下，甚至小的周期性驅動力可產(chǎn)生大振幅的振動。本文使用的“石英晶體微天平(QCM)”是指通過測量石英晶體共振器頻率的改變來測量每單位面積的質(zhì)量的裝置。由于在共鳴器表面的氧化物增加/下降或膜沉積，加入或移除小的質(zhì)量可干擾所述共振。本文使用的“酶”是指催化化學反應(即增加化學反應速率)的蛋白質(zhì)。在酶促反應中，所述過程起始時的分子稱為底物，所述酶將它們轉變成不同的分子，稱為產(chǎn)物。生物細胞中幾乎所有過程都需要酶以在顯著的速率進行。由于酶對其底物具有選擇性且在許多可能的反應中只加速某些反應，細胞中制備的酶集合決定在該細胞中發(fā)生哪些代謝途徑。本文使用的“表位”是指抗原中被免疫系統(tǒng)(具體是抗體、B細胞或T細胞)識別的部分。抗體中識別所述表位的部分稱為互補位。雖然通常認為表位源自非自身蛋白，但是可被識別的源自宿主的序列也被分類為表位。本文使用的“自組裝單層(SAM)”是指兩親性分子的有組織的層，其中所述兩親性分子的一個末端——“頭部基團”——顯示出對底物的特異性親和力。SAM的終端還包含具有官能團的尾部。SAM是通過親水的“頭部基團”化學吸附到來自蒸汽或液相的底物，然后通過疏水“尾部基團”的緩慢二維組織而形成的。最初，被吸附的分子形成無序的分子團或者形成“下沉相(lying down phase)”,經(jīng)數(shù)小時的時間，開始在所述底物表面形成晶質(zhì)結構或半晶質(zhì)結構。所述親水性“頭部基團”在所述底物上組裝在一起，而疏水性的尾部基團組裝成遠離所述底物。密集的分子區(qū)域成核并生長直到所述底物的表面被單個的單層覆
至JHL ο本文使用的“生物學反應調(diào)節(jié)劑(BRM)”是指人體天然產(chǎn)生的物質(zhì)，以及科學家可在實驗室中制造的物質(zhì)。這些物質(zhì)激發(fā)身體對感染的反應。這些物質(zhì)的一些被用于治療關節(jié)炎、癌癥和一些其他疾病。免疫治療使用BRM來增強免疫系統(tǒng)活性以增加身體對癌癥的天然防御機制，而用于類風濕性關節(jié)炎的BRM目的是減少炎癥。本文使用的“醫(yī)學植入物通信服務(MICS)”是指使用介于402MHz和405MHz之間的頻帶與醫(yī)學植入物通信的技術規(guī)范的名稱。其允許與起搏器或其他電子植入物的雙向無線電通信。其最大發(fā)射功率非常低，EIRP=25微瓦，目的是減少與其他使用相同頻帶的用戶相互干擾的風險。在任何一個時刻所使用的最大帶寬是300kHz，這使其成為一個低比特率的系統(tǒng)(與WiFi或藍牙相比)。與之前使用的需要外部收發(fā)器以接觸患者皮膚的誘發(fā)技術相比，其主要優(yōu)勢為更具靈活性。MICS的有效范圍為數(shù)米。本文使用的“電容器”是指由被電介質(zhì)(絕緣體)分開的導體對組成的無源電子組件。當所述導體之間存在電勢差(電壓)時，在所述電介質(zhì)中呈現(xiàn)電場。所述電場儲存能量，并在所述導體之間產(chǎn)生機械力。當在大面積的導體之間有窄的間隔時，所述效應最大，因此電容器的導體通常被稱為板。
具體實施例方式圖1是所述裝置的正投影截面視圖，含所述電子檢測模塊的示意圖。生物傳感器有其絕緣罩100。絕緣罩100，配置有流體入口 101和流體出口 102。裝置100包括形成電容性板103的涂有VEGF傳感元件的電極陣列并形成VEGF電容檢測器電路，電容性板103與電子模塊200交界。所述VEGF電容檢測器電路被連接到運算放大器(OpAmp)緩沖器201，并且連接到電流電壓放大器202，然后連接到OpAmp集成電路203，包括偏置電阻器204、205和電容器206。輸入電壓Vin207、電流輸出1209和V1209代表雜交后各自的電勢和電路200中所得的電容變化的積分值。所述電極被設計成互相交叉模式，以在小體積中最大化所述傳感器的表面積。圖1A是圖1的一個實施方案的示意圖，描繪形成電容器陣列110的等效電極-電解質(zhì)節(jié)點的一個單元。電路圖110可表示為通過電阻105和其電容負載Cal06描繪電極a/溶液界面的電阻(Ra)。所述傳感器本體100中的溶液的電阻由(Rs) 107表示，而電極B/溶液界面的電阻表示為(Rb) 108，其電容負載為(Cb) 109。形成生物傳感器110的所述陣列電容器的一節(jié)點單元與電容檢測器電路200交界。方波發(fā)生器產(chǎn)生的輸入(Vin)信號207被0pAmp201緩沖，并產(chǎn)生電流208，電流208代表VEGF與a-VEGF mhAb結合雜交后所述電路中各自的衰減值札204。在等效電路節(jié)點110所示的由于VEGF分子與a-VEGF mhAb結合產(chǎn)生電容改變之后，電流208耦合到所述OpAmp (充當電流電壓放大器202)，以指示電容單元110各自的積分值。所述信號被0pAmp203和與之相連的電阻器205、電容器206進一步整合，產(chǎn)生輸出電壓(Vtjut) 210。圖2是VEGF檢測器的電容排列的橫截面等軸視圖。該圖描繪了圖1和圖1A標示的元件，其進一步解釋并闡明了等效電子模塊110和支配VEGF檢測器性能的傳感原理之間的關系。所述VEGF生物傳感器基于電化學方法，據(jù)此使用具有幾何形狀Gx的電容器，目的是用以下述方程I中的電介質(zhì)(ε r)作為變量，并且還利用無標記檢測技術(基于生物修飾的電極/溶液界面的電容測量值)。傳感器100的功能可由所述傳感器將成股的a-VEGFmhAbll有效固定在傳導電極表面16的能力來最好地定義。所述電解質(zhì)溶液(電極之間的介質(zhì))是體液，例如腦脊液3。電極16用p-Si底物15涂敷，以增強VEGFl和a-VEGF mhAbll之間的親和力。絕緣層(例如二氧化硅)14保護帶有正電荷的底物15，帶正電的底物15經(jīng)雜交物質(zhì)(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)13與連接體(琥珀酰亞胺基-4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯)12鍵合。然后，所述a-VEGF mhAb通過與所述連接體鍵合而被固定。由于固定a-VEGF mhAb造成的總表面厚度增加是約10nm。當將VEGF蛋白I引入至體液3中時，它們結合到涂敷有a-VEGF mhAb的電極表面。所述VEGF分子和a-VEGF mhAb的結合可改變所述電極-溶液界面的阻抗(即主要是其電容)。當所述VEGF分子在其抗-VEGF片段(抗原結合(Fab)域界面10)與a-VEGF mhAb雜交時，總厚度是約200nm。所述電化學單元110的電容106和109可以如方程I中所示模擬。CceIi 一 Cgeometry + Ceiectrode/soIution W其中，Cceometry是由所述傳感器的幾何形狀產(chǎn)生的電容，如方程2所示。 Cgeometry = εΓ ε0 A/d 2)其中，ε r是由VEGF分子、體液、a-VEGF mhAb、琥拍酸酐連接體(Succiniclinker)、氨基雜交物質(zhì)、SiO2絕緣體和ρ-Si底物組成的介質(zhì)的組合相對電容率(雜交之前所述組合介質(zhì)的介電值的介電常數(shù)，〃 ε r="[( ε山，(ε r)2, ... ( ε r)n]，并考慮總電容值“ Ccell ”) ； ε。是自由空間的電容率(8. 854X10_12F/m) ;A是由寬52和長53的電極板103所得出的總面積；d是板103之間的間距51。選擇A和d的值，使得所述電容變化可以用如下技術有效地測量，但通過傳感器單元100的體液環(huán)流不受限制。由于VEGF結合時所述表面的厚度是約200nm的事實，所述間距可以小至5000nm，而沒有VEGF雜交所導致的限制所述流的風險。電極板103以互相交叉的手指模式排列，以在小體積中最大化有效的表面積。體液3經(jīng)入口 101流入所述傳感器單元，并流過出口 102，可能連接到圖5將進一步描述的栗和閥部件。Celectrode7solution是兩個電極的每一個和所述溶液之間形成的雙層電容。所述雙層電容可以如下述方程3所示模擬。下面方程9和10中電極A和電極B的CeleetMde/s()luti()n分別由Ca和Cb表示。
權利要求
1.一種VEGF單克隆半抗體(a-VEGF mhAb)探針復合體，其在檢測器中用于檢測靶VEGF分子的存在，所述探針復合體包括 所述檢測器中的電極；和 所述電極上的a-VEGF mhAb，其能夠結合到指示物VEGF蛋白并且能夠固定所述指示物VEGF蛋白，使得可通過所述檢測器檢測靶VEGF分子。
2.要求I的a-VEGFmhAb探針復合體，其中所述a-VEGF mhAb能夠高度特異性地結合到VEGF蛋白，并且還包括偶聯(lián)到所述電極的電路，以通過向所述電極施加電流來選擇性地釋放與所述VEGF蛋白的結合，從而使得所述探針復合體可重復使用。
3.權利要求1的a-VEGFmhAb探針復合體，其中所述a-VEGF mhAb可高度特異性地結合到VEGF蛋白，并且還包括流體性線路，以通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述結合。
4.權利要求2的a-VEGFmhAb探針復合體，其中所述a-VEGF mhAb可高度特異性地結合到VEGF蛋白，并且還包括流體性線路，以通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述結合。
5.權利要求4的a-VEGFmhAb探針復合體，其與流體源組合，其中所述流體性線路通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述結合，所述流體性線路包括壓電泵，所述壓電泵具有流體性地偶聯(lián)到所述流體源的輸入和流體性地偶聯(lián)到所述電極的輸出，所述壓電泵和電極被排列和配置以使得可通過所述壓電泵提供的流體流來流體性沖洗所述電極。
6.權利要求1的a-VEGFmhAb探針復合體，其中所述a-VEGF mhAb由化學分裂的Ava stini)組成。
7.權利要求1的a-VEGFmhAb探針復合體，其中所述a-VEGF mhAb由化學分裂的人源化單克隆抗體VEGF (rhuMab VEGF;貝伐單抗)組成。
8.權利要求1的a-VEGFmhAb探針復合體，其中所述檢測器包括硅底物，并且還包括由附著到馬來酰亞胺封端的自組裝單層(m-SAM)的a-VEGF mhAB組成的連接體,所述m_SAM通過以氨基硅烷化而鍵合到所述硅底物。
9.一種靶的傳感器陣列，其包括 底物； 多個絕緣的微機械電容器，其至少一部分上放置所述底物，所述電容器以互相交叉模式排列； 附著到所述多個電容器的識別基團，所述識別基團特異性地結合到所述靶； 檢測器電路，用于傳感所述多個電容器；和 用于再配置所述識別基團以使得所述傳感器陣列可重復使用的裝置。
10.權利要求9的傳感器陣列，其中所述多個電容器中的至少一個具有多個基面，所述多個基面的每一個具有附著到所述基面的識別基團，并且還包括偶聯(lián)到所述多個基面的電路，以通過向所述多個電容器施加電流以選擇性地釋放與所述靶的結合并從而使得所述傳感器陣列可重復使用。
11.權利要求9的傳感器陣列，還包括流體性線路以通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述識別基團的結合。
12.權利要求11的傳感器陣列，還包括流體性線路以通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述識別基團的結合。
13.權利要求12的傳感器陣列，其與流體源組合，并且其中所述流體性線路通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述識別基團的結合，所述流體性線路包括壓電泵，所述壓電泵具有流體性地偶聯(lián)到所述流體源的輸入和流體性地偶聯(lián)到所述多個電容器的輸出，所述壓電泵和所述多個電容器被排列和配置以使得可通過所述壓電泵提供的流體流來流體性沖洗所述電極。
14.權利要求9的傳感器陣列，其中所述識別基團由化學分裂的組成。
15.權利要求9的傳感器陣列，其中所述識別基團由化學分裂的人源化單克隆抗體VEGF (rhuMab VEGF;貝伐單抗)組成。
16.權利要求9的傳感器陣列，其中所述識別基團包括a-VEGFmhAb，所述a-VEGF mhAb能夠結合到指示物VEGF蛋白并且能夠將所述指示物VEGF蛋白固定到所述電容器以使得可通過所述檢測器檢測靶VEGF分子。
17.權利要求9的傳感器陣列，還包括偶聯(lián)到所述傳感器陣列的微控制器，其中所述多個電容器的至少一個具有結合到所述靶的識別基團，并且所述檢測器檢測至少一個電容器上所述靶的存在并將對所述靶的檢測與所述微控制器通信。
18.權利要求16的傳感器陣列，還包括置于至少一個電容器的至少一部分上的連接體，以將a-VEGF mhAb固定在所述至少一個電容器上。
19.權利要求18的傳感器陣列，其中所述連接體包括琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯和雜交物質(zhì)(3-氨基丙基-三甲氧基硅烷)。
20.一個用于檢測流體中a-VEGF mhAb的靶的系統(tǒng)，其包括 傳感器，所述傳感器包括 底物； 密封的微機械網(wǎng)孔電容器陣列，在所述陣列的至少一部分上放置所述底物； 附著到所述底物的識別基團，所述識別基團選擇性地結合到所述a-VEGF mhAb的靶；和 檢測器，用于通過所述識別基團檢測所述a-VEGF mhAb的靶的結合； 送遞系統(tǒng)，用于將用于分析的流體送遞到所述傳感器；和 用于再配置所述識別基團的裝置，以使得選擇性釋放所述靶以使得所述傳感器陣列可重復使用。
21.權利要求20的系統(tǒng)，其中所述送遞系統(tǒng)包括輸入端口、連接到所述輸入端口用于所述流體的容器、以及連接到所述容器的輸出端口，所述底物的至少一部分暴露于所述容器中的流體。
22.權利要求20的系統(tǒng)，其中所述電容器陣列具有預先確定的電容，所述電容被選擇以使靶結合所述電容器陣列最大量的功能化表面面積，并且其中所述送遞系統(tǒng)的尺寸和結構被排列和配置為所述預先確定的電容的函數(shù)以提供穿過所述傳感器的無限制流體流動。
23.權利要求20的系統(tǒng)，其中所述用于再配置所述識別基團以選擇性釋放所述靶以使得所述傳感器陣列可重復使用的裝置，包括偶聯(lián)到所述多個基面的電路，以通過施加到所述電容器陣列的電流來選擇性地釋放與所述靶的結合并從而使得所述傳感器陣列可重復使用，或者包括流體性線路，以通過使用所述流體性線路提供的流體流來選擇性地釋放所述結合。
24.—種體內(nèi)實時檢測患者流體中VEGF的方法，包括 化學分裂人源化單克隆抗體VEGF (rhuMab VEGF;貝伐單抗)； 將所述分裂的人源化單克隆抗體VEGF附著到傳感器中的電容器表面； 使所述傳感器暴露于待分析的包含VEGF的流體，所述分析使用分裂的人源化單克隆抗體VEGF ； 通過使所述VEGF結合到所述分裂的人源化單克隆抗體VEGF，將所述VEGF結合到所述傳感器內(nèi)的測量表面，以形成作為分析物分子的配體雜交的靶VEGF ;和 檢測所述分析物分子以測量所述雜交的靶VEGF ;和 從所述傳感器產(chǎn)生可指示所測量的雜交靶VEGF的輸出。
25.權利要求24的方法，其中化學分裂人源化單克隆抗體VEGF(rhuMabVEGF;貝伐單抗)包括化學分裂Avastin· 、
26.權利要求24的方法，其中檢測所述分析物分子包括，通過傳感器阻抗大小的變化或者傳感器阻抗改變的時間速率檢測所述傳感器的電容值變化。
27.權利要求24的方法，其中化學分裂人源化單克隆抗體VEGF(rhuMabVEGF;貝伐單抗)包括通過使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)作為還原劑以選擇性地切割連接mAB的兩條重鏈的二硫鍵以產(chǎn)生兩個VEGF半抗體(mhAb)而將VEGF單克隆抗體(a-VEGF mAb)分裂為兩個半抗體。
28.權利要求24的方法，還包括依據(jù)患者體液中VEGF的實時體內(nèi)檢測來提供至少一種醫(yī)療劑的有指導的治療介入。
29.—種對表面進行表面修飾方法,包括 使所述表面水合以形成氫氧化物表面； 使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液在所述表面上合成馬來酰亞胺封端的SAM以形成-NH2封端的SAM ;和 將所述-NH2封端的SAM與琥珀酰亞胺基-4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)溶液孵育，并洗去未反應的化合物以形成具有馬來酰亞胺封端的功能性表面基團的SAM。
30.權利要求29的方法，其中使所述表面水合以形成氫氧化物表面包括使所述表面水合以形成氫氧化娃(SiOH)表面。
31.權利要求30的方法，其中使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷溶液在所述表面上合成馬來酰亞胺封端的SAM以形成-NH2封端的SAM包括，使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液在所述SiOH表面上合成馬來酰亞胺封端的SAM以形成-NH2封端的SAM，所述-NH2封端的SAM能夠容易地與活化的羧酸反應，用于進一步修飾所述表面。
32.權利要求30的方法，其中將-NH2封端的SAM與琥珀酰亞胺基_4_(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)溶液孵育，并洗去未反應的化合物以形成具有馬來酰亞胺封端的功能性表面基團的SAM包括，將-NH2封端的SAM與琥珀酰亞胺基_4_(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)的二甲基亞砜(DMSO)溶液孵育，并用蒸餾水洗去未反應的化合物以形成具有馬來酰亞胺封端的功能性表面基團的SAM，其中馬來酰亞胺封端的SAM能夠與具有一個或多個游離巰基官能團的生物分子——例如蛋白質(zhì)、肽、半抗體和其他抗體片段一自發(fā)地反應，并因而將所述生物分子固定到所述表面上。
33.權利要求29的方法，還包括用蒸餾水洗滌所述水合的SAM，在持續(xù)的氮氣流中干燥所述洗滌的SAM，并在約_20°C儲存所述干燥的SAM。
34.權利要求33的方法，還包括用MeOH/HCl(1/1)在室溫清潔所述儲存的SAM，用超純水沖洗所述清潔的SAM，以氬干燥所沖洗的SAM，通過以3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)在氣相或液相中硅烷化來以NH2基團修飾所述SAM。
35.權利要求29的方法，其中使所述表面水合以形成氫氧化硅(SiOH)表面，包括 用piranha溶液(!12504:!1202=3:1 0八))處理所述表面； 用蒸餾水沖洗所述處理的表面以清潔所述表面； 將所述表面浸入50%乙醇溶液(Et0H:H20=50:50(V/V))以使所述表面水合； 再次用piranha溶液處理所述表面一段時間；和 用蒸餾水洗滌所述處理的表面。
36.權利要求29的方法，其中在所述SiOH表面上合成馬來酰亞胺封端的SAM包括，通過浸潰過程以3-氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液處理所述SiOH表面。
37.一種方法，包括將半抗體固定到底物表面上，在所述底物表面上捕獲抗原，和電化學地檢測所述捕獲的抗原。
38.一種方法，包括在底物上制造固定的半抗體的自組裝單層，和電化學地檢測置于所述底物上的流體中的抗原，所述底物具有固定的半抗體的自組裝單層。
全文摘要
用于檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)雜交的生物傳感器使用并聯(lián)電容器的陣列來檢測循環(huán)的VEGF與固定的VEGF單克隆半抗體(a-VEGF mhAb)的電化學結合。結合a-VEGF mhAb可調(diào)節(jié)電路的閾值電壓，從而改變所述電路的阻抗。涂敷有p-Si底物的電極可增強所述VEGF分子之間的親和力。流體單元送遞VEGF樣品到所述芯片的活性表面上。以互相交叉模式排列的并聯(lián)電容器的陣列可檢測所述流體中的VEGF。所述檢測器提供精確測量的和可計量速率的體內(nèi)VEGF分子的變化，提供用于測量所述腫瘤對送遞的化學治療劑和生物反應調(diào)節(jié)劑(BRM)的反應的實時反饋，目的是確定腫瘤負荷和化學治療的效力，作為治療的穩(wěn)態(tài)環(huán)的一部分。
文檔編號G01N27/327GK103069270SQ201180040585
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月22日 優(yōu)先權日2010年6月22日
發(fā)明者葉赫沙·沙查爾, 托馬斯·陳, 溫斯頓·吳, 布雷特·喬丹, 海爾文·陳, 帕拉丁·盧波夫, 凱爾·齊默曼 申請人:藥物代謝動力公司, 葉赫沙·沙查爾, 托馬斯·陳, 溫斯頓·吳, 布雷特·喬丹, 海爾文·陳, 帕拉丁·盧波夫, 凱爾·齊默曼