專利名稱：針對表觀遺傳學上沉默的腫瘤抑制基因的基因組篩選的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明可以一般性地被認為是涉及檢測癌細胞中表觀遺傳學上(epigenetically)沉默的腫瘤抑制基因的方法，更具體地說，是針對如食道癌或者頭頸部癌癥的診斷方法和治療方法。
背景技術(shù)：
雖然癌癥一般被認為是由于遺傳變化如一個基因的突變而導致的，但現(xiàn)在已經(jīng)比較明確地認為不改變DNA序列的表觀遺傳學機制也可以導致癌癥。最常見的表觀遺傳學上的變化就是由于基因序列甲基化而導致該基因的表達沉默，特別是在5′端上游的基因調(diào)控序列。在CpG二核苷酸中，特別是在CpG富含區(qū)(CpG島)中，與鳥嘌呤相鄰的胞嘧啶的甲基化常常參與高等真核生物的正?；虮磉_調(diào)控。舉個例子，CpG島的過度甲基化與某些印記基因的轉(zhuǎn)錄失活相關(guān)，這些基因就像女性X染色體上基因的一樣失活。正常情況下不甲基化的CpG島的異常甲基化也在一些株化(immortalized)細胞和癌化細胞中發(fā)現(xiàn)，而且這種甲基化還與人類癌癥的某些特定的腫瘤抑制基因的轉(zhuǎn)錄失活有關(guān)。
與癌癥相關(guān)的基因變化，包括使基因表達喪失或者表達出缺陷型基因產(chǎn)物的基因變化，以及表觀遺傳學機理，比如甲基化導致基因轉(zhuǎn)錄的沉默，為確定一個細胞是否易于失去生長控制，也就是說是否容易形成癌細胞提供了標記。比如，BRCA1基因的一個突變與乳腺癌相關(guān)。這樣就可以對一個有家族乳腺癌歷史的女性身上的細胞作診斷性測試，看看這位女性是否也有作為乳腺癌標記分子的BRCA1基因突變。前列腺特異性抗原(PSA)是標記分子的另外一個例子，它是前列腺癌的標記分子。雖然對于導致PSA表達的缺陷以及PSA在體內(nèi)的正常功能都一無所知，但是不可否認PSA提供了一個極有價值的癌癥標記分子，因為通過它就可以確定那些易于患前列腺癌或者是處在癌癥早期的男性，這樣就有可能引進有效的治療。最近，一個細胞因子信號轉(zhuǎn)導/受細胞因子誘導的SH2蛋白質(zhì)家族成員的抑制子-SOCS-1基因的甲基化轉(zhuǎn)錄沉默在各種各樣的癌細胞中都有發(fā)現(xiàn)，包括肝癌、多骨髓瘤和急性白血病。因此，用來檢測SOCS-1基因甲基化狀態(tài)的篩選分析就能夠提供一些與這些癌癥相關(guān)的診斷信息。
因為癌癥是潛伏性較強的疾病，在病情惡化之前沒有明顯的臨床特征和癥狀，標記分子的存在及其使用使得我們能夠確定一個人是否易于患某種癌癥，甚至作出癌癥早期的檢測，這是具有相當大醫(yī)學價值的?？上У氖?，對于大多數(shù)癌癥，還沒有這樣的標記分子可以被利用。這樣，許多癌癥患者都只有在病情惡化到需要做化療或者已經(jīng)是無藥可治的情況下才會尋求醫(yī)學的幫助。因此，就有必要尋找到可以用來檢測癌癥細胞的標記分子。本發(fā)明就滿足了這樣一個需要，并且提供了額外的優(yōu)點。
發(fā)明概述 本發(fā)明是涉及用來確定至少一個與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因的方法。舉一個例子來說明這樣的方法是如何進行，在適合于核酸分子與陣列上的互補核苷酸序列發(fā)生選擇性雜交的條件下，將代表一個基因組的核苷酸序列陣列和對應于在癌癥細胞中表達的RNA分子的核酸分子接觸，這些癌癥細胞與至少一種能夠重新激活表觀遺傳學沉默基因表達的試劑接觸過；接著檢測來自于與試劑接觸過的癌細胞的核酸分子與陣列上核苷酸序列的亞組之間雜交量的增加，這種增加是相對于對應于這些癌細胞中表達的RNA的核酸分子與核苷酸序列的該亞組的至少一個核苷酸序列的雜交而言，在所述的條件下，可以認為選擇性雜交量的增加確定了表觀遺傳學上沉默基因的重新激活表達。
和陣列上的核苷酸序列接觸的對應于RNA的核酸分子可以是DNA或者RNA，也就是說包括例如cDNA、cRNA、mRNA或者任意其他可以代表一個細胞中表達的RNA的核酸分子。能夠重新激活表觀遺傳學沉默基因的表達的試劑可以是脫甲基化試劑，如甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(如5-氮雜-2′-脫氧胞苷；5Aza-dC)，組蛋白去酰基化酶抑制劑(曲古抑菌素A；TSA)，或者是二者的組合。癌癥細胞可以是肉瘤或者癌，比如食道癌細胞。
本方法的一個具體實施方案的方法包括將陣列與對應于用5Aza-dC，TSA，或者兩者的組合接觸過的癌細胞中表達的RNA的核酸分子接觸。舉個例子，如果這里的癌細胞是食道鱗片狀細胞癌(ESCC)細胞，通過本方法確定的表觀遺傳學沉默的基因可以是表2中所列出的基因中的一種，或者是這樣的基因的組合。如果癌細胞是頭頸部鱗片狀細胞癌(HNSCC)細胞，那么通過本方法確定的表觀遺傳學上沉默的基因可以是表5或者表6中所列出的基因中的一種。作為本方案的一個方面，如果癌細胞是ESCC細胞，表觀遺傳學沉默基因是載脂蛋白D(ApoD)的基因，神經(jīng)介肽U(NU)基因，swiprosin-2基因，Hep27基因，KIF5C基因，角蛋白14基因，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2基因，MUC1基因，白介素-1受體-2(IL-1R2)基因，晶體蛋白α2基因，含LIM的半胱氨酸富含蛋白(CRIP-1)基因，Rad基因，HEM45基因，KLF6基因，卵泡抑素相關(guān)蛋白FLRG基因，XAP-5基因，Tbcld1基因，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白基因，或者是這些基因的組合。在本方案的另外一個方面，表觀遺傳學沉默基因是ApoD基因，NU基因，swiprosin-2基因，細胞因子樣因子-1(CLF-1)基因，CRIP-1基因，細胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP)基因，金屬硫蛋白1G基因，角蛋白14基因，IL-1R2基因，晶體蛋白α2基因，或者是這些基因的組合。
在另外一個實施方案中，至少一個通過本項發(fā)明提供的方法鑒定出來的表觀遺傳學沉默基因是甲基化沉默基因。比如，在ESCC中甲基化沉默基因可以是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2(uncoupling protein-2)，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。在另外一個實施方案中，表觀遺傳學沉默基因是一個腫瘤抑制基因。一方面，腫瘤抑制基因是ApoD基因，NU基因，或者是CRIP-1基因，每一個在這里提到的基因都表現(xiàn)出腫瘤抑制活性。另外一方面，腫瘤抑制基因可能是神經(jīng)介肽B基因，或者G蛋白信號通路受體2(RGS2)基因。
本發(fā)明也涉及一種鑒定細胞是否已經(jīng)失去生長控制或者容易失去生長控制的方法。舉個例子，可以通過檢測待測細胞中至少一個基因的表觀遺傳學沉默，這些基因可以是表2所列的基因，如ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。
失去生長控制或者容易失去生長控制的待測細胞可以是瘤細胞，比如前期惡性腫瘤細胞或者惡性腫瘤細胞(比如癌細胞)。這樣，該細胞可以是或者被懷疑是癌細胞，瘤細胞，或類似的細胞。在一種具體實施方案中，失去生長控制或者將來易于失去生長控制的細胞，或者是被懷疑具有類似狀況的細胞是癌細胞。這個具體方案的一個方面，癌細胞是ESCC細胞，或者是被懷疑為ESCC細胞的細胞。在這個具體方案的另外一個方面，癌細胞是HNSCC細胞，或者是被懷疑為HNSCC細胞的細胞。
在一種具體實施方案中，表觀遺傳學沉默包括甲基化沉默，其中該方法可以通過檢測待測細胞中一個或者更多基因的甲基化或者甲基化沉默來實現(xiàn)。在這個方案的一個方面，甲基化沉默的檢測是通過將包含著含有基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)的，這種對甲基化敏感的內(nèi)切酶在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識別位點上剪切，這樣，核苷酸分子的切割就可以作為指示受測細胞中這個基因甲基化的標志。針對這種方法可以應用的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶例如Acc III，Ban I，BstN I，Msp I，或者Xma I。在這個實施方案的另一方面，甲基化沉默的檢測是通過將包含著含有基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸來實現(xiàn)的，這種內(nèi)切酶在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識別位點處剪切，假如所述CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基被去甲基化的話，這樣沒有核酸分子的剪切發(fā)生提供了受測細胞中基因甲基化沉默的指示。針對這種方法可以應用的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶可以例如是Acc II，Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II，或者Not I。
基因表達的甲基化沉默也可以這樣來檢測，將含有受測細胞中基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域與化學試劑接觸，所述化學試劑會選擇性地修飾未甲基化的或者甲基化的胞嘧啶殘基，并檢測由于所述接觸而產(chǎn)生的產(chǎn)物，其中該產(chǎn)物是作為基因上CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的指示，由此檢測待測細胞中基因的甲基化沉默。這樣的產(chǎn)物可以通過下列方法來檢測，比如電泳方法，色譜方法，質(zhì)譜方法，或者是這些方法的組合。
在檢測目標基因的5′端調(diào)控區(qū)域甲基化的方法的一個方面，化學試劑是肼，由此就會生成肼處理的基因5′端調(diào)控區(qū)域，其中被肼處理的5′端調(diào)控區(qū)域再進一步與能夠剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑接觸，得到包含著含有基因的核酸分子的片斷的產(chǎn)物；進一步按照分子量大小分離這些片斷，然后檢測在這個基因的5′端調(diào)控區(qū)域中已知含有胞嘧啶殘基的位置處的缺口，其中該缺口就是基因中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化的指示，由此便可檢測受測細胞中這個基因的甲基化沉默。用來剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑可以是哌啶。
在檢測目標基因的5′端調(diào)控區(qū)域甲基化的這樣的方法的另外一個方面，化學試劑可以包括亞硫酸氫根離子，經(jīng)過它處理之后，這個基因的5′端調(diào)控區(qū)域內(nèi)未甲基化的胞嘧啶殘基就變成亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基，其中經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理過的基因進一步被暴露在堿性條件下，這樣亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基就變成了尿嘧啶殘基，然后再檢測受測細胞中亞硫酸氫根離子處理過的基因的5′端調(diào)控區(qū)域中尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布，然后再與先經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理再經(jīng)過堿性條件處理的未甲基化的基因中尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布相比，如果受測細胞中基因的5′端調(diào)控區(qū)域中的尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布減少，那就說明這個基因的5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化了。
在一個方面，尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布可以被檢測，例如，通過測定經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾的基因5′端調(diào)控區(qū)域在暴露于堿性條件后的核苷酸序列來檢測。另一方面，尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布也可以這樣來檢測，在經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理的基因序列暴露于堿性條件之后，將其與可以選擇性地與含有尿嘧啶殘基的基因5′端調(diào)控區(qū)域雜交的寡聚核苷酸雜交，然后再檢測寡聚核苷酸的選擇性雜交。用來雜交的寡聚核苷酸可以進一步包括可以檢測的標記，比如放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學發(fā)光化合物，熒光化合物，金屬鰲合劑，酶，酶底物，受體，或者受體的配體，其中可以通過檢測這些標記來檢測寡聚核苷酸的選擇性雜交。另外還有一種檢測的方法，這些寡聚核苷酸可以作為引物延伸反應的底物，其中可以通過檢測引物延伸反應的產(chǎn)物來檢測選擇性雜交。
另外一個方面，尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布還可以這樣來檢測，通過在適合擴增的條件下將基因的5′端調(diào)控區(qū)域與一對擴增引物(包括一個正向引物和反向引物)接觸，其中該引物對的至少一個引物包含可以選擇性地與5′端調(diào)控區(qū)域中含有尿嘧啶殘基的核苷酸序列雜交的寡聚核苷酸，這樣有擴增產(chǎn)物出現(xiàn)就可以作為基因5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸中胞嘧啶殘基甲基化的指示，由此待測細胞中基因的甲基化沉默就可以得到檢測。這樣一對可以使得目標基因的序列發(fā)生甲基化特異性擴增的甲基化特異性擴增引物對正如SEQ ID NOS1和2所例示(也可以參見表4；SEQ ID NOS65至127，包括至少一個正向引物(F1或者F2)和一個反向引物(R))。
在另外一個方面，尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布可以通過將基因的5′端調(diào)控區(qū)域在適合擴增的條件下與一對包括正向引物和反向引物的擴增引物接觸來檢測，其中該引物對的兩個引物都會選擇性地與5′端調(diào)控區(qū)域中含有胞嘧啶殘基的核苷酸序列雜交，而不與5′端調(diào)控區(qū)域中含有尿嘧啶殘基的對應的核苷酸序列雜交，因此擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)就代表基因5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基沒有甲基化，由此待測細胞中基因的甲基化沉默就可以得到檢測。這樣一對可以使得含有非甲基化的5′端調(diào)控區(qū)域的目標基因序列發(fā)生特異性擴增的非甲基化特異性擴增引物正如SEQ ID NOS3和4所例示。
另外一個方面，尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布可以這樣來檢測，將基因的5′端調(diào)控區(qū)域在適合擴增的條件下與第一對擴增引物和第二對擴增引物接觸，其中第一對擴增引物包括正向引物和反向引物，而且第一對引物中至少有一個引物包含可以選擇性地與基因5′端調(diào)控區(qū)域中含有尿嘧啶殘基的核苷酸序列雜交的寡聚核苷酸，而第二對擴增引物包括正向引物和反向引物，第二對引物的兩個引物都與基因5′端調(diào)控區(qū)域中含有胞嘧啶殘基的核苷酸序列選擇性雜交，而不與基因5′端調(diào)控區(qū)域中含有尿嘧啶殘基的對應核苷酸序列雜交，這樣通過第一對引物產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物，如果有的話，便具有一個第一長度，而通過第二對引物產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物，如果有的話，便具有一個第二長度，而且它與第一長度不同，那么擴增產(chǎn)物的長度就可以用來指示尿嘧啶殘基的存在，這樣也就可以指示這個基因5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化。
在另外一個實施方案中，甲基化沉默的檢測可以通過用一種脫甲基化試劑與待測細胞接觸，然后檢測被重新激活的由基因編碼的RNA的表達，再與沒有用脫甲基化試劑接觸過的細胞中RNA的表達水平比較，檢測出甲基化沉默來實現(xiàn)。這種脫甲基化試劑可以例如是一種甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，比如5Aza-dC，由表觀遺傳學沉默基因編碼的RNA的重新激活的表達可以被檢測，例如通過檢測表達出來的RNA，或者是其產(chǎn)物，比如RNA的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)產(chǎn)物。
用于檢測表觀遺傳學沉默基因的本方法能夠方便地被適用于高通量的形式，其中待測細胞或者待測細胞的抽提物是多份待測細胞、待測細胞抽提物或者兩者的組合中之一。這些多份待測細胞或者待測細胞抽提物可以是一樣的或者不同的，或者是其組合，比如某個特定待測細胞的雙倍，三倍或者更多倍數(shù)的重復，大量的不同的待測細胞樣品能夠但并不是一定要排在一個陣列上，比如一種可尋址陣列(addressable array)上(例如，在一個固體支持物比如微芯片，玻璃板，或者珠子上)。更進一步，兩個或者更多的基因可以在一種待測細胞(或者抽提物)的單個樣本上檢測表觀遺傳學沉默，比如使用不同標記的寡聚核苷酸，由此可以提供多元的形式。在一種實施方案中，通過高通量和/或者多元化分析來檢測的待測細胞可以進一步包含檢測對應的表現(xiàn)出受控生長的細胞或者其抽提物中基因5′端調(diào)控區(qū)域CpG島中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化，如果有的話。
通過本發(fā)明中提供的一種方法來檢測的待測細胞(或者抽提物)可以包括從一個個體比如人類個體中獲得的樣本的細胞。如此，樣本可以是器官樣本，組織樣本，或者是細胞樣本，比如食道樣本，肝臟樣本，皮膚樣本，淋巴結(jié)樣本，腎臟樣本，肺樣本，肌肉樣本，骨樣本，腸胃樣本，或者腦樣本；或者是生物液體樣本，比如，骨髓，血液，血清，淋巴，腦脊液，唾液，痰，糞便，尿液，或者精液，它們都含有包含著需要被檢測表觀遺傳學沉默的一個或多個基因的核酸分子。
本發(fā)明還涉及一種降低或者抑制不受控制的細胞生長的方法，這些細胞表現(xiàn)出已有至少一個與癌癥相關(guān)的基因在表觀遺傳學上的轉(zhuǎn)錄沉默。這樣的方法可以通過例如恢復在細胞中表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的表達來實現(xiàn)，這樣就可以降低或者抑制不受控制的細胞生長。在一種具體實施方案中，這些由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的表達可以通過將細胞與去甲基化試劑，組蛋白去?；敢种苿?，或者二者的組合接觸來實現(xiàn)。這個方案的一個方面，至少有一個表觀遺傳學沉默的基因是甲基化沉默基因，并且是將細胞與去甲基化試劑比如5Aza-dC接觸。一般來說，用去甲基化試劑來處理細胞都是通過向個體中施用去甲基化試劑來實現(xiàn)，也就是說這些試劑在體內(nèi)接觸細胞。
在另外一個具體實施方案中，細胞中由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的表達是通過向細胞內(nèi)引入編碼該多肽的多聚核苷酸，然后該多肽就可以從這種多聚核苷酸開始表達。這種多聚核苷酸可以但并不一定需要被包含在一個載體中，比如，病毒載體，也可以被制成配方，比如在像脂質(zhì)體，微氣泡，或者類似物的基質(zhì)中。一般來說，向細胞中引入多聚核苷酸都是通過向生物體中注入這些多聚核苷酸使得這些包含在載體和/或者被制成配方的多聚核苷酸可以在體內(nèi)接觸細胞。
可以在這樣的方法中應用的多聚核苷酸可以是任何的對應于表觀遺傳學沉默基因的多聚核苷酸。比如，在細胞是ESCC細胞的情況下，表觀遺傳學沉默的基因可以是列在表2中的基因的一種，而多聚核苷酸可以是編碼由這個基因編碼的多肽的核酸分子，這樣的多聚核苷酸的GeneBank登記序列號如表2所示。舉個例子，表觀遺傳學沉默的基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-I R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。而如果細胞是一個HNSCC細胞，那么表觀遺傳學沉默的基因可以是表5或表6中所列基因的一種，而多聚核苷酸可以是編碼由這個基因編碼的多肽的核酸分子，這樣的多聚核苷酸的GeneBank登記序列號如表5和表6所示。
在一種具體實施方案中，細胞為ESCC細胞，表觀遺傳學沉默基因是一個甲基化沉默的基因，比如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。在另一種具體實施方案中，細胞是ESCC細胞，表觀遺傳學沉默的基因是一個腫瘤抑制基因，比如ApoD，NU，或者CRIP-1基因；或者腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B，或者G蛋白信號通路受體2(RGS2)基因；或者ESCC細胞含有這些腫瘤抑制基因的組合。
本發(fā)明進一步涉及一種治療癌癥病人的方法，其中病人的癌細胞表現(xiàn)出至少一個基因的遺傳學沉默表達。這樣的方法可以這樣被實施，例如通過恢復個體內(nèi)癌細胞中至少一個表觀遺傳學沉默基因的表達，由此治療癌癥病人。至少有一個表觀遺傳學沉默基因可以是甲基化沉默基因，而且可以但并不一定是腫瘤抑制基因或者影響腫瘤抑制基因表達或者活性的基因。
在一種具體實施方案中，癌癥患者的癌細胞中含有至少一種甲基化沉默基因，而且本方法包括注入個體內(nèi)足夠量的去甲基化試劑以恢復個體內(nèi)癌細胞中甲基化沉默基因的表達。在另外一個具體實施方案中，癌癥患者的癌細胞中含有至少一種表觀遺傳學沉默的基因，而且本方法包括將至少一種編碼由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸注入個體內(nèi)，并保證其量足以讓病人體內(nèi)癌細胞中至少一種多肽表達。這樣的多聚核苷酸可以包含在一個載體比如病毒載體中；和/或者可以被配制在比如脂質(zhì)體或者微氣泡這樣的基質(zhì)中。
通過本發(fā)明提供的方法來處理的癌癥可以是任何一種癌癥，只要這些癌癥含有至少一個與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因，這些癌癥包括例如癌(carcinoma)和肉瘤(sarcoma)。在一種具體實施方案中，該癌癥是食道鱗片狀細胞癌，而表觀遺傳學沉默基因包括列在表2中的一個或者更多的基因。比如表觀遺傳學沉默基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。一個方面，表觀遺傳學沉默的基因包含至少一個甲基化沉默的基因，比如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。另外一個方面，表觀遺傳學沉默的基因包括至少一個腫瘤抑制基因，比如ApoD，NU，和/或者CRIP-1基因；或者是神經(jīng)介肽B和/或RGS2基因；或者是它們的組合。在另外一個具體實施方案中，該癌癥是頭頸部癌，表觀遺傳學沉默的基因包括表5和6所列出的基因中的一種或者更多。
本發(fā)明還涉及一種為治療癌癥患者選擇治療策略的方法。這樣的方法可以這樣來實施，例如通過本發(fā)明在這里公開的基因組篩選方法，確定至少一個與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因；然后再選擇一種可以有效地恢復所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因在病人癌細胞中的表達的試劑。這些試劑可以是，例如，編碼本來由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸，或者是編碼由表2中所列基因來編碼的多肽的多聚核苷酸，這些基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。
在一種具體實施方案中，被鑒定出來的表觀遺傳學沉默基因包括至少一個甲基化沉默基因，而選擇的試劑是對癌細胞中所述的至少一種甲基化沉默基因的恢復表達有用的試劑。在這個方法的一個方面，被挑選出來的試劑包括編碼本來由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸，這些基因可以是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因。這個方法的另外一個方面，被挑選出來的試劑包括一種去甲基化試劑，比如5Aza-dC。
在另外一種具體實施方案中，被鑒定出來的表觀遺傳學沉默基因包括至少一個腫瘤抑制基因，而選擇出來的試劑是對癌細胞中由所述的表觀遺傳學沉默的腫瘤抑制基因編碼的多肽的恢復表達有用的試劑。例如，這種腫瘤抑制基因可以是ApoD，NU，或者CRIP-1基因，或者神經(jīng)介肽B和/或RGS2基因，或者是這些基因的組合，被選擇出來的試劑可以是編碼ApoD，NU，CRIP-1基因，神經(jīng)介肽B，和/或者RGS2基因產(chǎn)物的多聚核苷酸。
本發(fā)明也涉及一種治療患有食道鱗片狀細胞癌(ESCC)的病人的方法，其中與食道鱗片狀細胞癌相關(guān)的細胞含有至少一個表觀遺傳學沉默的基因。這樣的方法可以這樣被實施，例如通過向病人體內(nèi)注入一定量的使至少一種表觀遺傳學沉默基因的表達得以恢復的試劑，這種試劑的用量要達到足夠使得與食道鱗片狀細胞癌相關(guān)的細胞中表觀遺傳學基因恢復表達，然后就可以達到治療病人的目的。在一種具體實施方案中，該試劑包括編碼至少一種表觀遺傳學沉默基因的多聚核苷酸，特別是包含表2中所列基因的編碼序列的多聚核苷酸，比如包含下列基因的編碼序列的多聚核苷酸ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1 R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。
在另外一個具體實施方案中，至少一個表觀遺傳學沉默基因是甲基化沉默基因，而治療病人的試劑則包含編碼由甲基化沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸。對于這些多聚核苷酸，可以包含下列基因的編碼序列ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。
在另外一個具體實施方案中，至少有一個表觀遺傳學沉默基因包括腫瘤抑制基因，而治療病人的方法包括恢復病人體內(nèi)的ESCC細胞中腫瘤抑制基因的表達。比如，腫瘤抑制基因可以是ApoD，NU，或者CRIP-1；或者可以是神經(jīng)介肽B，或者RGS2基因；或者可以是包含這些基因的至少一種的組合；而所述試劑可以是編碼一個或者多個表觀遺傳學沉默的腫瘤抑制基因的多聚核苷酸。在本發(fā)明的方法中有效的試劑可以被直接施于體內(nèi)這些細胞的位置，或者被局部地施用，或者被系統(tǒng)地施用，只要是藥物能夠和體內(nèi)的ESCC細胞接觸。
本發(fā)明進一步涉及分離的寡聚核苷酸，其具有正如SEQ IDNOS1至127中的任何一個所闡述的核苷酸序列，本發(fā)明還涉及一組分離的寡聚核苷酸，其包括至少兩種列在SEQ ID NOS1至127中的寡聚核苷酸。另外，本發(fā)明也涉及擴增引物對，其包括一個正向引物和一個反向引物，其序列如SEQ ID NOS1和2所例示，和SEQ ID NOS3和4所例示(請參見表3，SEQ ID NOS7和8，SEQ ID NOS9和10等；表4，SEQ ID NOS65和67或者SEQ ID NOS66和67；SEQ IDNOS68和69；SEQ ID NOS70和72或者SEQ ID NOS71和72等)，這些引物可以擴增出表2中所列的基因的核苷酸序列。一方面，本發(fā)明的擴增引物對可以用來特異性地擴增核酸分子的甲基化5′端調(diào)控區(qū)域，其中一對這樣的擴增引物如SEQ ID NOS1和2所例示，它們可以擴增具有甲基化5′端調(diào)控區(qū)域的ApoD基因，通過包括由表4所列的SEQ ID NOS65至124的正向引物(F1或者F2)和反向引物(R)的引物對，可以擴增出具有甲基化5′端調(diào)控區(qū)域的基因。另外一個方面，本發(fā)明的擴增引物對可以用來特異性地擴增核酸分子的非甲基化5′端調(diào)控區(qū)域，其中一對這樣的引物如SEQ ID NOS3和4所例示，它們可以擴增具有非甲基化5′端調(diào)控區(qū)域的ApoD基因。
本發(fā)明還涉及試劑盒，其含有至少一種本發(fā)明的分離的寡聚核苷酸，其包括例如多種這樣的分離的寡聚核苷酸。在一個具體實施方案中，本發(fā)明的試劑盒的多種分離的寡聚核苷酸包括至少一對擴增引物(即，一個正向引物和一個反向引物)，還可以包括多個擴增引物對。這樣，本發(fā)明的試劑盒可以包含，比如一對或者很多對甲基化特異性擴增引物，非甲基化特異性擴增引物，或者是甲基化特異性擴增引物和非甲基化特異性擴增引物的組合，這種組合包括用來擴增特定基因的甲基化形式或者非甲基化形式的甲基化特異性引物對和非甲基化特異性引物對，而這些特定基因在一種或者更多種類型的癌癥細胞中是處于甲基化沉默狀態(tài)或者被懷疑是處于這樣的狀態(tài)。
本發(fā)明的試劑盒可以進一步包括一些額外的試劑，這些試劑都是有用的，比如對于試劑盒中的寡聚核苷酸的有效應用來說是有用的。例如，如果試劑盒包括一對或者多對甲基化特異性或者非甲基化特異性擴增引物，該試劑盒還可以進一步包括比如用于對照的寡聚核苷酸，它可以是甲基化的也可以是非甲基化的；一種或者更多種修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑，和/或者一種或者多種用于實現(xiàn)一個擴增反應的試劑。如果試劑盒包含一種或者多種可以選擇性地與甲基化或者非甲基化基因序列雜交的寡聚核苷酸，那么這個試劑盒還可以進一步包含比如一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶。


圖1提供了挑選腫瘤抑制基因(TSGs)的流程圖。三個食道鱗片狀細胞癌(ESCC)細胞系在用1至5μM 5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5Aza-dC)±300nM曲古抑菌素A(TSA)處理之后，與含有12599個寡聚核苷酸的微陣列進行cRNA雜交，由此篩選可能的TSG。有超過500個獨特的基因被鑒定出來，它們在經(jīng)過處理之后都表現(xiàn)出大于或等于3倍的表達增加(表1)。如果只挑選在這些受測的ESCC細胞系中普遍表達上調(diào)的基因，那么候選基因的數(shù)目就會減少(120個基因)，根據(jù)表達譜并去掉未知的基因，基因數(shù)目就更少了。從挑選之后剩下的58個基因中選出22個基因進行啟動子超甲基化的檢測，這種檢測是通過在ESCC細胞系中作直接的測序或者作甲基化特異的PCR反應(MSP)來完成的，結(jié)果有13個基因得到確認。這13個基因中有10個在ESCC組織中是甲基化的，而這10個基因中又有3個基因在集落聚集檢驗(colony focus assay)中發(fā)現(xiàn)具有生長抑制活性。上標字母標記如下a)在多于兩個ESCC細胞系中重新表達；b)如果沒有證據(jù)表明在正常食道中表達就將其去除；c)挑選22個具有富含CpG的啟動子的基因用于檢測其在細胞系中的甲基化；d)13個基因中的10個基因被確認在原發(fā)性腫瘤組織中具有啟動子被甲基化的特征；和e)挑選10個基因中的3個基因而且確認這3個基因具有腫瘤抑制活性。
圖2說明的是在原發(fā)性腫瘤中基因的甲基化和基因表達。對于在ESCC細胞系表現(xiàn)出甲基化的13個待測基因，在原發(fā)性腫瘤中檢測了它們的甲基化狀態(tài)。黑色的方格表示啟動子區(qū)域被甲基化；帶斑點的方格表示通過直接測序發(fā)現(xiàn)其部分(低水平)甲基化。T，表示腫瘤組織；N，表示正常食道粘膜。
圖3說明的是KYSE30ESCC細胞的集落形成實驗結(jié)果。實驗結(jié)果是三次獨立實驗的平均值。轉(zhuǎn)染了Stat3C(2)，Apo D(3)，CRIP1(4)或者p53(5)的細胞的集落形成效率與對照(1；空的pcDNA3TM載體)相比。對照克隆的數(shù)目被看成是100％的集落形成效率；Apo D＝61％；CRIP 1＝18％。在另外一個實驗中，在存在PBS或者神經(jīng)介肽U(終濃度為100μM)的情況下，pcDNA3(對照)轉(zhuǎn)染的細胞用G418進行兩周的篩選后，集落形成的結(jié)果表明在神經(jīng)介肽U處理的細胞中集落形成效率降低到了43％。
發(fā)明詳述 本發(fā)明基于發(fā)展一種鑒定基因組中表觀遺傳學沉默基因的方法，特別是對于腫瘤抑制基因，而且是在表現(xiàn)出失去生長控制或者容易失去生長控制的細胞的基因組中鑒定，比如癌癥細胞的基因組。本發(fā)明通過鑒定ESCC細胞中565個表達上調(diào)的基因來說明其具體細節(jié)，這些細胞分別用去甲基化試劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或者是二者的組合來處理，這些基因中包括甲基化沉默基因和腫瘤抑制基因(見表1)。更進一步，有58個普遍地表達上調(diào)的基因被確認，其中有53個含有CpG島，而且其中有44個基因含有高密度的CpG島。這53個基因中有25個基因被隨機挑選出來，發(fā)現(xiàn)這些被挑選出來的基因具有在脫甲基化試劑處理之后重新表達的特性，而且其中還有3個基因被確認具有腫瘤抑制活性(見實施例1)。再者，這種基因組篩選的方法還通過鑒定在頭頸部鱗片狀細胞癌(HNSCC)細胞中表觀遺傳學沉默的基因來進一步例示(見表5，表6，和實施例2)。因此，本方法提供了一種鑒定與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因的方法，還進一步提供了檢測與基因表達的表觀遺傳學沉默相關(guān)的癌癥的方法，以及治療患有這樣的癌癥的病人的方法和對于實施本方法有用的組合物。
啟動子的高度甲基化是腫瘤抑制基因失活的常見途徑。正如在這里公開的一樣，一種用來確定甲基化的基因的方法被提供，其基于食道癌細胞系中表觀遺傳學沉默的藥物學揭露。這種方法和選擇算法非常強大，可以鑒定原發(fā)性食道腫瘤組織中的大量新的甲基化基因。這些被鑒定出來的甲基化基因提供了診斷和治療的靶點，而且還進一步提供了對腫瘤生物學的啟示。三個被鑒定出來的基因，神經(jīng)介肽U(NU)，半胱氨酸富含型腸道蛋白1(CRIP1)，和載脂蛋白D(ApoD)，在癌細胞中被過量表達時表現(xiàn)出強有效的腫瘤抑制活性。
利用含有12599個基因的微陣列，基于5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5Aza-dC)和曲古抑菌素A(TSA)對表觀遺傳學沉默的腫瘤抑制基因的功能性重新激活，對ESCC細胞中通常是失活的腫瘤抑制基因進行全面的篩選。在通過本方法鑒定出來的58基因中，有44個(76％)基因的啟動子區(qū)都含有高密度的CpG島。在細胞系中22個被測基因中有13基因的啟動子都被甲基化了，有10個基因還是在原代ESCC細胞中被甲基化的，而且伴隨著在mRNA水平上的沉默。在ESCC細胞系中有強有效的生長抑制活性的基因包括CRIP1，ApoD和NU基因，它們的生長抑制活性是通過克隆集落實驗(colony focus assays)來證明的。在這里公開的結(jié)果表明表觀遺傳學沉默的藥物學逆轉(zhuǎn)是一種有效的全面鑒定人類癌癥中腫瘤抑制基因的方法。
食道的癌癥是第八大最常見的惡性腫瘤，而且被認為是世界上第六大最常見的死亡原因(Pissani等，Int.J.Cancer 80870-873，1999)。不同組織類型的食道癌的發(fā)生頻率都不一樣，但是就世界范圍內(nèi)來說，鱗片狀細胞癌是最主要的類型。相當多的流行病學證據(jù)表明，酒精，煙草，缺乏維他命/保護性抗氧化劑的食物，致癌物質(zhì)(比如，頻繁攝入腌制的蔬菜)和熱傷害是ESCC重要的致病源(參見，比如，Chen等，Int.J.Cancer 820-822，1995；Garidou等，Int.J.Cancer 68295-299，1996)。分子生物學方面最近的進展也揭示了在人類ESCC細胞的p53和p16/Rb腫瘤抑制通路中常見的遺傳學或者表觀遺傳學方面的改變(Xu等，Cancer Res.62，3493-3497，2002；Montesano等，Int.J.Cancer69225-235，1996；Mandard等，Mutat.Res.462335-342，2000)。分子靶點的進一步確認可以使得在分子水平上預防，診斷和治療鱗片狀食道癌。盡管如此，和在其他癌癥中一樣，在ESCC中普遍地失活的腫瘤抑制基因(TSG)在基因組范圍內(nèi)的全面檢測依然是令人困惑的。
除了遺傳學上的改變，在DNA甲基化方面的改變，在哺乳動物細胞中出現(xiàn)的表觀遺傳學過程，也是人類癌癥的一個標記(Baylin等，Hum.Mol.Genet.10687-692，2001)。許多基因的啟動子區(qū)域，特別是那些“持家”基因的啟動子，都含有許多的CpG二核苷酸，而這在基因組的其他部分是比較少見的。這些區(qū)域已經(jīng)被命名為“CpG島”，除了在失活的X染色體和印記基因上的基因，在正常細胞中CpG島是沒有甲基化的(參見Baylin等，supra，2001)。這種保護是非常重要的，因為CpG島的甲基化會導致與其相關(guān)的基因的表達失活。在致癌過程中，全面的過度甲基化常常伴隨著特定啟動子的高密度甲基化(Yoshikawa等，Nature Genet.2829-35，2001，這篇文獻在此引入作為參考；也請參見，Merlo等，Nature Med.1686，1995；Dammann等，Nat.Genet.25315-319，2000；Li等，Cell 109113-124，2002)。許多研究都表明與啟動子的過度甲基化相聯(lián)系的腫瘤抑制基因的沉默是人類癌癥中常見的特征，而且是另外一種腫瘤抑制基因功能喪失的機制。比如，p16的過度甲基化伴隨著基因的表達失活，而且還是許多固體惡性腫瘤的常見特征(Merlo等，supra，1995)。過度甲基化也與腫瘤抑制基因VHL的失活相關(guān)，而且在沒有致失活性的點突變的情況下在一部分腎透明細胞癌中都有這種現(xiàn)象發(fā)生(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA919700-9704，1994；Meyer等，Int.J.Cancer 5650-653，2000)，而與p15的表達喪失相關(guān)的過度甲基化是許多急性白血病的一個特征(Herman等，Cancer Res.56722-727，1996)。其他腫瘤抑制基因比如錯配修復基因的轉(zhuǎn)錄沉默也確定過度甲基化是人類癌癥中腫瘤抑制功能喪失的常見機制之一。因此，人類腫瘤中越來越多的腫瘤抑制基因都發(fā)現(xiàn)同時具有遺傳學和表觀遺傳學上的失活。
因為啟動子的過度甲基化與基因表達的沉默相關(guān)，因此關(guān)于整個基因組的甲基化模式方面的知識，有時侯也稱之為“甲基化組(methylsome)”(Feinberg，Nat.Genet.279-10，2001)，能夠提供一種有效地鑒定在腫瘤形成過程中失活的腫瘤抑制基因的手段。5Aza-dC能夠整合到基因組DNA中并與甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性中心形成共價復合物，因此可被用來解除基因的表觀遺傳學失活。這種自殺性的抑制去除了甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，結(jié)果達到了一般性去甲基化的目的。然而，染色質(zhì)是由DNA和組蛋白構(gòu)成的復合物，組蛋白的乙?；饔靡采婕盎虻霓D(zhuǎn)錄(Pennisi，Science 275155-157，1997；Marks等，Nat.Rev.Cancer 3194-2022001)。另外，DNA的甲基化有助于建模組蛋白的乙?；饔?Gray和Teh，Curr.Mol.Med.1401-429，2001)。甲基CpG結(jié)合蛋白MeCP2出現(xiàn)在一個具備組蛋白脫乙酰酶活性的復合體中，而DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與組蛋白脫乙酰酶2(HDAC2)以及輔阻遏物DMAP1結(jié)合(Rountree等，Nat.Genet.25269-277，2000)。因此，高密度甲基化的DNA與轉(zhuǎn)錄上抑制的染色質(zhì)相關(guān)，其特征為存在較低水平的乙酰基化的組蛋白。TSA是一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑，能夠使依賴于甲基化的啟動子模板的轉(zhuǎn)錄抑制染色質(zhì)的形成過程失敗(Yoshida和Horinouchi，Ann.NY Acad.Sci.88623-26，1999)。表觀遺傳學改變因此是動態(tài)聯(lián)系的，利用TSA在去甲基化和組蛋白脫乙酰酶抑制之間建立了協(xié)同作用，這比單獨的5Aza-dC使癌細胞中沉默的基因重新激活的效果要更加好(Cameron等，Nature Genet.21103-107，1999；Suzuki等，Nature Genet.31141-149，2002)。正如在這里公開的，用5Aza-dC和TSA對ESCC細胞進行藥物學上的處理，接著進行的cRNA微陣列分析，全面地鑒定癌癥中表觀遺傳學上失活的基因。這種方法鑒定出了大量含有高密度甲基化啟動子的基因，而且進一步的研究表明其中一部分被鑒定出來的基因在原發(fā)性腫瘤中常常是處于失活狀態(tài)的，而且在失活之前具有腫瘤抑制活性。
相應地，鑒定表觀遺傳學沉默基因的方法在這里被提出來，比如，鑒定甲基化沉默基因，包括與癌癥相關(guān)的腫瘤抑制基因。在一種具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定至少一種與至少一種癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因的方法。而在這里提到的“至少一個”是指1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，或者更多。比如，這里公開的微陣列方法鑒定出了565個表觀遺傳學沉默的基因，主要是根據(jù)它們在ESCC細胞中經(jīng)過去甲基化試劑和/或組蛋白脫乙酰酶抑制劑處理之后表達量上升的能力來判斷的。進一步，在被鑒定為在ESCC細胞中表觀遺傳學上沉默的基因中有數(shù)個被確定為具有腫瘤抑制基因的特征(也請參見，表2，5和6)。
術(shù)語“表觀遺傳學沉默”，常常用在一個基因上，意思是這個基因已經(jīng)不能夠被轉(zhuǎn)錄了，或者與相應的對照細胞(比如正常細胞)中對應的基因的表達水平相比轉(zhuǎn)錄水平降低了，其機制是不同于普通的遺傳改變的?；虺聊谋碛^遺傳學機制已經(jīng)被研究的很清楚了，它包括，例如，基因5’端調(diào)控區(qū)域中CpG島中的CpG二核苷酸過度甲基化，和由例如組蛋白乙?；鸬娜旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，這樣基因的轉(zhuǎn)錄就被減弱或者抑制了。在這里公開了檢測基因的表觀遺傳學沉默的方法，它包括，例如，檢測細胞在與減除表觀遺傳學沉默的試劑接觸之后基因的重新表達(重新激活)，舉個例子，如果沉默是由于過度甲基化導致的，那么就檢測細胞在與去甲基化試劑接觸之后基因的重新激活。
這里提到的“甲基化”或者“過度甲基化”這些名詞，也常常用來形容一個基因，意指與基因相關(guān)的CpG島中的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基在5’的位置被甲基化，即5’-甲基化胞嘧啶。此處提到的“甲基化狀態(tài)(methylation status)”這個名詞表示的是一種相對豐度，包括在一個CpG島上CpG二核苷酸中的甲基化胞嘧啶殘基的有或無。一般地，具備轉(zhuǎn)錄活性的基因的CpG島上的胞嘧啶殘基是沒有甲基化的，因此檢測到CpG島上甲基化的胞嘧啶殘基說明這個基因的表達水平降低了或者是被抑制了。相應地，這里提到的“甲基化沉默(methylation silenced)”基因是指由于基因5’調(diào)控區(qū)域的CpG島中的CpG二核苷酸的過度甲基化，這個基因不再被轉(zhuǎn)錄了，或者是與相應的對照細胞(一般是正常細胞)中相應基因的轉(zhuǎn)錄水平相比轉(zhuǎn)錄水平降低了。甲基化基因表達沉默的一個結(jié)果就是含有這個基因的細胞具有降低水平的或者是完全缺乏由這個基因編碼的多肽(即，基因產(chǎn)物)，使得細胞中通常由該基因產(chǎn)物負責的所有功能下降或者缺乏。
本發(fā)明涉及鑒定至少一種與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因的方法。這樣的方法可以通過下面的途徑來實現(xiàn)，比如，在適合于核酸分子與陣列上的互補核苷酸序列選擇性雜交的條件下，將代表基因組的核苷酸序列陣列與對應于癌細胞中表達的RNA的核酸分子接觸，而這些癌細胞是用至少一種能夠重新激活表觀遺傳學沉默基因的表達的試劑接觸過的；然后檢測用試劑接觸過的癌細胞的核酸分子與陣列上某個部分的核苷酸序列的增高的雜交水平，這種增高是相對于在所述條件下對應于癌細胞中表達的RNA的核酸分子與該部分的核苷酸序列中的至少一個序列的雜交水平而言，如果有的話，因而選擇性雜交量的增加就可以鑒定表觀遺傳學沉默基因的重新激活的表達。
這里提到的“代表基因組的核苷酸序列陣列”是指一組有組織的核苷酸序列連接到一塊固體支持物上，比如一塊微芯片或者玻璃板，其中這些序列就可以特異地和選擇性地與細胞中表達的核酸分子雜交。這種陣列是基于要研究的細胞所來源的生物而選擇的，一般是代表一個真核生物細胞的基因組，特別是哺乳動物細胞，而且優(yōu)選人類細胞。一般地，能夠“代表”基因組的一個陣列的探針至少能夠鑒定細胞中表達的核酸分子的10％，一般都是至少是20％或者40％，常常是50％到70％，有些情況下是至少80％或者90％，優(yōu)選是能夠鑒定所有表達的核酸分子。應該意識到，陣列能夠代表越多的基因，就表示有越多的可能會鑒定到癌癥細胞中所有的表觀遺傳學沉默的基因。含有能夠代表某些特定基因組的核苷酸序列的陣列可以通過已知的方法來制備，或者是通過商業(yè)資源(比如Affymetrix；Invitrogen公司)購買，比如在本研究中使用的GeneChipTM人類基因組U95AV2陣列(Affymetrix)(見實施例1)。
這里提到的細胞的“對應于RNA的核酸分子”是指比如mRNA或者polyA+RNA的RNA分子，用細胞中的RNA作為模板獲得的cDNA，或者是用RNA或者cDNA作為模板獲得的的cRNA。為了實踐本發(fā)明的方法，這些對應于細胞中的RNA的核酸分子一般都有可以檢測的標記，比如，帶有放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學發(fā)光化合物，熒光化合物，金屬螯合劑，酶，酶底物，受體，或者受體的配體；或者是能夠比如用一個可以檢測的標記探針來檢測，這樣核酸分子與陣列上的核苷酸序列的雜交就可以被檢測。因此，與陣列上的核苷酸序列接觸的對應于RNA的核酸分子可以是DNA或者RNA，包括，例如，cDNA，cRNA，mRNA，或者任何可以代表細胞中表達的RNA的核酸分子。那些能夠重新激活表觀遺傳學沉默基因的試劑可以是一種去甲基化試劑比如甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(比如5Aza-dC)，一種組蛋白脫乙酰酶抑制劑(比如TSA)，或者是它們的組合。
根據(jù)本發(fā)明中的方法，至少有一種(比如1，2，3，4，5，或者更多種)表觀遺傳學沉默基因與至少一種(比如1，2，3，或者更多種)癌癥(cancer)相關(guān)。這些癌癥可以是，比如癌(carcinoma)或者肉瘤(sarcoma)，包括一種或者更多種特定類型的癌癥，比如消化道或者腸道癌，肝癌，皮膚癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，淋巴癌，白血病，腎癌，肺癌，肌肉癌癥，骨癌，或者腦癌。與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默的基因用在表2中列出來的基因(而且還提供這些基因的GenBank注冊號)來例示，它們都與ESCC相關(guān)。參見表2，ESCC細胞中表觀遺傳學沉默的基因可以在細胞與去甲基化試劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或者它們的組合接觸之后被重新激活，這些基因包括載脂蛋白D(ApoD)基因，神經(jīng)介肽U(NU)基因，swiprosin-2基因，Hep27基因，KIF5C基因，角蛋白14基因，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2基因，MUC1基因，白介素-1受體-2(IL-1R2)基因，晶體蛋白α2基因，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白(CRIP-1)基因，Rad基因，HEM45基因，KLF6基因，類卵泡抑素蛋白FLRG基因，XAP-5基因，Tbcld1基因，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白基因，或者是這些基因的組合。
在一種具體實施方案中，表觀遺傳學沉默基因包括下列基因中的一種或者多種ApoD基因，NU基因，swissprosin-2基因，細胞因子樣因子-1(CLF-1)基因，CRIP-1基因，細胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP)基因，金屬硫蛋白1G基因，角蛋白14基因，IL-1R2基因，或者晶體蛋白α2基因。在另外-種具體實施方案中，至少有一個表觀遺傳學沉默基因是甲基化沉默基因，比如，ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白-2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。在又另外一個具體實施方案中，表觀遺傳學沉默的基因是腫瘤抑制基因，比如，ApoD基因，NU基因，或者是CRIP-1基因，這里所列的三個基因都有腫瘤抑制活性；和/或神經(jīng)介肽B基因和/或G蛋白信號通路受體2(RSG2)基因。
正常非甲基化基因的啟動子區(qū)域CpG二核苷酸的DNA異常甲基化導致的基因轉(zhuǎn)錄沉默是腫瘤發(fā)生中被最廣泛研究的一種表觀遺傳學異常。由甲基化-CpG-結(jié)合結(jié)構(gòu)域，轉(zhuǎn)錄輔阻遏物，染色質(zhì)重排蛋白(chromatin remodeling proteins)和組蛋白脫乙酰酶組成的蛋白復合物與過度甲基化的DNA區(qū)域的結(jié)合使得染色質(zhì)處于轉(zhuǎn)錄抑制(沉默)的狀態(tài)。在真核細胞中，位于鳥嘌呤殘基的5’端的胞嘧啶殘基的甲基化主要在CpG缺乏區(qū)發(fā)生。相反，正常細胞中CpG島常常保持非甲基化的狀態(tài)，除了失活的X染色體和親本的特異性印記基因，這些區(qū)域的5’端調(diào)控區(qū)域的甲基化常常與它們的轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。眼癌(Rb)基因一開始就被甲基化的情況被證明在眼癌中占有一小部分的比例(Sakai等，Am.J.Hum.Genet.48880，1991)，VHL基因的異常甲基化也在一部分散發(fā)性腎細胞癌中被發(fā)現(xiàn)(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA919700-9704，1994)。正常非甲基化的5’CpG島的重新甲基化也發(fā)現(xiàn)能夠使腫瘤抑制基因的表達功能喪失(參見，比如，Issa等，NatureGenet.7536，1994；Merlo等，Nature Med.1686，1995；Herman等，Cancer Res.56722，1996)。
啟動子區(qū)域的CpG島的異常甲基化還與癌癥的進一步發(fā)展有關(guān)。比如在造血細胞腫瘤中，E-鈣依粘連蛋白(Graff等，Cancer Res.555195-5199，1995)，DAP激酶(Katzenellenbogen等，Blood934347-4353，1999)，和細胞周期調(diào)控子p15INK4B和p16INK4A的過度甲基化都與基因的失活相關(guān)(Herman等，Cancer Res.57837-841 1997；Melki等，Blood 953208-3213，2000；Ng等，Clin.Canc.Res.71724-1729，2001)。由于過度甲基化導致的轉(zhuǎn)錄沉默還在CDKN2A基因(Herman等，Cancer Res.554525-4530，1995)，MGMT(Esteller等，Cancer Res.59793-797，1999)，和MLH1基因(Herman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA956870-6875，1998)中發(fā)現(xiàn)。
染色體17p13.3位置的CpG島的過度甲基化在多種常見類型的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)(Makos等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 891929，1992；Makos等，Cancer Res.532715，1993；Makos等，Cancer Res.532719，1993)，而且在腦癌，結(jié)腸癌和眼癌中還與17p丟失和p53突變的時間和頻率一致。與正常非甲基化啟動子區(qū)域CpG島的過度甲基化相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄沉默向我們展示了不同于編碼區(qū)突變機制的另外一種使腫瘤抑制基因失活的機制(Baylin等，Cancer Cells 3383，1991；Jones和Buckley，Adv.Cancer Res.541-23，1990)。這種變化還與VHL，染色體3p上一種腎癌腫瘤抑制基因(Herman等，supra，1994)，染色體6q上的雌激素受體基因(Ottaviano等，Cancer Res.542552，1994)和染色體11p上的H19基因(Steenman等，Nature Genetics，7433，1994)的表達丟失相關(guān)。
本發(fā)明還涉及一種鑒定細胞是否表現(xiàn)出或者易于失去生長控制的方法。比如，這個方法可以這樣實現(xiàn)，檢測待測細胞中基因的表觀遺傳學沉默，這些基因至少是列在表2中的一種基因或者是這些基因的組合。在一種具體實施方案中，本發(fā)明的方法一部分需要比較待測細胞中基因的甲基化狀態(tài)與正常生長的細胞中對應的基因的甲基化狀態(tài)。此處所使用的名詞“對應的”是指參考材料，通過它就可以比較待測材料。一般地，參考材料提供一個對照或者標準讓待測材料具有可比性。比如，對于一個待測其甲基化狀態(tài)的ApoD基因，參照一個對應的非甲基化的ApoD基因，就是指待測甲基化狀態(tài)的ApoD基因的類型與非甲基化ApoD基因的類型相同，比如，待測基因和對應的非甲基化基因都是人類ApoD基因。對于待測細胞來說，參考一個對應的正常生長的細胞一般是指參考正常的細胞，即其細胞周期和生長方式具有健康個體中該類細胞所具有的特征的細胞，這樣，如果待測細胞被認為是一種ESCC細胞，那么對應的細胞可以是例如正常的食道上皮細胞。
本發(fā)明中的方法在實踐的時候需要的樣本包括待測細胞，或者是待測細胞的抽提物，其含有所述細胞的核酸分子，特別是基因組DNA，它們包括所有或者部分用來檢測甲基化狀態(tài)的基因的5’端調(diào)控區(qū)域的CpG島。一般地，待測細胞是那些被懷疑已經(jīng)失去生長控制的細胞，比如被懷疑具有損傷的活組織檢查樣本，或者是與惡化前或者惡化以后的細胞接近的細胞或者是曾經(jīng)與之接近的細胞，如從一個被懷疑是損傷部位的周圍一塊地方或者幾塊地方取下來的細胞樣本，這樣的待測細胞可以提供例如外科手術(shù)需要進行到什么程度的信息，或者是一些從外科手術(shù)邊緣收集的細胞樣本，這樣的待測細胞可以用于檢測癌癥是否已經(jīng)完全摘除，或者是檢測癌癥是否已經(jīng)重生。
根據(jù)本發(fā)明的方法研究的待測細胞也可以是來自于生物體并進行了培養(yǎng)的原代細胞，其目的可以是例如為了建立具有實質(zhì)上和建立培養(yǎng)物的細胞來源一樣的特性的原代細胞培養(yǎng)物，或者是出于為了能夠重新施用于生物體而治療和/或擴增細胞的目的。舉個例子，食道上皮細胞可以從一個患有ESCC的病人的身上獲得，其中所述細胞的一個或者更多個基因的表達表現(xiàn)出與癌癥相關(guān)的甲基化沉默。這些培養(yǎng)中的細胞可以用一種或者更多種試劑處理，以檢測這些試劑使沉默的基因恢復表達的能力，進而提供一種鑒定可以用于治療該癌癥病人或者另外一個患有以一種或者更多種同樣的基因的甲基化沉默為特征的ESCC的病人的藥物的方法。
待測細胞可以用臨床上通常用來獲得含有細胞的樣本的任何方式從生物體上獲得。比如，待測細胞(或者含有這些待測細胞的樣本)可以通過活組織檢查程序獲得，例如對含有待測細胞的器官或者組織進行活體穿刺取樣。這樣，待測細胞就可以從各種樣本中獲取，如消化道樣本，胃腸道樣本，肝臟樣本，骨髓樣本，皮膚樣本，淋巴結(jié)樣本，腎臟樣本，肺樣本，肌肉樣本，骨樣本，腦樣本，或者類似的樣本。待測細胞也可以是一種生物液體的組分，比如，血液，淋巴，腦脊液，唾液，痰，糞便，尿，或者精液。如果合適的話，待測細胞也可以通過灌洗來得到，比如要從結(jié)腸，子宮，腹腔，或者類似的地方獲取樣品，或者可以通過抽吸來獲得，比如要獲得骨髓樣本。
本發(fā)明中的方法在實踐時也可以使用待測細胞的抽提物，其中所述抽提物包括待測細胞的核酸分子，特別是基因組DNA，其中的待測基因中包含全部或者部分CpG島。所述抽提物可以是粗抽提物，包括例如含有待測細胞的組織的凍溶樣本；也可以包括部分提純的基因組DNA，其可能含有例如核基質(zhì)的成分；或者可以包括基本純化的基因組DNA，其可以是例如用蛋白酶處理和乙醇沉淀后得到的。在某些具體實施方案中，待測細胞還可以是封存在石蠟中的組織切片樣本的成分。
由于表觀遺傳學沉默包括甲基化沉默，因此用來鑒定細胞是否表現(xiàn)出或者易于表現(xiàn)出生長失控的方法可以通過檢測細胞中一個或者多個目標基因的甲基化來實施。基因的CpG島中的CpG二核苷酸的甲基化可以通過各種各樣已知的檢測核酸分子甲基化的方法來檢測。這樣的方法包括讓基因與一種或者一系列可以選擇性的修飾非甲基化的胞嘧啶殘基或者是甲基化的胞嘧啶殘基但不會對兩者均起作用的化學試劑接觸，這樣甲基化修飾的存在與否就可以被檢測；將基因序列與一種甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶接觸，這種限制性內(nèi)切酶的識別位點中含有CpG二核苷酸，然后就可以用這種內(nèi)切酶來剪切含有或者缺乏甲基化胞嘧啶殘基的CpG位點，但不能夠在兩種情況下都能夠剪切，這樣這些序列的剪切是否發(fā)生就可以被檢測到；或者將包含基因的核酸分子與能夠與該基因序列選擇性雜交的寡聚核苷酸探針，引物或者擴增引物對接觸，這樣也可以用來確定是否有CpG甲基化的存在。這里提供了運用這些方法的一些例子，并且這些方法的一些修改和變動也本技術(shù)領(lǐng)域是已知的。
目標基因的甲基化可以這樣來檢測，例如，將含有包含該基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，這種對甲基化敏感的內(nèi)切酶在含有其胞嘧啶殘基被甲基化的CpG二核苷酸的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識別位點上剪切，這樣，該核酸分子的剪切就可以作為指示甲基化，也就是待測細胞中這個基因甲基化沉默的標志。甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶是眾所周知的，例如有Acc III，Ban I，BstNI，Msp I和Xma I。作為選擇或者作為補充，甲基化沉默也可以這樣來檢測，將包含著含有基因的核酸分子的5′端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，這種內(nèi)切酶在含有其胞嘧啶殘基被甲基化的CpG二核苷酸的5′調(diào)控區(qū)內(nèi)的識別位點處剪切，倘若CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基被去甲基化的話，這樣核酸分子沒有發(fā)生剪切便是待測細胞中該基因甲基化沉默的指示。這樣的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶的例子是Acc II，Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II，或者Not I。
檢測包含目標基因序列的核酸分子被甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶剪切的發(fā)生與否可以通過任何一種有效的檢測多聚核苷酸序列長度或者連貫性的方法來實現(xiàn)。比如，目標基因序列的斷裂可以通過Southern印跡分析來確定，這種方法允許對剪切位點進行作圖，或者用其他電泳方法或者色譜方法，這些方法可以基于相對大小，電荷，或者是二者的組合來分離核酸分子。目標基因的剪切還可以通過寡聚核苷酸連接分析來檢測，其中，在核酸分子與限制性內(nèi)切酶接觸之后，設計有兩個寡聚核苷酸，第一個寡聚核苷酸與限制性內(nèi)切酶剪切位點上游且相鄰的位置選擇性雜交，第二個寡聚核苷酸與限制性內(nèi)切酶剪切位點的下游且相鄰的位置選擇性雜交，然后將這兩個寡聚核苷酸與目標基因接觸，并進一步與連接酶接觸，如果沒有剪切發(fā)生，那么兩個相鄰的寡聚核苷酸分子就可以被連接到一起，而在剪切發(fā)生的情況下，連接不發(fā)生。通過測定連接反應之后的寡聚核苷酸分子的大小或者是其他參數(shù)，被連接的寡聚核苷酸分子就會與沒有連接的寡聚核苷酸分子區(qū)別開來，因此也就提供了一種指示限制性內(nèi)切酶活性的方法。
基因的甲基化沉默也可以通過將包含待測細胞基因的核酸分子的5’端調(diào)控區(qū)域與可以選擇性的修飾非甲基化或者甲基化的胞嘧啶殘基的化學試劑接觸，然后檢測這樣接觸之后的產(chǎn)物，其中這種產(chǎn)物就是指示該基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基是否甲基化的標記，這樣也就達到了檢測待測細胞中基因的甲基化沉默的目的。舉個例子，這種產(chǎn)物可以通過電泳方法，色譜方法，質(zhì)譜方法，或者是這些方法的組合來檢測。
在這種實施方案的一個方面，用可以修飾胞嘧啶殘基但卻不能夠修飾甲基化的胞嘧啶殘基的肼與基因接觸，然后再將經(jīng)過肼處理的基因序列與一種可以在被肼處理的胞嘧啶殘基處剪切核酸分子的試劑接觸，比如哌啶，這樣就會產(chǎn)生包括片斷的產(chǎn)物。根據(jù)分子量來分離這些片斷，例如可以利用電泳方法，色譜方法，或者質(zhì)譜方法來分離，然后再與經(jīng)過相同處理的對應的非甲基化的基因序列的分離模式比對，待測基因上在某些位置出現(xiàn)的缺口就說明這個基因含有甲基化的胞嘧啶殘基。這樣，缺口的存在就是待測細胞中目標基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基甲基化的一個指示。
在另外一個方面，含有目標基因的核酸分子與含有亞硫酸氫根離子的化學試劑接觸，比如亞硫酸氫鈉，它可以將沒有甲基化的胞嘧啶殘基轉(zhuǎn)變成亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基，然后再將經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理過的基因序列暴露在堿性環(huán)境中，這樣亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基又被轉(zhuǎn)變成尿嘧啶殘基。亞硫酸氫鈉可以快速地與胞嘧啶的5，6-雙鍵反應(但與甲基化的胞嘧啶反應很慢)，形成磺化胞嘧啶反應中間產(chǎn)物，這種中間產(chǎn)物非常易于進行脫氨反應，而形成磺化尿嘧啶。這樣，如果將磺化尿嘧啶暴露于堿性環(huán)境中就可以去除磺基，結(jié)果形成尿嘧啶。然后這些DNA分子又可以被擴增，例如通過PCR反應進行擴增，接著再測序以確定所有CpG位點的甲基化狀態(tài)。在PCR反應中，Taq聚合酶將尿嘧啶識別作胸腺嘧啶，結(jié)果PCR的產(chǎn)物只有在起始模板DNA含有5-甲基化胞嘧啶的位置才有胞嘧啶。通過比較待測細胞中被亞硫酸氫根離子處理過的基因序列與經(jīng)過相同處理的對應的沒有甲基化的基因序列之間的尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布，檢測到待測細胞中基因的尿嘧啶殘基數(shù)量或者分布的減少就說明待測細胞中目標基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基上發(fā)生了甲基化。尿嘧啶的數(shù)量或者分布也可以通過將經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理，再暴露在堿性環(huán)境中的目標基因序列與可以選擇性的與含有或者缺少尿嘧啶殘基的目標基因的核苷酸序列雜交的寡聚核苷酸接觸，然后檢測與寡聚核苷酸分子的選擇性雜交(或者是沒有雜交發(fā)生)。
在這里提到的“選擇性的雜交”或者“選擇性地進行雜交”或者“特異性雜交”是指兩個核酸分子在一般嚴緊或者高度嚴緊的條件下發(fā)生穩(wěn)定的相互作用。這樣，選擇性雜交比較偏向于在寡聚核苷酸和目標核酸分子雜交，而基本上不在寡聚核苷酸和非目標核酸分子的核酸分子之間發(fā)生，這不包括那些編碼一個基因家族中相關(guān)卻不同的成員的核酸分子。一般地，可以用作與目標核酸分子選擇性雜交的探針或者引物的寡聚核苷酸在長度上至少有大約12到15個核苷酸，一般是大約18到20核苷酸長度，常用的是至少21到25個核苷酸長度，特殊情況下會是26到35個核苷酸長度或者更長。在實踐本發(fā)明的方法時所用到的寡聚核苷酸包括那些在SEQ ID NOS1-127中所列的寡聚核苷酸，它們可被用來檢測表2中所列的基因。用于實踐本發(fā)明的方法的其它寡聚核苷酸可以基于本公開內(nèi)容和通過表2所列的GenBank注冊號來獲取的核苷酸序列來設計。
適合于選擇性雜交的條件可以通過經(jīng)驗來確定，或者可以估計，比如，基于要雜交的寡聚核苷酸和目標核酸分子的相對GCAT(或者GCAU)含量，雜交寡聚核苷酸的長度，雜交的寡聚核苷酸分子和目標序列之間的錯配數(shù)目(如果有的話)(參見，比如Sambrook等，″Molecular CloningA laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress 1989))。這樣，被用來獲得特定的嚴緊水平的雜交條件會隨著雜交的核酸分子的性質(zhì)而改變。需要額外考慮的是核酸分子是否被固定化了，比如固定在濾膜上。逐步增高的嚴緊條件的例子如下2XSSC/0.1％SDS在大約室溫條件下(雜交條件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大約室溫條件下(低嚴緊條件)；0.2X SSC/0.1％SDS在大約42攝氏度條件下(一般嚴緊條件)；0.1X SSC在大約62攝氏度條件下(高嚴緊條件)。雜交和/或洗滌可以在其中一種條件下進行，比如高嚴緊條件，或者其中的每一個條件都被使用，例如，每個條件進行10到15分鐘，按上面列出的順序，重復列出的這些步驟的任何一個或者所有的步驟。
寡聚核苷酸與目標基因(比如表2中所列基因)的選擇性雜交可以通過讓寡聚核苷酸帶上可檢測的標記這樣的方法來檢測。這些可檢測的標記可以是任何一種能夠方便地與寡聚核苷酸連接的分子，而且還可以用容易獲得的儀器來檢測。比如，這種可檢測的標記可以是一種熒光化合物比如Cy3，Cy5，F(xiàn)am，熒光黃，羅丹明，或者綠色熒光蛋白，或者是其增強型或者改進型；放射性原子核如硫-35，technicium-99，磷-32，氘或者碘-125；順磁旋轉(zhuǎn)標記如碳-13，Gd-17，Mn-55，Dy-162，Cr-52，或者Fe-52；發(fā)光物質(zhì)如發(fā)光蛋白；化學發(fā)光物質(zhì)；金屬螯合劑；一種酶如熒光素酶或者β-半乳糖苷酶，或者是酶底物；或者是一種受體或受體的配體，比如生物素。檢測可檢測標記的方法是根據(jù)標記的性質(zhì)來選擇的，同樣將標記連接到寡聚核苷酸上的方法也是如此(參見，比如，Hermanson，″Bioconjugate Techniques″(Academic Press 1996)，其在此被整入以供參考)。
舉個例子，選擇性雜交的檢測也可以利用寡聚核苷酸作為引物延伸反應的底物，進一步讓樣本在足夠使引物延伸反應進行的條件下與脫氧核糖核苷酸(dNTPs)接觸，如果需要的話，這些脫氧核糖核苷酸可以包括可檢測的dNTP(比如一種熒光標記的dNTP，一種地高辛配體標記的dNTP，或者是一種生物素標記的dNTP)，另外還要有DNA依賴型的DNA聚合酶，接著就可以檢測引物延伸反應的產(chǎn)物。進行引物延伸反應的條件在本領(lǐng)域是已知的(參見，比如，Sambrook等，如上，1989)。
包含目標基因序列的核酸分子經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理，接著暴露在堿性環(huán)境中之后，檢測其中尿嘧啶的數(shù)量或者分布也可以通過擴增反應比如PCR來實現(xiàn)。擴增反應是在適合于擴增引物對的正向引物和反向引物與目標核酸分子選擇性雜交的條件下進行的。一般地，反應是在含水緩沖溶液中進行的，pH在7～9之間，常常pH是大約8。另外，反應一般在引物的摩爾量遠遠超過目標核酸分子的情況下進行的，比如引物基因組DNA的摩爾比例約為100∶1。當樣本中目標核酸分子的量不知道的時候，比如在一個診斷程序中用到的生物樣本，這時就可以用一定范圍的引物量加到樣本中做平行實驗，雖然一般即使很少量的引物加到樣本中也可以形成足夠的摩爾逾量而使得這樣的擴增反應可以繼續(xù)。
足量的三磷酸脫氧核糖核苷酸dATP，dCTP，dGTP和dTTP可以單獨也可以混合在一起加到合成反應混合物中，如果混在一起加入的話，還可以進一步包括引物，最后溶液需要加熱到90～100攝氏度，維持大約1到10分鐘，優(yōu)選是1到4分鐘。經(jīng)過這段加熱期之后，溶液需要冷卻到室溫，這樣更有利于引物的雜交。往冷卻下來的混合物中加入影響引物延伸反應的合適的試劑，一般是一種聚合酶，接著反應就可以在這里公開的條件下(參見實施例1)進行或者是按照本領(lǐng)域已知的條件進行。如果聚合酶是熱穩(wěn)定的，那么它還可以與其它試劑一起被加入。聚合酶可以是任何一種用來指導引物延伸產(chǎn)物的合成的酶，比如包括E.coli DNA聚合酶I，E.coli DNA聚合酶I的Klenow片斷，T4 DNA聚合酶，其它可獲得的DNA聚合酶，聚合酶的突變蛋白，反轉(zhuǎn)錄酶，或者其他酶，包括熱穩(wěn)定酶，它們在本領(lǐng)域都是熟知的而且可以通過商業(yè)渠道獲得。擴增反應產(chǎn)物是否甲基化可以通過測序方法，寡聚物限制性分析(Saiki等，BioTechnology 31008-1012，1985)，等位基因特異性寡聚核苷酸探針分析(Conner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80278，1983)，寡聚核苷酸連接反應分析(Landegren等，Science 2411077，1988)，以及類似的方法(也請參見，Landegren等，Science 242229-237，1988)來檢測。
在一種實施方案中，擴增反應是通過將目標基因序列(比如列在表2，5或者6中的基因)在適合于擴增的條件下與包括正向引物和反向引物的擴增引物對接觸來進行的，其中該引物對中至少有一個引物包含可以與含有尿嘧啶殘基的目標基因序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，因而擴增產(chǎn)物的生成就是待測細胞中目標基因的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化的標記。在另外一種實施方案中，擴增反應是通過將目標基因序列在適合于擴增的條件下與包括正向引物和反向引物的擴增引物對接觸來進行的，但其中該引物對的兩個引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的目標基因序列選擇性雜交，而不與含有尿嘧啶殘基的目標基因序列雜交，因而擴增反應產(chǎn)物的生成就是待測細胞中目標基因的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基非甲基化的標記。
在又另外一個實施方案中，甲基化特異性的擴增反應比如甲基化特異性PCR(MSP)可以單獨使用或者與亞硫酸氫鹽處理組合使用，從而檢測核酸分子的甲基化狀態(tài)(參見美國專利號6,265,171；6,200,756；和6,017,704，其中每一篇都在此整入以供參考；也可參見實施例1)。MSP是一種特別靈敏的方法，可以用來檢測數(shù)目很少的甲基化等位基因，而且只需要使用很少量的核酸樣本，包括一些臘封的材料，該方法還可以方便地在多重分析中采用，比如包括，在單個樣本中同時檢測甲基化和非甲基化產(chǎn)物，這樣就可以提供一個內(nèi)標。
在MSP反應中使用的擴增引物對經(jīng)設計之后可以特異性地區(qū)分未經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的或未經(jīng)修飾的DNA，甲基化的和非甲基化的DNA。針對非甲基化DNA的MSP引物對(非甲基化特異性引物對)一般在3’-CpG對中具有胸腺嘧啶殘基以區(qū)別于甲基化DNA中保留的胞嘧啶，對于反義引物則采用互補序列來設計。MSP引物對的序列中常常含有相對少量的胞嘧啶或者鳥嘌呤殘基，這是由于在正義(正向)引物中缺乏胞嘧啶，而在反義(反向)引物中缺乏鳥嘌呤所致；胞嘧啶被修飾之后成為尿嘧啶，而尿嘧啶在擴增產(chǎn)物中是作為胸腺嘧啶來擴增的。MSP非甲基化特異性引物對和MSP甲基化特異性引物對都可以基于基因的核苷酸序列來設計，這些基因如表2中所列的注有GenBank注冊號的各種基因，這些引物對包括用來擴增表2中所列的甲基化或非甲基化基因的甲基化特異性或者非甲基化特異性引物對，比如，如SEQ ID NOS1和2所述的ApoD甲基化特異性引物對，如SEQ ID NOS3和4所述的ApoD非甲基化特異性引物對(也請參見，表4；SEQ ID NOS65至127，公開了針對指定基因的甲基化特異性引物對，包括用于亞硫酸氫鹽處理之后測序的引物)。
因此，一方面，MSP被用來檢測經(jīng)亞硫酸氫根離子處理并接著進行堿處理的目標基因中的尿嘧啶殘基的數(shù)量和分布。這樣的方法可以這樣來實施，將基因序列與第一引物對和第二引物對在適合于擴增的條件下接觸，其中第一擴增引物對含有一個正向引物和一個反向引物，該第一引物對中的至少一個引物包含可以與含有尿嘧啶殘基的目標基因的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，而第二擴增引物對含有一個正向引物和一個反向引物，該第二引物對的兩個引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的目標基因選擇性雜交，而不與含有尿嘧啶殘基的目標基因序列雜交，這樣由第一引物對生成的擴增產(chǎn)物(如果有的話)會有一個第一長度，而由第二引物對生成的擴增產(chǎn)物(如果有的話)會有一個第二長度，其不同于第一長度，因此擴增產(chǎn)物的長度就是一種指示尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布的標記，這樣，待測細胞中目標基因的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化也就可以通過這個方法來檢測。
尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布也可以這樣來檢測，將基因的5’端調(diào)控區(qū)域與第一引物對和第二引物對在適合于擴增的條件下接觸，其中第一擴增引物對含有一個正向引物和一個反向引物，該第一引物對中的至少一個引物包含可以與含有尿嘧啶殘基的基因5’端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，而第二擴增引物對含有一個正向引物和一個反向引物，該第二引物對的兩個引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的基因5’端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交，而不與含有尿嘧啶殘基的基因5’端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列雜交，這樣由第一引物對生成的擴增產(chǎn)物(如果有的話)會有一個第一長度，而由第二引物對生成的擴增產(chǎn)物(如果有的話)會有一個第二長度，其不同于第一長度，因此擴增產(chǎn)物的長度就是一種指示尿嘧啶殘基并因而指示基因5’端調(diào)控區(qū)域的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化的標記，由此可以檢測待測細胞中基因的甲基化沉默。
在表現(xiàn)出或者被懷疑表現(xiàn)出失去控制的生長的細胞中的基因的甲基化沉默(比如，一種癌癥相關(guān)的基因)的檢測也可以這樣進行，將待測細胞與一種脫甲基化試劑接觸，然后再與沒有用脫甲基化試劑接觸過的待測細胞中RNA的表達水平比較，檢測由這個基因編碼的RNA的表達量增加。這樣的方法可以進一步包括檢測表現(xiàn)出正常生長的對應細胞或者對應細胞的抽提物中基因的5’端調(diào)控區(qū)域的CpG島中的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基的甲基化(如果有的話)。脫甲基化試劑可以是甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑如5Aza-dC。RNA表達量的增加可以用任何一種檢測RNA的方法來檢測，例如包括RNA點雜交分析，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應分析，或者與核苷酸序列陣列的選擇性雜交，如在此所公開的。相應地，本發(fā)明的這些方法也可以以高通量的形式進行，其中待測細胞或者待測細胞的抽提物包括多份待測細胞的一份或者待測細胞的抽提物，或者是其組合；所述的多份待測細胞中的每一份，或者所述的多份待測細胞的抽提物可以是相同的或者不同的，或者是其組合。
在將本發(fā)明的方法應用于高通量的形式時，待測細胞或者待測細胞的抽提物可以被安排在一個陣列上，這種陣列可以是一種可追蹤的(addressable)陣列，可以在一個固體支持物如微芯片，玻璃板，或者玻璃珠上，細胞(或者抽提物)可以順序地或者是平行地與寡聚核苷酸探針或者引物(或者引物對)接觸，如在此所公開的。安排在陣列中的樣本或者是安排成其它可再現(xiàn)形式的樣本可以被指定地址(即，陣列上的位置)，這樣就利于確定樣本的來源。將樣本排列成陣列特別是可尋址陣列的另外一個好處是可以用自動化系統(tǒng)對一個或者多個樣本在不同時間增加或者去除試劑，或者是為特定的樣本加入不同的試劑。除了可以同時檢測多個樣本的好處之外，這樣的高通量分析還能夠提供了檢測單個樣本的兩份等份，三份等份，或者更多等份的手段，這樣可以增加獲得的結(jié)果的合理性，而且還可以在和待測樣本同樣的條件下檢測對照樣本，從而為比較不同分析的結(jié)果提供了內(nèi)標。方便的是，陣列上某個位置的細胞或者抽提物可以與兩種或者更多種寡聚核苷酸探針或者引物(或者引物對)接觸，其中所述寡聚核苷酸是被不同地標記的或者是包括產(chǎn)生可區(qū)別的產(chǎn)物的反應，從而提供了一種進行多重分析的手段。這樣的分析可以允許檢測一個或者多個，尤其是2，3，4，5，10，15，20或者更多個基因，以鑒定待測細胞中的表觀遺傳學沉默基因。
本發(fā)明也提供用作鑒定表觀遺傳學沉默基因(或者鑒定這些基因的缺乏)的探針或者引物的寡聚核苷酸。在這里被使用的術(shù)語“寡聚核苷酸”，“多聚核苷酸”或者“核酸分子”是指一段由兩個或者更多脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸組成，由磷脂鍵連接起來的序列。這里提到的“基因”是指包含在基因組中的一段多聚核苷酸序列。然而，應該認識到，包含基因的一部分的核酸分子可以從細胞中分離出來或者作為基因組DNA被研究，比如通過雜交反應或者PCR反應。因此，在整個基因組中，也許并不清楚某個基因在哪一個特定的核苷酸位置起始或者結(jié)束，對于本發(fā)明的目的來說，對于在此被鑒定和/或研究的基因，基因可以被認為是不連續(xù)的(discrete)核酸分子，它至少包括那些GenBank注冊號列在表2，5和6中的核苷酸序列。
為了討論的方便，這里用到的術(shù)語“寡聚核苷酸”是指用作探針或者引物的多聚核苷酸，而使用更加廣泛的術(shù)語“多聚核苷酸”或者“核酸分子”則是包含了具有兩個或者多個核苷酸的任何序列，包括寡聚核苷酸。另外，術(shù)語“核苷酸序列”是指存在于陣列上的分子。因此，應該認識到，這里使用的各種術(shù)語可以方便地區(qū)分不同的核酸分子。因此，這些術(shù)語包括了RNA和DNA，其可以是一個基因或者是基因的一部分，cDNA，合成的多聚脫氧核糖核酸序列，或者類似的分子。一般地，寡聚核苷酸或者多聚核苷酸可以是單鏈也可以是雙鏈，還可以是DNA/RNA雜交分子，然而應該注意的是，用來作為探針或者引物的雙鏈寡聚核苷酸的兩條鏈在使用的時候需要分開，比如通過加熱含有寡聚核苷酸的溶液到高于特定寡聚核苷酸的熔點。
這里使用的術(shù)語“寡聚核苷酸”，“多聚核苷酸”和類似物包括自然發(fā)生的核酸分子，這些核酸分子可以從細胞中分離，也可以是比如通過限制性內(nèi)切酶消化之后得到的片斷，還可以是合成的分子，比如這些分子可以通過化學合成的方法或者酶學方法如PCR來制備。在各種各樣的實施方案中，本發(fā)明的寡聚核苷酸或者多聚核苷酸可以包含核苷或者核苷酸類似物，或者其骨架鍵不是磷酯鍵，比如是硫酯鍵，硫代磷酸鍵，類似肽鍵的鍵或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的能夠連接核苷生成合成的多聚核苷酸的其它任何化學鍵(參見，比如，Tam等，Nucl.Acids Res.22977-986，1994；Ecker和Crooke，BioTechnology13351-360，1995，每個文獻在此整入以供參考)。非自然發(fā)生的核苷類似物或者連接核苷或類似物的非自然發(fā)生的連接鍵的整入在該多聚核苷酸要暴露于可能含有核酸水解活性的環(huán)境中時特別有用，這些環(huán)境包括例如組織培養(yǎng)液，細胞或者存活個體，因為這種被修飾的多聚核苷酸可以被設計成對于降解較不敏感(假如需要的話，也可以設計成對于降解更加敏感)。
一般地，組成多聚核苷酸的核苷酸是自然發(fā)生的脫氧核糖核苷酸，比如腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤或者胸腺嘧啶連接到2’-脫氧核糖上，或者是核糖核苷酸，比如腺嘌呤，胞嘧啶，鳥嘌呤或者尿嘧啶連接到核糖上。盡管如此，多聚核苷酸(或者寡聚核苷酸)也可以包含核苷酸類似物，包括非自然發(fā)生的合成的核苷酸或者被修飾過的自然發(fā)生的核苷酸。這些核苷酸類似物在本領(lǐng)域是已知的，而且可以通過商業(yè)渠道獲得，含有這些核苷酸類似物的多聚核苷酸也是如此(Lin等，Nucl.Acids Res.225220-5234，1994；Jellinek等，Biochemistry3411363-11372，1995；Pagratis等，Nature Biotechnol.1568-73，1997，每篇文獻都在此整入以供參考)。
包含自然發(fā)生的核苷酸和磷酯鍵的多聚核苷酸可以通過化學合成來制備或者用合適的多聚核苷酸作為模板通過DNA重組方法來制備。與此相比，包含核苷酸類似物或者非磷酯鍵的共價鍵的多聚核苷酸一般都通過化學合成的方法來制備，盡管某些酶如T7聚合酶可以將某些類型的核苷酸類似物整合到多聚核苷酸中，并因而被用來由一個合適的模板來重組合成這樣一段多聚核苷酸(Jellinek等，如上，1995)。這樣，多聚核苷酸可以通過例如傳統(tǒng)的磷酸三酯方法和磷酸二酯方法的方法來制備，比如，包括例如使用二乙基磷酸脒的自動化方法(參見，Beaucage等，Tetrahedron Lett.，221859-1862，1981)，或者一種在被修飾的固體支持物上進行的寡聚核苷酸合成方法(參見美國專利號4,458,066)。
本發(fā)明的可以選擇性地與目標核酸分子雜交且可以作為檢測一個基因的表達和/或甲基化(或者甲基化缺乏；“非甲基化”)的試劑的寡聚核苷酸被設計成與目標基因上游(5’)或者下游(3’)大約2000個核苷酸之內(nèi)的核苷酸序列選擇性雜交，一般是在大約1000個核苷酸的區(qū)域內(nèi)，這些區(qū)域含有需要檢測胞嘧啶甲基化的CpG島，更常見的是在大約500個核苷酸內(nèi)的位點進行檢測。另外，本發(fā)明的寡聚核苷酸，或者對于本發(fā)明的方法有用的寡聚核苷酸，在長度上至少要有大約12個核苷酸，一般至少是大約14或15個核苷酸長度，通常是大約18到20個核苷酸長度，也可以是大約25，30，35或者更多的核苷酸，這樣它可以選擇性地與目標核酸分子雜交。需要注意的是，寡聚核苷酸的長度會部分地依賴于目標基因。比如，當目標基因是由含有相似性非常高的區(qū)域的緊密相關(guān)的基因組成的家族的一員時，使用更長的寡聚核苷酸可以保證其與目標基因的選擇性雜交，而最小化與相關(guān)基因序列的交互雜交，如果有的話。
本發(fā)明中的寡聚核苷酸被設計成與對應于基因組的基因座的雙鏈核酸分子的至少一條鏈基本互補(當間插序列要被擴增時，則是與雙鏈的每條鏈互補)，這些寡聚核苷酸被用于區(qū)分甲基化或者非甲基化的胞嘧啶殘基時，會包含一定量的鳥嘌呤和胞嘧啶，正如上述討論的一樣。本發(fā)明的寡聚核苷酸的實例如用于目標基因的核苷酸序列的RT-PCR的擴增引物對(參見表3；SEQ ID NOS7至64)；還有用于目標基因的核苷酸序列的甲基化特異性或者非甲基化特異性擴增的引物；或者用于亞硫酸氫鹽PCR的引物(參見表4；SEQ ID NOS65至127，甲基化特異性引物；SEQ ID NO.)。
因此，本發(fā)明提供選自SEQ ID NOS1至127中的任意一個的寡聚核苷酸，而且進一步提供多個這樣的寡聚核苷酸，其包括至少兩種(比如2，3，4或者更多種)列在SEQ ID NOS1至127中的寡聚核苷酸，其包括，例如，包含用作擴增引物對的至少兩種寡聚核苷酸的組合，其可以擴增列在表2中的ApoD基因的一部分，在某些情況下要依賴于例如目標序列是否甲基化。本發(fā)明還提供包括正向引物和反向引物的擴增引物對，特別是這樣的引物對，其含有的一個，特別是兩個寡聚核苷酸可以是一個引物對的正向引物，反向引物或者兩者，所述引物對特別是用來擴增表2中所列基因的一部分的引物對。在一個方面，本發(fā)明的擴增引物對可以用來特異性地擴增核酸分子的甲基化的5’端調(diào)控區(qū)域。另一方面，本發(fā)明的擴增引物對可以用來特異性地擴增核酸分子的非甲基化的5’端調(diào)控區(qū)域。
本發(fā)明還涉及試劑盒，其中包括至少一種分離的本發(fā)明的寡聚核苷酸，包括例如多種這樣的分離的寡聚核苷酸。在一種實施方案中，本發(fā)明的試劑盒的多種分離的寡聚核苷酸包括至少一個擴增引物對(即，一個正向引物和一個反向引物)，也可以包括多個擴增引物對，其包括例如在這里公開的擴增引物對。這樣，本發(fā)明的試劑盒可以包括，例如，一個或者多個甲基化特異性擴增引物對，非甲基化特異性擴增引物對，或者甲基化特異性引物對和非甲基化特異性引物對的組合，這種組合包含用來擴增特定基因的甲基化形式或者非甲基化形式的甲基化特異性引物對和非甲基化特異性引物對，所述特定基因已知或者被懷疑在一種或者多種類型的癌癥細胞中被甲基化沉默。
本發(fā)明的試劑盒可以進一步包含額外的試劑，它們是很有用的，例如，確保所述試劑盒中的寡聚核苷酸能夠有效使用。例如，當試劑盒含有一種或者多種甲基化特異性和/或非甲基化特異性擴增引物時，該試劑盒可以進一步包括例如可以被甲基化的或者非甲基化的對照寡聚核苷酸；一種或者更多種可以修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑，和/或一種或更多種用于進行擴增反應的試劑。如果試劑盒包含一種或者多種能夠與甲基化或者非甲基化基因序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，那么試劑盒還可以進一步包括，例如，甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明的試劑盒還可以包括至少第二引物對，它可以是但不一定是上述所列引物對中的一種，它可以用來進行例如巢式擴增反應。這些額外的引物對可以基于目標基因的擴增部位的期望序列，利用依據(jù)目標基因的相關(guān)GenBank注冊號所獲得的序列信息(參見表2)來設計。
在一種具體實施方案中，本發(fā)明的試劑盒含有一對甲基化特異性引物和一對非甲基化特異性引物，它們的特異性都是針對同一個目標基因，因而使用該試劑盒的用戶可以確定某個特定目標基因是否甲基化。在另外一種實施方案中，試劑盒含有多對這樣的甲基化特異性和非甲基化特異性引物，因而用戶就可以確定一個或者更多個目標基因的甲基化。例如，這樣的試劑盒中可以含有針對一個或者多個挑選出來的目標基因的甲基化特異性引物對和非甲基化特異性引物對，比如所述目標基因是ApoD基因，NU基因，CRIP1基因，或者其他列在表2中的基因，由此該試劑盒提供了用于確定一個或者多個被挑選出來的基因的5’調(diào)控區(qū)域是否甲基化的擴增引物對。這樣的試劑盒可以進一步含有引物對，該引物對包括能夠選擇性地與利用甲基化特異性或者非甲基化特異性的引物對產(chǎn)生的期望的擴增產(chǎn)物雜交的寡聚核苷酸，從而提供了用于進行巢式擴增反應的試劑。
本發(fā)明的試劑盒還可以包括一種能夠連接或者整合到試劑盒中的寡聚核苷酸上的可檢測的標記，或者多種不同的可檢測的標記，這樣用戶就可以根據(jù)需要為特定的應用選擇合適的標記，而且如有需要的話，還可以包括將可檢測標記連接或者整合到寡聚核苷酸上所需的試劑。作為選擇或者作為補充，試劑盒可以包含一種或者多種用于進行雜交反應的試劑，這樣選擇性雜交的條件就可以很快的獲得；和/或者可以包括一種或者多種標準核酸分子，例如含有甲基化胞嘧啶殘基的標準目標ApoD基因核苷酸序列，其對應于ApoD基因上寡聚核苷酸選擇性雜交的區(qū)域，或者所述的標準核酸分子是對應于目標序列的含有非甲基化胞嘧啶殘基的標準目標ApoD基因核苷酸序列，或者是二者的組合。這樣的標準具有數(shù)個優(yōu)點，包括，例如，可以確認用待測細胞或其抽提物進行的反應是否正確有效，或者可以用來比較不同時間檢測的樣本或者收集于不同來源的樣本。
當試劑盒含有一種或者多種用來進行引物延伸(或者擴增)反應的寡聚核苷酸，那么試劑盒可以進一步包括用于進行選擇性雜交反應的試劑，以使所述寡聚核苷酸可以作為延伸反應的底物；和/或一種或多種用于進行引物延伸(或擴增)反應的試劑，比如，dNTPs，其中的一種或者多種可以被可檢測的標記標記或者為了方便地連接上可檢測的標記而被修飾；一種或者一系列的多聚酶；和/或一種或多種標準目標核酸分子。如果本發(fā)明的試劑盒含有兩種或者更多種寡聚核苷酸(或者引物對)，例如在此例示的或者其它可以用于實踐本發(fā)明的方法的寡聚核苷酸，那么試劑盒可以提供一系列方便來源的試劑，有了這些，技術(shù)人員就可以根據(jù)自己的需要選擇一種或者多種寡聚核苷酸(或者引物對)。
本發(fā)明也涉及一種降低或者抑制表現(xiàn)出至少一種與癌癥相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄在表觀遺傳學上沉默的細胞的失控生長的方法。例如，這種方法可以通過恢復由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽在細胞中的表達來實施，這樣就可以降低或者抑制細胞的失控生長。在一種實施方案中，由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的表達可以通過將細胞與脫甲基化試劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或者二者的組合接觸來恢復。在這種實施方案的一方面，至少一個表觀遺傳學沉默基因包括甲基化沉默基因，而所述細胞與一種脫甲基化試劑比如5Aza-dC接觸，接觸的方法比如是向個體局部地或者系統(tǒng)地注射脫甲基化試劑，使得這些試劑能夠在體內(nèi)與細胞接觸。
恢復細胞中由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的表達的方法可以通過向細胞中引入編碼該多肽的多聚核苷酸來實現(xiàn)，然后這種多肽就可以通過引入的多聚核苷酸來表達。所述多聚核苷酸可以但并不一定包含在一個載體中，比如一個病毒載體中，它也可以被包裝起來，比如包裝在一種基質(zhì)中，如在脂質(zhì)體，微氣泡，或者類似物中。多聚核苷酸可以通過將其施用到體內(nèi)的方法來向細胞中引入這種多聚核苷酸，這樣它就可以接觸細胞，接著就可以被細胞攝入，編碼的多肽從而被表達。
在這樣的方法中應用的多聚核苷酸可以是種對應于表觀遺傳學沉默基因的任何多聚核苷酸。例如，細胞是ESCC細胞，表觀遺傳學沉默的基因可以是列在表2中的一種基因，那么多聚核苷酸就可以是一種編碼由該基因編碼的多肽的核酸分子，這樣的多聚核苷酸序列的GenBank注冊號在表2中指出。例如，表觀遺傳學沉默基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。
在一種具體實施方案中，細胞是ESCC細胞，表觀遺傳學沉默基因是甲基化沉默基因，比如，甲基化沉默基因是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。在另外一種實施方案中，細胞是ESCC細胞，表觀遺傳學沉默基因是腫瘤抑制基因，比如是ApoD，NU，或者CRIP-1基因；或者所述腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B，或者G蛋白信號通路受體2(RGS2)基因；或者所述ESCC細胞含有這些腫瘤抑制基因的組合。
本發(fā)明進一步涉及一種治療癌癥病人的方法，其中癌癥病人體內(nèi)的癌細胞含有至少一種表觀遺傳學沉默的基因。這樣的方法可以通過例如恢復病人體內(nèi)癌細胞中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因的表達來實現(xiàn)，進而達到治療癌癥病人的目的。至少一個表觀遺傳學沉默基因可以是甲基化沉默基因，而且還可以但并不一定是腫瘤抑制基因或者影響腫瘤抑制基因活性或者表達的基因。
在一種具體實施方案中，癌癥病人的癌細胞含有至少一種甲基化沉默的基因，而治療的方法包括將脫甲基化試劑以一定的量施于體內(nèi)以期恢復體內(nèi)癌細胞中所述甲基化沉默基因的表達。在另外一種具體實施方案中，癌癥病人的癌細胞含有至少一種表觀遺傳學沉默的基因，而治療的方法包括將至少一種編碼由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸在足夠使所述的至少一種多肽在病人的癌細胞中表達的條件下施于病人體內(nèi)。所述的多聚核苷酸可以包含在一個載體比如病毒載體中；和/或也可以被包裝在基質(zhì)比如脂質(zhì)體或者微氣泡中。
根據(jù)本發(fā)明的方法來治療的癌癥可以是任何一種涉及含有至少一種與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因的癌細胞的癌癥，包括，例如，癌(carcinoma)或者肉瘤(sarcoma)。在一種具體實施方案中，癌癥是食道鱗片狀細胞癌，而表觀遺傳學沉默基因包括在表2中列出的一種或多種基因。例如，所述表觀遺傳學沉默基因可以是ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcl d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。一方面，表觀遺傳學沉默基因包括至少一種甲基化沉默基因，比如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。在另一方面，表觀遺傳學沉默基因包括至少-種腫瘤抑制基因，比如ApoD，NU和/或者CRIP-1基因；或者神經(jīng)介肽B和/或RGS2基因；或者其組合。
本發(fā)明也涉及一種為治療癌癥病人選擇治療策略的方法。這樣的方法可以這樣來實施，例如，根據(jù)本發(fā)明在這里公開的基因組篩選方法確定至少一種與癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因；然后選擇出用于恢復所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因在病人的癌細胞中的表達的試劑。例如，這種試劑可以是一種編碼本來由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸，如編碼由在表2中所列的一種基因編碼的多肽的多聚核苷酸，所述的基因例如ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。
在一種具體實施方案中，被鑒定出來的表觀遺傳學沉默基因包括至少一種甲基化沉默基因，而選擇出來的試劑是用來恢復所述的至少一種甲基化沉默基因在癌細胞中的表達的試劑。在這個方法的一個方面，選擇出來的試劑包括編碼本來由所述甲基化沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸，所述的甲基化沉默基因例如ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者載脂蛋白C1基因。在這個方法的另外一個方面，被選擇出來的試劑包括一種脫甲基化試劑，比如5Aza-dC。
在另外一種實施方案中，鑒定出來的表觀遺傳學沉默基因包括至少一種腫瘤抑制基因，而選擇出來的試劑是用來恢復由所述的表觀遺傳學沉默的腫瘤抑制基因編碼的多肽在癌細胞中的表達的試劑。例如，所述腫瘤抑制基因可以是ApoD，NU或者CRIP-1基因；或者是神經(jīng)介肽B或RGS2基因；或者這些基因的組合，而選擇出來的藥物可以是編碼ApoD，NU，CRIP-1，神經(jīng)介肽B和/或RGS2基因產(chǎn)物的多聚核苷酸。
本發(fā)明也涉及一種治療患有食道鱗片狀細胞癌的病人的方法，其中與食道鱗片狀細胞癌相關(guān)的細胞中含有至少一種表觀遺傳學沉默的基因。這種方法可以這樣來實施，例如對病人施用能夠恢復所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因的表達的試劑，試劑的用量要足夠使得所述的表觀遺傳學沉默基因在與食道鱗片狀細胞癌相關(guān)的細胞中的表達恢復，這樣就可以達到治療病人的目的。在一種具體實施方案中，所述試劑包括編碼由所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸，特別地，所述多聚核苷酸包括在表2中所列基因的編碼序列，例如，所述多聚核苷酸包括下列基因的編碼序列ApoD，NU，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，IL-1R2，晶體蛋白α2，CLF-1，CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbcld1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，CRBP，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，或者載脂蛋白C1基因，或者這些基因的組合。
在另外一種具體實施方案中，至少一種表觀遺傳學沉默基因是甲基化沉默基因，而治療病人的藥物包括編碼由所述甲基化沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸。對于所述多聚核苷酸來說，可以包括下列基因的編碼序列，這些基因是ApoD，NU，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，或者是載脂蛋白C1基因，或者是這些基因的組合。在又另外一種實施方案中，至少一種表觀遺傳學沉默基因包括至少一種腫瘤抑制基因，而治療病人的方法包括恢復所述腫瘤抑制基因在病人的ESCC細胞中的表達。例如，所述的腫瘤抑制基因可以是ApoD，NU或者CRIP-1；或者可以是神經(jīng)介肽B或者RGS2基因；也可以是含有這些基因中的至少一種的組合；而所述試劑可以是編碼所述的表觀遺傳學沉默的腫瘤抑制基因的一種或者多種的多聚核苷酸。在本發(fā)明的方法中使用的試劑可以通過局部地或者系統(tǒng)地施于患者，這樣試劑就可以在體內(nèi)與ESCC細胞接觸。
細胞中一種或者多種基因的甲基化轉(zhuǎn)錄沉默導致細胞中缺乏這些基因的產(chǎn)物，因此，便出現(xiàn)了與編碼基因的產(chǎn)物缺乏相關(guān)的功能丟失。例如，本來與細胞生長控制順式相關(guān)的ApoD基因的表觀遺傳學沉默導致該基因的功能喪失，結(jié)果細胞生長失控。因此，本發(fā)明的方法是基于向由于基因表達發(fā)生表觀遺傳學沉默特別是甲基化沉默而導致生長失控的細胞提供由所述表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽，由此恢復細胞的受控生長。正如在這里公開的，可以直接向細胞提供所述多肽，可以向細胞中引入編碼所述多肽的外源多聚核苷酸并讓其表達，或者恢復細胞中內(nèi)源的甲基化沉默基因的表達。通過對表現(xiàn)出生長失控的細胞進行所述多肽的恢復，一些與生長失控相關(guān)的特征，比如包括在軟瓊脂中生長的能力，缺乏接觸生長抑制，或者對細胞程序性死亡的抗性都被減輕了。
一種或者多種甲基化沉默基因例如表2所列基因的一種或者多種的表達恢復，可以通過將細胞與一種脫甲基化試劑比如5Aza-dC接觸來完成，5Aza-dC可以在細胞復制的過程中整合到基因中，結(jié)果子代細胞就含有非甲基化的基因，這樣就可以被轉(zhuǎn)錄了。如果需要的話，在將試劑施用于對象之前，可以將來自對象的目標細胞樣本(或者對應于目標細胞的細胞)在培養(yǎng)基中與所述的脫甲基化試劑接觸，以確定或者驗證提供的脫甲基化試劑的量可以足夠保證目標基因的去甲基化，而對細胞又沒有毒性。這些在培養(yǎng)基中被接觸的細胞一般是所述對象的細胞，其在向所述對象施用脫甲基化試劑之前被檢測，但這些細胞也可以是比如和所述對象體內(nèi)將要與脫甲基化試劑接觸的細胞同樣類型的已建立的細胞系的細胞，如ESCC細胞。根據(jù)本發(fā)明治療病人的方法可以進一步包括用本領(lǐng)域已知的用于治療患有該特定類型癌癥的病人的試劑來治療病人，或者是一些和本方法聯(lián)合使用時有新的作用的試劑。
具有甲基化基因表達沉默的細胞一般是通過將試劑施用到體內(nèi)的方法使之可以在體內(nèi)與去甲基化試劑接觸。如果方便的話，脫甲基化試劑可以通過下列方法引入體內(nèi)，比如在體內(nèi)表現(xiàn)出生長失控的細胞的位置或者附近運用導管插入法，或者在其血液流向所述細胞所在位置的血管運用導管插入法。類似地，如果將要被治療的器官或者器官的一部分可以通過分路方法被分離，那么試劑可以通過分路器被施用，結(jié)果本質(zhì)上也可以將試劑施于含有所述細胞的位置。試劑也可以被系統(tǒng)地施用或者是通過其他路徑施用，如在這里所公開的，或者如本領(lǐng)域所知的。
表觀遺傳學沉默基因?qū)е缕淞拷档突蛘呷狈Φ亩嚯囊部梢酝ㄟ^向細胞中引入編碼這種多肽的多聚核苷酸來向細胞提供，這樣這種多肽就可以在細胞中由該多聚核苷酸表達。因此，本發(fā)明提供了一種基因治療的方法。例如，如果細胞具有其ApoD基因的轉(zhuǎn)錄被甲基化沉默的特征，那么具有GenBank注冊號J0261(參見表2)所列的核苷酸序列的多聚核苷酸就可以引入目標細胞中。
除了編碼多肽的序列，所述多聚核苷酸還可以包括有效連接的(operatively linked)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，翻譯調(diào)控元件和類似的元件，所有這些可以形成一個裸露的DNA分子，可以包含在一個載體中，或者可以包裝在一種基質(zhì)比如脂質(zhì)體或者微氣泡中，它們可以幫助多聚核苷酸進入特定的細胞。在這里提到的術(shù)語“有效連接的”是指兩種或者更多種分子鄰近相連以至它們可以作為一個單位來看待，而且表現(xiàn)出的功能可以是其中一種或者所有分子的功能，或者這些功能的組合。例如，編碼ApoD多肽的多聚核苷酸可以與另外一個(或者更多)編碼序列有效連接，這樣由所述的有效連接的編碼多肽可以表達出嵌合多肽。所述的嵌合多肽可以是融合蛋白，其中兩種(或者更多種)被編碼的多肽被翻譯成一條多肽，即，通過肽鍵共價連接；或者可以被翻譯成兩個獨立的多肽，這些多肽被翻譯出來之后，可以彼此聯(lián)系形成一個穩(wěn)定的復合物。類似地，編碼需要的多肽的多聚核苷酸序列可以與調(diào)控元件有效連接，在這種情況中該調(diào)控元件可以將它的調(diào)控作用賦予該多聚核苷酸，其方式與這種調(diào)控元件調(diào)控細胞中與其正常相關(guān)的多聚核苷酸序列一樣。
融合蛋白常常表現(xiàn)出其中每個多肽組分的部分或者全部特性，因此可以用來在細胞中恢復基因的表達，還可以進一步提供其他的優(yōu)點。比如，融合蛋白可以包含由于其編碼基因的表觀遺傳學沉默而導致其量降低或者缺乏的多肽，這種多肽可以與一種細胞區(qū)室定位結(jié)構(gòu)域有效連接，這樣該融合蛋白在細胞中的表達或者向細胞中引入這種融合蛋白可以將編碼的多肽定位到特定的細胞內(nèi)區(qū)室中以發(fā)揮其活性，比如定位到細胞核。細胞區(qū)室定位結(jié)構(gòu)域已經(jīng)研究的很清楚了，比如包括質(zhì)膜定位結(jié)構(gòu)域，核定位信號，線粒體膜定位信號，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號和類似的結(jié)構(gòu)域，也包括可以指導多肽從細胞中分泌出來的信號肽(參見，比如，Hancock等，EMBO J.104033-4039，1991；Buss等，Mol.Cell.Biol.83960-3963，1988；美國專利號5,776,689，每篇文獻都在此整入以供參考文獻)。融合蛋白也可以包括所需要的多肽與起其它作用的肽有效連接，包括作為受體的配體的肽，用作確定多肽在細胞中的表達的標記的肽，或者是用于分離融合蛋白的肽，或者是任何其他感興趣的多肽或者肽，只要該融合蛋白具有所要的多肽的蛋白活性。肽標記比如多聚組氨酸標記肽，比如His-6，可以用一種二價陽離子比如鎳離子，鈷離子或者類似的離子來檢測；FLAG表位，可以用抗FLAG抗體來檢測(參見，比如，Hopp等，BioTechnology 61204(1988)；美國專利號5,011,912，每篇文獻都在此整入以供參考)；c-myc表位，可以用針對這種表位的特異性抗體來檢測；生物素，可以用鏈霉親和素或者親和素來檢測；谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，可以用谷胱甘肽來檢測，這些標記在本技術(shù)領(lǐng)域是已熟知的，它們?yōu)闄z測與其有效連接的多肽存在與否提供了一種方法。這些標記還提供了額外的好處，比如它們可以幫助分離與之有效連接的多肽，如果需要獲得基本純化的形式的多肽的話，這樣的多肽可以用于實踐本發(fā)明的方法。
編碼本來由表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的多聚核苷酸可以單獨使用，也可以包含在一個載體中，這可以輔助多聚核苷酸的操作，包括將所述多聚核苷酸引入到目標細胞中。載體可以是一個用來保存多聚核苷酸的克隆載體，也可以是一個表達載體，它除了包括多聚核苷酸，還含有對多聚核苷酸和被編碼的多肽在特定細胞中的表達有用的調(diào)控元件。一個表達載體可以含有，例如，維持編碼多聚核苷酸的轉(zhuǎn)錄所必需的表達元件，或者能夠在多聚核苷酸被克隆到載體之前就可以與該多聚核苷酸有效連接的調(diào)控元件。
一個表達載體(或者編碼所需多肽的多聚核苷酸)一般含有或者編碼一段啟動子序列，它可以為所述的編碼多聚核苷酸提供組成性的，或者如果需要的話，可以是可誘導的或者組織特異性的或者發(fā)育階段特異性的表達，還可以含有多聚腺嘌呤識別序列，核糖體識別位點或者內(nèi)部核糖體進入位點，或者其他調(diào)控元件，比如組織特異性的增強子。載體還可以包含在原核或者真核宿主系統(tǒng)中復制所需要的元件，或者是在兩種系統(tǒng)中都需要的元件，如果需要的話。這樣的載體包括質(zhì)粒載體和病毒載體比如噬菌體，桿狀病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒(lentivirus)，腺病毒，疫苗病毒，塞姆利基森林(semliki forest)病毒和腺相關(guān)病毒，這些病毒是已熟知的，而且也都可以通過商業(yè)渠道(Promega，Madison WI；Stratagene，La Jolla CA；GIBCO/BRL，Gaithersburg MD)來獲得，或者可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建(參見，比如，Meth.Enzymol.，第185卷，Goeddel，ed.(Academic Press，Inc.，1990)；Jolly，Canc.Gene Ther.151-64，1994；Flotte，J.Bioenerg.Biomemb.2537-42，1993；Kirshenbaum等，J.Clin.Invest.92381-387，1993；每篇文獻都在此整入以供參考)。
四環(huán)素(tet)誘導的啟動子對于控制編碼所需多肽的多聚核苷酸的表達特別有用。在四環(huán)素或者其類似物被施于含有與四環(huán)素誘導型啟動子有效連接的多聚核苷酸的個體之后，編碼的多肽就被誘導表達。多聚核苷酸也可以與組織特異性的調(diào)控元件有效連接，比如一種肝臟細胞特異性調(diào)控元件，如α-胎蛋白啟動子(Kanai等，Cancer Res.57461-465，1997；He等，J.Exp.Clin.Cancer Res.19183-187，2000)或者白蛋白啟動子(Power等，Biochem.Biophys.Res.Comm.2031447-1456，1994；Kuriyama等，Int.J.Cancer 71470-475，1997)；一種肌肉細胞特異性調(diào)控元件，比如肌球蛋白啟動子(Delvin等，J.Biol.Chem.26413896-13901，1989；Yan等，J.Biol.Chem.27617361-17366，2001)；一種前列腺細胞特異性調(diào)控元件，比如PSA啟動子(Schuur等，J.Biol.Chem.2717043-7051，1996；Latham等，Caner Res.60334-341，2000)；一種胰腺細胞特異性調(diào)控元件，比如彈性蛋白酶啟動子(Omitz等，Nature 313600-602，1985；Swift等，Genes Devel.3687-696，1989)；一種白細胞特異性調(diào)控元件，比如白細胞唾液酸蛋白(CD43)啟動子(Shelley等，Biochem.J.270569-576，1990；Kudo和Fukuda，J.Biol.Chem.27013298-13302，1995)；或者類似的啟動子，這樣多肽的表達就可以限制在個體內(nèi)特定的細胞中，或者限制在培養(yǎng)基如器官培養(yǎng)基中一個混合群體的細胞中的特定細胞中。調(diào)控元件，包括組織特異性元件，許多都是可以通過商業(yè)渠道獲得的，它們在本領(lǐng)域是已熟知的(參見，比如，InvivoGen；San Diego CA)。
病毒表達載體在將多聚核苷酸引入到細胞特別是個體內(nèi)的細胞特別有效。病毒載體所具有的優(yōu)勢是它們可以以相對高的效率來侵染寄主細胞，而且可以侵染特定的細胞類型。例如，編碼所需多肽的多聚核苷酸可以被克隆到桿狀病毒載體中，它然后可以用于侵染昆蟲宿主細胞，由此提供一種產(chǎn)生大量該被編碼的多肽的方法。病毒載體也可以來源于侵染感興趣的生物的細胞的病毒，這些生物細胞比如是脊椎動物宿主細胞如哺乳動物宿主細胞，鳥類宿主細胞或者魚類宿主細胞。在本發(fā)明的方法中，病毒載體在向目標細胞中引入多聚核苷酸方面特別有用。病毒載體還可以被發(fā)展以用于特定的宿主系統(tǒng)，特別是哺乳動物系統(tǒng)，這樣的病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒，其他慢病毒載體，如那些基于人類免疫缺乏綜合癥(HIV)的病毒，腺病毒載體，腺相關(guān)病毒載體，皰疹病毒載體，肝病毒載體，疫苗病毒載體，或者類似的病毒載體(參見Miller和Rosman，BioTechniques 7980-990，1992；Anderson等，Nature 39225-30 Suppl.，1998；Verma和Somia，Nature389239-242，1997；Wilson，New Engl.J.Med.3341185-1187(1996)，每篇文獻都在此整入以供參考)。
包含在載體之中的多聚核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法被引入到細胞中(Sambrook等，如上，1989；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，Baltimore，MD(1987，和1995年的增補材料)，每篇文獻都在此整入以供參考)。這樣的方法包括如轉(zhuǎn)染，脂轉(zhuǎn)染(lipofection)，微注射，電轉(zhuǎn)和用病毒載體侵染；還可以包括運用脂質(zhì)體，微乳劑或者類似物來引入，這些方法可以幫助多聚核苷酸導入細胞，還可以使多聚核苷酸在被導入細胞之前避免降解。一個特別有用的方法包括將多聚核苷酸整合到微氣泡中，然后可以注射到循環(huán)通路中?？梢苑胖靡粋€超聲源使得超聲可以傳遞到腫瘤處，正在腫瘤的位置循環(huán)的含有多聚核苷酸的微氣泡被超聲波打破，這樣就可以在癌癥部位提供這種多聚核苷酸。一種特定方法的選擇需要依據(jù)比如多聚核苷酸所要導入的細胞，還有細胞是否分離于培養(yǎng)基中，或者是在培養(yǎng)的組織或器官中，或者是在原位。
利用病毒載體的侵染來將多聚核苷酸導入細胞中的方法是非常有益的，它可以將核酸分子高效地導入到細胞中。而且，病毒一般都是非常特化的，可以根據(jù)其對一種或者幾種特定類型的細胞的侵染能力以及繁殖能力來挑選需要的載體。因此，它們的天然特異性可以將包含在載體中的核酸分子定向?qū)氲教囟愋偷募毎?。這樣，基于HIV的載體可以用于侵染T細胞，基于腺病毒的載體可以用于侵染例如呼吸道上皮細胞，基于皰疹病毒的載體可以用來侵染神經(jīng)元細胞，等等。其他載體如腺相關(guān)病毒可以有更加寬泛的宿主細胞范圍，因此可以用來侵染很多類型的細胞，盡管病毒或者非病毒載體也可以用特定的受體或者配體進行修飾，以通過受體介導的事件來改變其目標特異性。本發(fā)明的多聚核苷酸，或者含有多聚核苷酸的載體可以包含在細胞中，比如在宿主細胞中，這樣含有多聚核苷酸的載體便可以增殖，或者在輔助細胞中，這樣含有多聚核苷酸的病毒載體便可以組裝。所述多聚核苷酸可以暫時地存在于細胞中，也可以穩(wěn)定地存在，例如通過整合到細胞基因組中這樣的方法。
本發(fā)明的方法還可以通過直接將所需要的多肽導入到病人體內(nèi)表現(xiàn)出生長失控的細胞所在位置處來實施。所述多肽可以在產(chǎn)生后被分離，然后按照需要采用這里公開的方法制成配方，接著可以與細胞接觸使得所述多肽可以穿過目標細胞的細胞膜。如果所需的多肽與生物體的細胞接觸，那么這種多肽可以是融合蛋白，其中含有促進其穿過細胞膜的肽或者多肽組分，比如人類免疫系統(tǒng)缺乏綜合癥病毒(HIV)TAT蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域，而且還可以進一步包含與之有效連接的核定位結(jié)構(gòu)域。作為選擇，或者作為補充，所述多肽可以被包裝在基質(zhì)中以促進多肽進入細胞。
對于活體施用，用于實踐本發(fā)明的治療方法的試劑例如脫甲基化試劑，多聚核苷酸或者多肽一般被配制成適合于施用的組合物。因此，本發(fā)明提供含有用于恢復由于一種或者多種基因的甲基化轉(zhuǎn)錄沉默而導致生長失控的細胞的受控生長的試劑的組合物。這樣，這種試劑就可以用作治療患有與這種生長失控相關(guān)的病理癥狀的病人的藥物。
這樣的組合物一般包含對于形成配方和將試劑施用于個體可接受的載劑?？杀唤邮艿妮d劑在本領(lǐng)域是已知的，包括比如含水溶液如水或者生理緩沖鹽溶液，或者其他溶劑或媒介物如乙二醇，甘油，油類物質(zhì)如橄欖油或者可注射的有機酯?？杀唤邮艿妮d劑可以含有一些生理上能夠接受的化合物，其作用是例如穩(wěn)定或者增加結(jié)合物的吸收。這樣的生理上可以接受的化合物包括例如碳水化合物如葡萄糖，蔗糖或者葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸或者谷胱甘肽，螯合試劑，低分子量蛋白或者其他穩(wěn)定劑或賦形劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該知道，包括生理上可接受的化合物在內(nèi)的可接受載劑的選擇是依賴于比如治療試劑本身的物理化學性質(zhì)和施用該組合物的途徑，所述途徑可以是例如口服或者不經(jīng)腸胃的途徑，如靜脈內(nèi)施用并且是通過注射，插管，或者本領(lǐng)域已知的其他這樣的方法。所述藥物組合物還可以含有第二種試劑，比如診斷試劑，營養(yǎng)物質(zhì)，毒素，或者治療試劑，比如癌癥化療試劑。
所述試劑可以整合到一種膠囊材料中，比如在油水混合乳劑，微乳劑，微膠束，混合微膠束，脂質(zhì)體，微球體，微氣泡，或者其他聚合物基質(zhì)當中(參見，例如Gregoriadis，Liposome Technology，第1卷(CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L 1984)；Fraley等，Trends Biochem.Sci.，677(1981)，每篇文獻都在此整入以供參考)。脂質(zhì)體，例如由磷脂或者其他脂類組成的脂質(zhì)體，是沒有毒性的，生理上可接受的而且可代謝的載體，它們比較容易制作和施用?！半[形(Stealth)”脂質(zhì)體(參見，例如美國專利號5,882,679；5,395,619和5,225,212，每篇文獻都在此整入以供參考)就是這樣的膠囊材料的一個例子，其對于制備用于本發(fā)明的方法的組合物非常有用，而其他的“隱蔽(masked)”脂質(zhì)體也可以類似地被應用，這樣的脂質(zhì)體延長了治療試劑在循環(huán)中的保留時間。陽離子型脂質(zhì)體比如也可以用特異性的受體或者配體修飾(Morishita等，J.Clin.Invest.，912580-2585(1993)，這篇文獻在此整入以供參考)。另外，多聚核苷酸試劑可以利用比如腺病毒-多賴氨酸DNA復合物來導入到細胞中(參見，比如，Micheal等，J.Biol.Chem.2686866-6869(1993)，這篇文獻在此整入以供參考)。
含有治療試劑的組合物的施用途徑部分地依賴于分子的化學結(jié)構(gòu)。比如多肽和多聚核苷酸，如果是通過口服進入體內(nèi)的話就不是特別有效，因為它們會在消化道中被降解。然而，比如用來使多肽對于內(nèi)源的蛋白酶降解更加不敏感或者使其更容易通過消化道吸收的化學修飾多肽的方法，都在這里公開了或者它們是本領(lǐng)域所知的(參見，比如，Blondelle等，如上，1995；Ecker和Crook，如上，1995)。另外，多肽試劑可以用D型氨基酸來制備，或者可以包含一個或者多個基于肽模擬物的結(jié)構(gòu)域，它們是模擬結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)的有機分子；或者是基于一種類肽比如維尼綸類肽(vinylogous peptoid)構(gòu)成。
在這里公開的組合物可以通過各種途徑被施于個體，比如包括口服或者不經(jīng)腸道的途徑，如靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，皮下，眼瞼內(nèi)，囊內(nèi)，腹腔內(nèi)，直腸內(nèi)，腦池內(nèi)施用，或者通過皮膚被動或者易化吸收，比如分別應用皮膚帖或者透皮離子電滲透法。而且，所述組合物可以通過注射，插管，口服或者局部施用，后者可以是被動式的，比如直接貼上一塊膏藥，或者是主動式的，比如利用鼻腔噴霧或者吸入劑，在這種情況中，所述混合物的一種成分是一種合適的推進劑。藥物組合物也可以被施于具有病理癥狀的位點，比如通過靜脈或者動脈注射到給腫瘤供血的血管。
在實踐本發(fā)明的方法時施用的試劑的總用量可以以單次劑量的形式施于個體，也就是以一粒藥丸的形式或者是通過在一段相對較短的時間內(nèi)輸注，或者可以采用分次治療方案來施用，其中在一段延長的時間內(nèi)分多次劑量施用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，治療患者的病理狀況所需要的組合物用量依賴于許多因素，包括患者的年齡，一般健康狀況，還有給藥的途徑和要進行治療的次數(shù)?？v觀這些因素，熟練的技術(shù)人員會根據(jù)需要來調(diào)整特定的劑量。一般地，所述組合物的配方以及給藥的途徑和頻率都在一開始就已經(jīng)通過I期和II期臨床試驗確定了。
所述組合物可以配制成口服配方，比如藥片，或者溶液或懸浮液的形式；或者可以包含帶有有機或無機載劑的附加劑，或適合于腸道或者非腸道應用的賦形劑，還可以與例如通常無毒的藥學上可接受的載劑構(gòu)成復合物，形成藥片，藥丸，膠囊，栓劑，溶液，乳劑，懸浮液或者其他適于使用的形式。除了前面公開的那些，載劑還可以包括葡萄糖，乳糖，甘露糖，阿拉伯樹膠，明膠，甘露醇，淀粉糊，三硅酸鎂，云母，谷物淀粉，角蛋白，膠體硅石，馬鈴薯淀粉，尿素，中等鏈長的甘油三酸酯，葡聚糖和其他適于工業(yè)制備的載劑，它們可以是固體，半固體或者液體的形式。另外，助劑，穩(wěn)定劑，增稠劑或者著色劑和香料也可以被應用，例如一種干性穩(wěn)定劑如酮丙糖(參見，例如，美國專利號5,314,695)。
下面的實施例用來說明本發(fā)明但是并不限制本發(fā)明。
實施例1鑒定食道癌細胞中的表觀遺傳學上沉默的腫瘤抑制基因 本實施例提供了一種用于鑒定與食道鱗片狀細胞癌細胞相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因的基因組篩選方法，所述的表觀遺傳學沉默基因包括表觀遺傳學上沉默的腫瘤抑制基因(也請參見，Yamashita等，Cancer Cell 2485-495，2002，這篇文獻在此整入以供參考)。
方法細胞系和組織樣本 食道鱗片狀細胞癌(ESCC)細胞系TE1，TE2，TE3，TE4，TE5，TE7，TE13，KYSE30，KYSE70，KYSE110，KYSE140，KYSE150，KYSE200，KYSE410和KYSE520是從Tohoku大學衰老和癌癥系生物醫(yī)學研究所細胞反應中心獲得(TE系列)，KYSE系列是由Kyoto大學外科系Shimada博士熱心提供。細胞在補充有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)以用于分離DNA和RNA。原發(fā)性ESCC腫瘤和對應的附近的正常組織從馬里蘭大學醫(yī)學院醫(yī)藥系腸胃病學分部獲得。對細胞用5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5Aza-dC)和曲古抑菌素A(TSA)處理 細胞在處理之前12至24小時被分成低密度培養(yǎng)(每個T-25搖瓶有5×105細胞)，然后用1μM或者5μM的5Aza-dC(Sigma)處理3，4或者5天，所述的5Aza-dC來自于100mM溶在50％乙酸中的儲液，或者細胞用含有同樣乙酸的同樣體積磷酸鹽緩沖液(PBS)處理作為對照。在先用5Aza-dC溫育(48小時)后，終濃度為300nM的TSA(Sigma)被加到培養(yǎng)基中，所述TSA來自于5mM用乙醇溶解的儲液，或者細胞用同樣體積的乙醇處理作為對照。
微陣列和RT-PCR分析 寡聚核苷酸微陣列分析是應用GeneChipTM人類基因組U95Av2陣列(Affymetrix)，依據(jù)制造商的說明書來進行的，該陣列含有12599個基因。根據(jù)制造商提供的算法，鑒定出經(jīng)過藥物處理后被向上調(diào)節(jié)的基因。RNA是利用TRIZOL試劑(Invitrogen公司)提取的，總RNA的反轉(zhuǎn)錄用是用M-MLV(Invitrogen公司)來實現(xiàn)的；cDNA產(chǎn)物的百分之一被用作PCR的模板。RT-PCR運行24到30個循環(huán)每個循環(huán)是95攝氏度1分鐘，54或56攝氏度1分鐘，然后72攝氏度1分鐘。用于RT-PCR的示范性的擴增引物對如表3所示(SEQ IDNOS7至64)。在對照反應中，沒有反轉(zhuǎn)錄(RT-)的反應也沒有PCR產(chǎn)物的擴增出現(xiàn)。
初步的分析是用2倍的增加作為臨界值，結(jié)果鑒定出很多額外的基因。然而，這些基因中只有少數(shù)的基因是在多于一種細胞系中被向上調(diào)節(jié)，而例如BIN1，BRCA相關(guān)蛋白1(BAP1)和MAP激酶8相互作用蛋白3(JNK蛋白支架蛋白)的數(shù)種基因在啟動子區(qū)域并沒有甲基化。這些基因可能處于受被測細胞系中更加上游的在表觀遺傳學上被調(diào)節(jié)的基因調(diào)控的通路中。相比而言，用3倍的增加作為臨界值可以按照慣例地鑒定出啟動子過度甲基化的表觀遺傳學沉默基因。因此，3倍的增加在于此公開的研究中被使用。
序列分析 基因組DNA是通過TRIZOL試劑來提取的，而基因組DNA的亞硫酸氫鹽修飾如所述地進行(Merlo等，Nature Med.1686-692，1995，這篇文獻在此整入以供參考)。亞硫酸氫鹽處理過的DNA作為模板，擴增出含有ATG起始位點或者推定的轉(zhuǎn)錄起始位點的5’端區(qū)域(大約200到500個堿基對)，所用的引物是針對25個基因(22個在表中列出的基因，以及MAPK8IP3，BIN1和BAP-1)設計的。所有的PCR產(chǎn)物都經(jīng)過膠回收(Qiagen)，然后將其上樣到Applied Biosystems3700DNA分析儀，利用BD終止染料(應用生物系統(tǒng)公司)以及巢式引物或者正向引物(參見表4；F2引物)進行分析。
甲基化特異性PCR 經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理的DNA用針對載脂蛋白D設計的甲基化特異性或者非甲基化特異性的引物擴增33個循環(huán)96攝氏度30秒，59(甲基化)或55(非甲基化)攝氏度30秒，然后72攝氏度30秒。針對載脂蛋白D設計的甲基化特異性引物序列用5’-CACACGCGCGAAAACAATAT-3’(SEQ ID NO1)作為正向引物，用5’-TATGTATGTTACGTTCGTCG-3’(SEQ ID NO2)作為反向引物。非甲基化特異性的引物序列是5’-CACACAAAAACAATATCTCATTTCT-3’(SEQ ID NO3)和5’-TTTTTTATGTATGTTATGTTTGTTG-3’(SEQ ID NO4)。在其它實驗中，如SEQ ID NOS82和84(參見表4)所列的甲基化特異性的引物被運用。額外的甲基化特異性引物如表4所示(SEQ ID NOS65至127)，其中正向引物用F1或者F2指示，反向引物用R指示；其中“PCR擴增”一欄指示的是用來獲得在這里公開的結(jié)果的甲基化特異性引物對，而“序列”一欄指示的是用于亞硫酸氫鹽測序的引物。
人類表達載體構(gòu)建 CRIP1的全長cDNA從TE2細胞中用PCR分離出來，所用的引物是5’-CAGAAGCTTCCACCATGCCCAAGTGTCCCAAGTGC-3’(SEQ ID NO5)和5’-CTCTCGGTGTGAAAGTTCATTAGATCTGAC-3’(SEQ ID NO6)，其中包含有Hind III和Xba I識別位點。接著PCR產(chǎn)物從膠上剪下來，再用Hind III和Xba I酶切，然后連接到用Hind III-Xba I酶切過的pcDNA3TM載體(Invitrogen)上，這個載體具有CMV啟動子。一個克隆，pcDNA3-CRIP1，含有具有正義方向和正確序列的插入片斷。以pRCC-p53(Osada等，Nature Med.4839-843，1998，這篇文獻在此整入以供參考)作為模板擴增p53，然后亞克隆到pcDNA3TM載體的Hind III和Xba I酶切位點之間，然后再測序。被插入到pcDNA3TM載體中的Apo D cDNA和被插入到pcDNA3TM載體中STAT3C cDNA也被利用(參見，例如，Bromberg等，Cell 98295-303，1999)。
轉(zhuǎn)染和集落形成試驗 集落形成試驗是在單層培養(yǎng)物上進行的(Yoshikawa等，如上，2001)。使用6孔板來鋪放細胞，每個孔中有2×104個細胞，然后參照制造商提供的實驗方案，用Lipofectamine PlusTM轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)來轉(zhuǎn)染1μg的pcDNA3-p53，pcDNA3-STAT3C，pcDNA3-CRIP1，pcDNA3-ApoD或者pcDNA3對照(沒有插入片斷)。然后將細胞去附著，置于100毫米的組織培養(yǎng)皿中進行轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24或者48個小時，在轉(zhuǎn)染后的48小時同時收集細胞，在mRNA水平(RT-PCR)確認它們表達ApoD基因的情況。用CRIP1轉(zhuǎn)染的細胞在轉(zhuǎn)染后48小時會迅速死亡；因此在轉(zhuǎn)染后的24小時檢測mRNA水平。與非甲基化細胞系的基底表達相比，ApoD和CRIP-1的RNA水平在細胞中有1.5～2.0倍的增長。用G418(1mg/ml)來選擇細胞，于轉(zhuǎn)染后的2周進行集落計數(shù)。對于使用了神經(jīng)介肽U(NU；-PhoenixPharmaceutical)的處理，集落形成試驗在對照PBS或者培養(yǎng)基中含有100μM的NU。
結(jié)果轉(zhuǎn)錄上被抑制的基因的藥理學暴露 在有或者沒有組蛋白脫乙酰酶抑制劑TSA(300nM；最后的24小時)的情況下，用脫甲基化試劑5Aza-dC(1μM或者5μM)。處理細胞3至5天，以重新激活三個ESCC細胞系中表觀遺傳學沉默的基因。處理之后，基因表達的變化用含有12599個轉(zhuǎn)錄子的微陣列芯片(Affymetrix)來檢測；通過RT-PCR驗證隨機挑選出來的基因。正如所期望的一樣，經(jīng)過這些試劑處理，有超過500個獨特的基因(表1)的表達上調(diào)(即，至少是3.0倍的增加)。這些基因的幾乎全部(＞80％)都包含在5μM 5Aza-dC處理的這一組中，但有一些基因是在低濃度的5Aza-dC或者加入TSA的情況下被鑒定出來的(見下面)?？梢院侠淼卣J為，這些在2個或者3個ESCC細胞系中失活而又被重新激活的基因很有可能就是常常失活的腫瘤抑制基因(TSGs；120個基因)。通過比較在正常的食道和癌組織樣本中的基因表達模式(參見網(wǎng)上資源，URL為“cgap.nci.nih.gov”)(去除在正常組織中不表達的那些基因)，并去除未知的基因，由此將候選基因的數(shù)目進一步減少。對于經(jīng)過脫甲基化處理之后表達普遍上調(diào)的58個基因，還作了更加詳細的分析(圖1；表2)。
58個基因中有53個基因(91％)在啟動子區(qū)域含有CpG位點，有44個基因(76％)在啟動子區(qū)域含有高密度CpG島(GC含量＞60％或者CpG含量＞15％)(表2；CpG一欄)。25個隨機選擇的基因在經(jīng)過處理之后在3個主要細胞系中的表達上調(diào)通過RT-PCR來驗證。所有25個基因都被證明在經(jīng)過5μM的脫甲基化處理之后有強勁的重新表達(表2；ESCC細胞系/暴露)。與5Aza-dC或者TSA的單獨處理相比，例如細胞因子類因子1(CLF-1)和Hep27的基因在用1μM5Aza-dC和300nM TSA處理的時候表現(xiàn)出協(xié)同性的激活。
ESCC細胞系中的表達和啟動子過度甲基化 所述的58個基因的一部分被用來檢驗其在另外12個ESCC細胞系中的沉默或者表達下調(diào)。TE4和TE5保持了載脂蛋白D的表達，而在余下的細胞系中其mRNA水平與正常的食道樣本相比都是下調(diào)的。神經(jīng)介肽U在6個細胞系中完全是沉默的，而在其他細胞系中其表達與正常的食道相比也具有明顯的降低。半胱氨酸富含腸蛋白1(CRIP1)在15個ESCC細胞系的8個細胞系(53％)中完全沉默，而正常的食道組織則表現(xiàn)出CRIP1基因的充分表達。其他幾種被挑選出來的候選基因，包括細胞因子類因子1(CLF-1)，swiprosin-2，CRBP，金屬硫蛋白1G，角蛋白14，晶體蛋白α2和IL-1受體-2都被證明在ESCC細胞系中有明顯的表達下調(diào)。
為了確認被重新激活的基因的啟動子過度甲基化，22個基因(21個具有高密度CpG島的基因和載脂蛋白D)的啟動子區(qū)域通過亞硫酸氫鹽測序來驗證(表2)。通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)，在處理之前就具有一定的基底表達的候選基因(Tbcl d1，溶酶體唾液酸苷酶前體，載脂蛋白J，KLF6，推定的細胞周期蛋白G1相互作用蛋白和XAP-5)的大多數(shù)總是非甲基化的(溶酶體唾液酸苷酶前體，推定的細胞周期蛋白G1相互作用蛋白)。另外一方面，有13個基因(α微管蛋白，swiprosin，胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP2)，細胞視黃醇結(jié)合蛋白(CRBP)，載脂蛋白D(ApoD)，神經(jīng)介肽U(NU)，claudin-3，非配對蛋白(UCP-2)，半胱氨酸富含腸蛋白1(CRIP1)，金屬硫蛋白1G(MT 1G)，載脂蛋白CI(Apo CI)，細胞因子類因子1(CLF-1)，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2)在經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理之后，它們的被認為是對于轉(zhuǎn)錄甚為關(guān)鍵的CpG位點或者CpG島中胞嘧啶的含量仍然相當高，這表明這些基因具有很高程度的胞嘧啶甲基化(參見表2；“CpGd一欄”-“CpG狀態(tài)”-標記了“M”)。除了swiprosin-2之外，所有基因的甲基化狀態(tài)都與它們的表達狀態(tài)緊密關(guān)聯(lián)。比如，KYSE30中NU的表達沉默，其啟動子也具有高密度的甲基化，而KYSE410和KYSE520都表達NU基因，其啟動子就沒有甲基化。對于ApoD，除了TE5之外的所有ESCC細胞系都被證明有啟動子的甲基化，而大量表達ApoD基因的TE5細胞卻不具有任何的甲基化。TE2，TE4和TE13細胞都表現(xiàn)出Apo D mRNA的弱表達，通過亞硫酸氫鹽處理的DNA的直接測序表明，這些細胞的大約50％具有非甲基化的等位基因。
原發(fā)性ESCC腫瘤中的表達和啟動子過度甲基化 通過MSP或者直接的測序分析來檢測上述13個甲基化基因(表2；“CpGd”一欄，標記了“M”的基因)在ESCC組織中的啟動子甲基化。這13個基因中有10個基因具有腫瘤特異性的啟動子甲基化(圖2)。腫瘤甲基化的頻率從10％(UCP-2)到80％(載脂蛋白C1)。ApoD幾乎在所有的原發(fā)性ESCC組織中(80％)被甲基化，而且通過MSP可知在一些正常組織中它的甲基化水平很低。Swiprosin-2和α微管蛋白在正常的食道粘膜樣本中表現(xiàn)出甲基化，這表明是一種組織特異性但非腫瘤特異性的過度甲基化。10種受測的原發(fā)性腫瘤都不具有IGFBP-2甲基化。
然后檢測這13種基因在5種原發(fā)性ESCC組織中的表達；與對應的正常組織相比，在這些原發(fā)性癌癥中的表達水平降低被檢測到(表2)。在數(shù)種原發(fā)性腫瘤中NU和ApoD的mRNA水平與對應的正常組織相比要下降許多。除了swiprosin-2，每一個在原發(fā)性腫瘤中被甲基化的基因都在RNA水平上有明顯的表達量降低。對于swiprosin-2，其甲基化并不與其在原發(fā)性腫瘤或者細胞系中的表達量降低非常相關(guān)(表2)。還有一些腫瘤并不產(chǎn)生甲基化，但是卻依然表現(xiàn)出特定基因的偶爾下調(diào)(表2)，這很有可能是通過其他機制導致的。
腫瘤抑制活性 甲基化基因中的三個(CRIP，ApoD和NU)被用來驗證其抑制KYSE30的腫瘤生長的能力，KYSE30中這三個基因都被沉默掉。對這三種基因的檢驗是通過將由各種基因或者對照載體(pcDNA3TM載體)轉(zhuǎn)染的細胞用G418進行選擇，應用集落形成實驗來完成的。STAT3是一種癌基因蛋白，STAT3C是其組成型的活性形式(Bromberg等，如上，1999)。由于STAT3的表達在經(jīng)過5Aza-dC處理之后不改變，因此它可以用來作為腫瘤抑制活性的陰性對照。在NU的情況中，實際用到的蛋白濃度是100μM。所有三種基因都被證明具有強勁的腫瘤抑制活性，在三次獨立的實驗中，它們的集落形成能力在轉(zhuǎn)染(ApoD，61.3±15.0％；CRIP，18.3±15.7％)或者加入蛋白(NU，33.6±12.3％)之后都有明顯的降低(參見，例如，圖3)。為了進一步驗證CRIP1表達的作用，IRES-CRIP1被暫時轉(zhuǎn)染到KYSE30細胞中。表達出高水平GFP蛋白(同時也是表達CRIP1)的細胞表現(xiàn)出細胞凋亡的經(jīng)典的形態(tài)變化，包括細胞變圓，凋亡小體的出現(xiàn)和細胞核收縮。TUNEL分析證實了表達CRIP1的細胞的DNA斷裂。
表觀遺傳學沉默的藥理學逆轉(zhuǎn)揭示了許多種在ESCC中轉(zhuǎn)錄被抑制的基因。數(shù)種未知的可能的TSG通過微陣列分析和直觀的算法用3倍的增加作為臨界值鑒定出來。這些基因的大多數(shù)是通過高劑量的5Aza-dC處理鑒定出的，有一部分基因是通過低劑量5Aza-dC和TSA的協(xié)同處理被重新激活，正如在結(jié)腸癌細胞系中被證明的一樣(Cameron等，如上，1999；Suzuki等，如上，2002)。這一鑒定可以提供了最小數(shù)目的上調(diào)基因，因為表觀遺傳學沉默的逆轉(zhuǎn)在一系列細胞中出現(xiàn)時，其重新表達的表達量很可能不同(Cameron等，如上，1999)。一種涉及選擇性克隆的更加復雜的方法鑒定出結(jié)腸直腸癌中的許多甲基化目標，還可以應用這種方法鑒定更加精細的目標(Suzuki等，如上，2002)。高劑量5Aza-dC的應用很可能導致更多數(shù)目的細胞的重新表達，因而有利于本研究中所用到的直接雜交方法。運用多種逆轉(zhuǎn)表觀遺傳學沉默的方法很可能會得到最全面的基因鑒定。另外，其他算法和更好的去甲基化或者HDAC抑制可以改進鑒定甲基化目標的結(jié)果。
神經(jīng)介肽U(NU)被認為涉及正常食道粘膜的整合性，并且NU連同最近鑒定出的同源受體(Hedrick等，Mol.Pharmacol.58870-875，2000)在正常的食道粘膜中被大量表達(Hedrick等，如上，2000；Lynch等，Nature 40670-74，2000)。NU受體(FM3)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，能夠通過PI3激酶γ進行信號轉(zhuǎn)導，最近被確認可以阻斷人類結(jié)腸癌細胞的生長(Sasaki等，Nature 406897-902，2000)。而且，在本研究中，候選TSG的列表包括神經(jīng)介肽B和RSG2，這些基因涉及同樣的通路。
CRIP具有一個LIM結(jié)構(gòu)域，其涉及腫瘤形成過程(比如Lmo2和Lmo4)。Lmo2是一種轉(zhuǎn)錄因子，被認為在T細胞白血病發(fā)生過程中起致癌作用(Grutz等，EMBO J.174594-4605，1998)，這也許是通過促進血管發(fā)生來實現(xiàn)的(Yamada等，Oncogene 211309-1315，2002)。Lmo4在乳腺癌細胞中過量表達，并與BRCA1結(jié)合，結(jié)果使得BRCA1轉(zhuǎn)錄活性受到抑制(Visvander等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9814452-14457，2001；Sum等，J.Biol.Chem.2777849-7856，2002)。樁蛋白(paxillin)是一種含有多個LIM結(jié)構(gòu)域的與聚焦黏附相關(guān)的接頭蛋白，其參與細胞伸展和運動(Schaller，Oncogene 206459-6472，2001)。樁蛋白的LIM結(jié)構(gòu)域與α微管蛋白結(jié)合(Herreros等，2000)，而α微管蛋白是包括APC和Fhit在內(nèi)的其他關(guān)鍵性的腫瘤抑制子的伴侶。這里鑒定到的LIM基因(CRIP)是一種非常小的分子(開放閱讀框架只有273個堿基對)，它能夠以顯性抑制的方式調(diào)節(jié)其他LIM蛋白，而且潛在地調(diào)節(jié)或者影響涉及癌癥發(fā)生的許多通路。此外，酵母雙雜交篩選鑒定到Ubc13是作為一種結(jié)合伴侶，其牽連到對于細胞凋亡是關(guān)鍵的NF-κB和JNK通路中的CRIP(Wang等，Nature 412346-351，2001)。
載脂蛋白D與細胞生長控制相關(guān)(Do Carmo等，J.Biol.Chem.2775514-5523，2002)，但其具體的機制還不清楚。其他載脂蛋白如載脂蛋白CI和載脂蛋白J也包括在這里鑒定出的58種基因中。載脂蛋白J具有很強的誘導細胞死亡的能力(Han等，Nature Med.7338-343，2001)。載脂蛋白D與細胞因子類型的受體結(jié)合，介導MAP激酶信號轉(zhuǎn)導通路(Liu等，F(xiàn)ASEB J.151329-1331，2001)。這種細胞因子信號轉(zhuǎn)導通路也可以被識別的腫瘤抑制因子樣SOCS-1使用(Yoshikawa等，如上，2001)，而且，如被本研究結(jié)果所指出的，IL-1受體拮抗劑(IL-1R2)(Colotta等，Science 261472-475，1993)和CLF-1(Elson等，J.Immunol.1611371-1379，1998)也可以參與這個通路。
58個候選基因的染色體定位被列在表2中。許多候選TSG都集中在特定的染色體區(qū)域(表2)，這說明了在腫瘤中具有高度甲基化和降低的基因表達的甲基化染色體區(qū)域的存在，而它們又可以通過藥物學去甲基化處理來揭示。載脂蛋白D，NU和CRIP1分別定位在3q26，4q12和14q24。所有這些基因座在各種癌癥中都有染色體缺失或者LOH，而3q26也是一個易碎的位點。本研究揭示了10個基因以腫瘤特異性的模式被甲基化，但是不管是否被甲基化，所有這些基因都還是TSG通路的參與者。比如，MUC2是在本研究中被鑒定出來的基因中的一個；MUC2敲除的小鼠易于形成腫瘤(Velcich等，Science2951726-1729，2002)。因此，在本研究中被鑒定出來的許多基因都可以是TSG基因。
通過甲基化和脫乙?；墓δ苣孓D(zhuǎn)，并接著進行微陣列上的雜交，鑒定出在ESCC中受表觀遺傳學調(diào)控的候選基因和通路。在這里公開的結(jié)果證明了這種方法的快速和普遍有效，而且這種方法還很容易在其他癌癥細胞系中重復，以全面搜尋表觀遺傳學沉默的腫瘤抑制基因。用來搜尋甲基化CpG島的互補基因組陣列方法可以與功能重激活分析相比較(Gitan等，Genome Res.12158-164，2002；Adorjan等，Nucleic Acid Res.30e21，2002；Shi等，Cancer Res.623214-3220，2002)。啟動子區(qū)域具有CpG島和在腫瘤組織中發(fā)生甲基化的基因很有可能就是一個真正的腫瘤抑制基因(表2)。本方法鑒定出3個新的腫瘤抑制基因，還有更多的基因有待于進一步驗證。
應用MSP可以快速地檢測由于甲基化導致的原發(fā)性腫瘤中基因失活的頻率，而功能性分析又可以快速地評定基因的抑制活性。這些被鑒定出來的基因可以提供一種鑒定和操作ESCC的生物學過程的手段，由此提供了重要的治療靶點。此外，繼基因鑒定之后的MSP分析的快速發(fā)展使得可以通過執(zhí)行有前景的分子檢測手段來有效地分析原發(fā)性腫瘤和其他臨床樣品(參見，比如，Esteller等，如上，1996；Kavakami等，J.Natl.Cancer Inst.921805-1811，2000；Jeronimo等，J.Natl.Cancer Inst.931747-1752，2001)。
實施例2鑒定頭頸部癌細胞中的表觀遺傳學上沉默的腫瘤抑制基因 本實施例將上述針對食道癌細胞公開的結(jié)果延伸到頭頸部鱗片狀細胞癌(HNSCC)細胞。
HNSCC細胞用10μM 5Aza-dC或者0.1μM 5Aza-dC和300nM TSA處理，篩選的方法如實施例1所述。表觀遺傳學沉默基因的重新激活在兩組被處理的細胞中都被發(fā)現(xiàn)。示范性的基因至少有2倍的表達量增加，如表5和表6所示(增加的倍數(shù)在第二欄中示出)。
這些結(jié)果表明實施例1中公開的基因組篩選方法可以拓展到其他癌癥細胞類型。在HNSCC細胞中重新表達的基因的進一步分析按照如實施例1公開的方法進行，可以確認具有腫瘤抑制活性的基因。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參照上面的實施例作了描述，但是需要理解的是，修改和變動依然包括在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的內(nèi)容只受權(quán)利要求的限制。






表3


*SEQ ID NO-從7到64編號，從左到右，從上至下；示例性的SEQ ID NO被顯示。
表4

*SEQ ID NO-從65到127編號，從左到右，從上至下；示例性的SEQ ID NO被顯示。
表5 用5aza-dC處理HNSCC#011細胞系

表6 用5aza-dC+TSA處理HNSCC#013細胞系

權(quán)利要求
1.一種鑒定與癌癥相關(guān)的至少一種表觀遺傳學沉默基因的方法，包括a)在適于核酸分子與陣列上互補的核苷酸序列發(fā)生選擇性雜交的條件下，將對應于在癌細胞中表達的RNA的核酸分子與代表基因組的核苷酸序列陣列接觸，所述的癌細胞與能夠重新激活表觀遺傳學沉默基因的表達的至少一種試劑接觸過；和b)檢測來自于與所述的至少一種試劑接觸過的癌細胞的核酸分子與所述陣列上一部分核苷酸序列雜交量的增加，所述增加是相對于在所述條件下對應于在所述癌細胞中表達的RNA的核酸分子與所述的那部分核苷酸序列中的至少一種核苷酸序列的雜交水平，由此所述的增加的選擇性雜交便鑒定出表觀遺傳學沉默基因的被激活的表達，這樣就鑒定出與所述癌癥相關(guān)的至少一種表觀遺傳學沉默基因。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的重新激活表觀遺傳學沉默基因的表達的試劑包括甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或者它們的組合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述的組蛋白脫乙酰酶抑制劑是曲古抑菌素A。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述的對應于RNA的核酸分子包括cRNA。
6.權(quán)利要求1的方法，包括將所述陣列與對應于在癌細胞中表達的RNA的核酸分子接觸，所述癌細胞與5-氮雜-2′-脫氧胞苷，曲古抑菌素A，或者它們的組合接觸過。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括在表2中所列的核酸分子，或者是其組合。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括含有載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，白介素-1R2，晶體蛋白α2，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白(CRIP-1)，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbc1d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白或者是其組合的核酸分子。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，細胞因子樣因子-1(CLF-1)，CRIP-1，細胞視黃醇結(jié)合蛋白，金屬硫蛋白1G，角蛋白14，白介素-1受體2，晶體蛋白α2，或者是這些基因的組合。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括甲基化沉默基因。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述的至少一種甲基化沉默基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，載脂蛋白C1，或者是這些基因的組合。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括腫瘤抑制基因。
13.權(quán)利要求12的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，或者是CRIP-1。
14.權(quán)利要求12的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B，或者G蛋白信號通路受體2(RGS2)。
15.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是食道鱗片狀細胞癌。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述癌癥是頭頸部鱗片狀細胞癌。
17.一種鑒定表現(xiàn)出或者將要表現(xiàn)出失控生長的細胞的方法，包括檢測在受測細胞中包括列在表2，表5，表6或者其組合中的核酸分子的至少一種基因的表觀遺傳學沉默，由此確定受測細胞是表現(xiàn)出生長失控的細胞或者將要表現(xiàn)出生長失控的細胞。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述的至少一種基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，白介素-1受體-2，晶體蛋白α2，細胞因子樣因子-1，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白CRIP-1，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbc1d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，細胞視黃醇結(jié)合蛋白，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述的表現(xiàn)出生長失控或者是將要表現(xiàn)出生長失控的細胞是一種贅生性細胞。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述的贅生性細胞是惡化前的細胞。
21.權(quán)利要求19的方法，其中所述的贅生性細胞是癌癥細胞。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述的癌癥細胞是食道鱗片狀細胞癌細胞。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述的癌癥細胞是頭頸部鱗片狀細胞癌細胞。
24.權(quán)利要求17的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默包括甲基化沉默，所述的方法包括檢測甲基化沉默。
25.權(quán)利要求24的方法，其中檢測甲基化沉默包括將含有包含著所述基因的核酸分子的5’端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，所述的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶可以在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5’端調(diào)控區(qū)域內(nèi)的識別位點進行剪切，因此所述核酸分子的剪切指示受測細胞中該基因的甲基化沉默。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶是Acc III，Ban I，BstN I，Msp I或者Xma I。
27.權(quán)利要求24的方法，其中檢測甲基化沉默包括將含有包含著所述基因的核酸分子的5’端調(diào)控區(qū)域的區(qū)域與甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶接觸，所述的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶可以在含有CpG二核苷酸的甲基化胞嘧啶殘基的5’端調(diào)控區(qū)域內(nèi)的識別位點進行剪切，假如所述CpG二核苷酸上的胞嘧啶被去甲基化的話，因此所述核酸分子沒有剪切發(fā)生則指示受測細胞中該基因的甲基化沉默。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶是Acc II，Ava I，BssH II，BstU I，Hpa II或者Not I。
29.權(quán)利要求24的方法，其中檢測甲基化沉默包括將包含著受測細胞基因的核酸分子的5’端調(diào)控區(qū)域與選擇性地修飾非甲基化的胞嘧啶殘基或者甲基化的胞嘧啶殘基的化學試劑接觸，然后檢測由于所述接觸而生成的產(chǎn)物，其中該產(chǎn)物指示在所述基因的CpG二核苷酸中的胞嘧啶殘基的甲基化，由此檢測所述受測細胞中所述基因的甲基化沉默。
30.權(quán)利要求29的方法，其中檢測所述產(chǎn)物包括電泳方法，色譜方法，質(zhì)譜方法，或者這些方法的組合。
31.權(quán)利要求29的方法，其中所述化學試劑是肼，由此生成經(jīng)肼處理的基因5′端調(diào)控區(qū)域，所述方法進一步包括將經(jīng)肼處理的5′端調(diào)控區(qū)域與能夠剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑接觸，生成包含著所述基因的核酸分子的片斷的產(chǎn)物，根據(jù)分子量來分離所述片斷，以及檢測在所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域中已知含有胞嘧啶殘基的位置處的缺口，所述缺口指示在所述基因中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化，由此檢測所述受測細胞中所述基因的甲基化沉默。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的剪切經(jīng)肼修飾的胞嘧啶殘基的試劑是哌啶。
33.權(quán)利要求29的方法，其中所述化學試劑包括亞硫酸氫根離子，由此在基因的5′端調(diào)控區(qū)域中的非甲基化的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)變成亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基，所述方法進一步包括將經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理的基因暴露于堿性條件，這樣亞硫酸氫鹽修飾的胞嘧啶殘基被轉(zhuǎn)變成尿嘧啶殘基，以及檢測受測細胞中經(jīng)亞硫酸氫根離子處理的基因的5′端調(diào)控區(qū)域中尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布，其中，與經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理并暴露于堿性條件的對應的非甲基化基因中的尿嘧啶殘基數(shù)量或者分布相比，所述受測細胞的基因的5′端調(diào)控區(qū)域中尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布減少，則說明所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化，由此檢測所述受測細胞中所述基因的甲基化沉默。
34.權(quán)利要求33的方法，其中檢測尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布包括測定經(jīng)過亞硫酸氫鹽修飾并暴露于堿性條件的基因5′端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列。
35.權(quán)利要求33的方法，其中檢測尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布包括將經(jīng)過亞硫酸氫根離子處理并暴露于堿性條件的基因序列與能夠與含有尿嘧啶殘基的基因5′端調(diào)控區(qū)域選擇性雜交的寡聚核苷酸接觸，以及檢測與所述寡聚核苷酸的選擇性雜交。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述寡聚核苷酸包括可檢測的標記，并且其中檢測選擇性雜交包括檢測所述標記。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述的可檢測標記是放射性同位素，順磁性同位素，發(fā)光化合物，化學發(fā)光化合物，熒光化合物，金屬鰲合劑，酶，酶底物，受體，或者受體的配體。
38.權(quán)利要求35的方法，其中所述寡聚核苷酸是引物延伸反應的底物，而且其中檢測選擇性雜交包括檢測所述引物延伸反應的產(chǎn)物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述寡聚核苷酸具有在SEQ IDNOS1至127中任意一個所列的核苷酸序列。
40.權(quán)利要求33的方法，其中檢測尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布包括將所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域與一對包括正向引物和反向引物的擴增引物在適合于擴增反應的條件下接觸，其中該對引物中的至少一個引物包含能夠與含有尿嘧啶殘基的5′端調(diào)控區(qū)域核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，由此，擴增產(chǎn)物的生成指示所述基因5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化，由此檢測所述受測細胞中所述基因的甲基化沉默。
41.權(quán)利要求40的方法，其中所述擴增引物對包括一對引物，其包括在SEQ ID NOS1，2和65至127中所列的正向引物和反向引物。
42.權(quán)利要求33的方法，其中檢測尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布包括將所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域與一對包括正向引物和反向引物的擴增引物在適合于擴增反應的條件下接觸，其中該對引物中的兩個引物都能與含有胞嘧啶殘基的5′端調(diào)控區(qū)域核苷酸序列選擇性雜交，但不與對應的含有尿嘧啶殘基的5′端調(diào)控區(qū)域核苷酸序列選擇性雜交，由此，擴增產(chǎn)物的生成指示所述基因5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基沒有甲基化，由此檢測所述受測細胞中所述基因的甲基化沉默。
43.權(quán)利要求42的方法，其中所述擴增引物對包括在SEQ IDNOS3和4中所列的引物對。
44.權(quán)利要求33的方法，其中檢測尿嘧啶殘基的數(shù)量或者分布包括將所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域與第一擴增引物對和第二擴增引物對在適合于擴增反應的條件下接觸，其中所述的第一擴增引物對包括一個正向引物和一個反向引物，其中第一引物對中的至少一個引物包含能與含有尿嘧啶殘基的基因5′端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交的寡聚核苷酸，其中所述的第二擴增引物對包括一個正向引物和一個反向引物，其中第二引物對中的兩個引物都能夠與含有胞嘧啶殘基的基因5′端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交，但不與對應的含有尿嘧啶殘基的基因5′端調(diào)控區(qū)域的核苷酸序列選擇性雜交，以及其中通過所述第一引物對獲得的擴增產(chǎn)物如果有的話，將有一個第一長度，并且其中通過所述第二引物對獲得的擴增產(chǎn)物如果有的話，將有一個第二長度，第二長度不同于第一長度，由此，所述擴增產(chǎn)物的長度是指示尿嘧啶殘基的標記，因此也是所述基因的5′端調(diào)控區(qū)域中CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化的標記，由此檢測所述受測細胞中所述基因的甲基化沉默。
45.權(quán)利要求24的方法，其中檢測甲基化沉默包括a)將待測細胞與去甲基化試劑接觸，以及b)檢測由所述基因編碼的RNA相對于沒有與去甲基化試劑接觸過的對應受測細胞中所述RNA的表達重新激活。
46.權(quán)利要求45的方法，其中所述的去甲基化試劑包括甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑包括5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
48.權(quán)利要求17的方法，其以高通量的形式進行，其中受測細胞或者其抽提物包括一系列受測細胞中的一種或者其抽提物，或者它們的組合。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述的一系列受測細胞或者其抽提物中的每一份都是相同的或者不同的，或者是其組合。
50.權(quán)利要求48的方法，進一步包括檢測在表現(xiàn)出受控生長的對應細胞或者對應細胞的抽提物中的基因5′端調(diào)控區(qū)域的CpG島的CpG二核苷酸的胞嘧啶殘基甲基化，如果有的話。
51.權(quán)利要求48的方法，其中所述的受測細胞或者受測細胞的抽提物被布置在陣列中。
52.權(quán)利要求51的方法，其中所述陣列是可尋址的陣列。
53.權(quán)利要求48的方法，其中所述受測細胞或者受測細胞的抽提物在微芯片，玻璃板或者珠子上。
54.權(quán)利要求17的方法，其中所述受測細胞包括從一個個體上獲得的樣本。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述個體是人類個體。
56.權(quán)利要求54的方法，其中所述樣本包括器官樣本，組織樣本，或者細胞樣本。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述樣本包括消化道樣本，食道樣本，肝臟樣本，皮膚樣本，淋巴結(jié)樣本，腎臟樣本，肺樣本，肌肉樣本，骨樣本，胃腸道樣本，或者腦樣本。
58.權(quán)利要求56的方法，其中所述樣本包括生物流體。
59.權(quán)利要求56的方法，其中所述生物流體包括骨髓，血液，血清，淋巴，腦脊液，唾液，痰，糞便，尿液，或者精液。
60.一種減緩或者抑制細胞的失控生長的方法，所述細胞表現(xiàn)出與癌癥相關(guān)的至少一種基因的轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳學沉默，所述方法包括恢復由所述的表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽在所述細胞中的表達，由此減緩或者抑制所述細胞的失控生長。
61.權(quán)利要求60的方法，其中恢復所述多肽的表達包括將所述細胞與去甲基化試劑，組蛋白脫乙酰酶抑制劑，或者它們的組合接觸。
62.權(quán)利要求61的方法，其中所述的去甲基化試劑包括甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑。
63.權(quán)利要求60的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括甲基化沉默基因，所述方法包括將所述細胞與至少一種去甲基化試劑接觸。
64.權(quán)利要求63的方法，其中將所述細胞與去甲基化試劑接觸是在培養(yǎng)基中進行的。
65.權(quán)利要求63的方法，其中將所述細胞與去甲基化試劑接觸包括將所述試劑施于含有所述細胞的對象。
66.權(quán)利要求63的方法，其中所述的去甲基化試劑包括5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
67.權(quán)利要求60的方法，其中恢復所述多肽的表達包括向所述細胞中導入編碼所述多肽的多聚核苷酸，這樣所述多肽由所述多聚核苷酸表達出。
68.權(quán)利要求67的方法，其中所述多聚核苷酸包含在載體內(nèi)。
69.權(quán)利要求68的方法，其中所述載體是病毒載體。
70.權(quán)利要求67的方法，其中向所述細胞中導入所述多聚核苷酸包括將所述細胞與所述多聚核苷酸在體內(nèi)接觸。
71.權(quán)利要求67的方法，其中所述表觀遺傳學沉默基因包括列在表2中的核酸分子。
72.權(quán)利要求60的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，白介素-1受體-2，晶體蛋白α2，細胞因子樣因子-1，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbc1d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，細胞視黃醇結(jié)合蛋白，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
73.權(quán)利要求60的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括甲基化沉默基因。
74.權(quán)利要求73的方法，其中所述的甲基化沉默基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
75.權(quán)利要求60的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括腫瘤抑制基因。
76.權(quán)利要求75的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，或者CRIP-1。
77.權(quán)利要求75的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B基因，或者G蛋白信號通路受體2基因。
78.一種治療癌癥病人的方法，其中在病人體內(nèi)的癌細胞中的至少一種基因的表達在表觀遺傳學上沉默，所述方法包括恢復所述的表觀遺傳學上沉默的至少一種基因在病人癌細胞中的表達，由此治療癌癥病人。
79.權(quán)利要求78的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括甲基化沉默基因。
80.權(quán)利要求79的方法，包括向所述病人施用去甲基化試劑，其施用量足以恢復病人癌細胞中甲基化沉默基因的表達。
81.權(quán)利要求78的方法，包括向所述病人施用編碼由所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因編碼的多肽的至少一種多聚核苷酸，其施用量足以使所述的至少一種多肽在病人癌細胞中表達。
82.權(quán)利要求81的方法，其中所述的多聚核苷酸包含在載體內(nèi)。
83.權(quán)利要求82的方法，其中所述載體是病毒載體。
84.權(quán)利要求81的方法，其中所述多聚核苷酸包含基質(zhì)。
85.權(quán)利要求84的方法，其中所述基質(zhì)是脂質(zhì)體。
86.權(quán)利要求78的方法，其中所述癌癥是癌或者肉瘤。
87.權(quán)利要求78的方法，其中所述癌癥是食道鱗片狀細胞癌。
88.權(quán)利要求87的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括列在表2中的核酸分子。
89.權(quán)利要求87的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，白介素-1受體-2，晶體蛋白α2，細胞因子樣因子-1，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbc1d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，細胞視黃醇結(jié)合蛋白，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
90.權(quán)利要求87的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括甲基化沉默基因。
91.權(quán)利要求90的方法，其中所述的甲基化沉默基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
92.權(quán)利要求87的方法，其中所述的表觀遺傳學沉默基因包括腫瘤抑制基因。
93.權(quán)利要求92的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，或者CRIP-1。
94.權(quán)利要求92的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B基因，或者G蛋白信號通路受體2基因。
95.權(quán)利要求78的方法，其中所述癌癥是頭頸部鱗片狀細胞癌。
96.權(quán)利要求95的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括列在表5或者表6中的核酸分子，或者其組合。
97.一種為治療癌癥病人選擇治療策略的方法，包括a)通過將代表基因組的核苷酸序列陣列與對應于癌細胞中表達的RNA的核酸分子在適合于核酸分子與陣列上互補的核苷酸序列選擇性雜交的條件下接觸，來鑒定至少一種與所述癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因，其中所述的癌細胞與能夠重新激活表觀遺傳學沉默基因的表達的至少一種試劑接觸過；檢測與所述的至少一種試劑接觸過的癌細胞中的核酸分子與所述陣列上的一部分核苷酸序列的雜交量的增加，所述增加是與對應于在所述癌細胞中表達的RNA的核酸分子在所述條件下和所述的那部分核苷酸序列中的至少一種核苷酸序列的雜交水平比較得出的，因此所述的選擇性雜交水平的增加就確定出表觀遺傳學沉默基因的重新激活的表達，因此鑒定出至少一種與所述癌癥相關(guān)的表觀遺傳學沉默基因；以及b)選擇一種用于恢復病人癌癥細胞中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因的表達的試劑，由此選擇出治療癌癥病人的治療策略。
98.權(quán)利要求97的方法，其中所述試劑包括編碼所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因的多聚核苷酸。
99.權(quán)利要求98的方法，其中所述的多聚核苷酸包括列在表2，表5或者表6中的核酸分子。
100.權(quán)利要求98的方法，其中所述的多聚核苷酸包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，白介素-1受體-2，晶體蛋白α2，細胞因子樣因子-1，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbc1d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，細胞視黃醇結(jié)合蛋白，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
101.權(quán)利要求97的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括至少一種甲基化沉默基因。
102.權(quán)利要求101的方法，其中所述試劑包括含有所述的至少一種甲基化沉默基因的多聚核苷酸。
103.權(quán)利要求102的方法，其中所述的多聚核苷酸包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
104.權(quán)利要求101的方法，其中所述試劑包括去甲基化試劑。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述的去甲基化試劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
106.權(quán)利要求97的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括至少一種腫瘤抑制基因。
107.權(quán)利要求106的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，或者CRIP-1。
108.權(quán)利要求106的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B基因，或者G蛋白信號通路受體2基因。
109.一種治療患有食道鱗片狀細胞癌的患者的方法，其中與食道鱗片狀細胞癌相關(guān)的細胞含有至少一種表觀遺傳學沉默基因，所述方法包括向患者施用一定劑量的能夠恢復所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因的表達的試劑，以使在與食道鱗片狀細胞癌相關(guān)的細胞中所述的表觀遺傳學沉默基因得以恢復表達，由此治療患者。
110.權(quán)利要求109的方法，其中所述試劑包括編碼所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因的多聚核苷酸。
111.權(quán)利要求110的方法，其中所述的多聚核苷酸包括在表2中所列的核酸分子。
112.權(quán)利要求110的方法，其中所述的多聚核苷酸包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，swiprosin-2，Hep27，KIF5C，角蛋白14，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，MUC1，白介素-1受體-2，晶體蛋白α2，細胞因子樣因子-1，含LIM結(jié)構(gòu)域的半胱氨酸富含蛋白，Rad，HEM45，KLF6，類卵泡抑素蛋白FLRG，XAP-5，Tbc1d1，細胞周期蛋白G1相互作用蛋白，細胞視黃醇結(jié)合蛋白，金屬硫蛋白1G，claudin-3，非配對蛋白2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
113.權(quán)利要求109的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括至少一種甲基化沉默基因。
114.權(quán)利要求113的方法，其中所述試劑包括含有所述的至少一種甲基化沉默基因的多聚核苷酸。
115.權(quán)利要求114的方法，其中所述的多聚核苷酸包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，CLF-1，CRIP-1，claudin-3，非配對蛋白2，金屬硫蛋白1G，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶2，載脂蛋白C1，或者這些基因的組合。
116.權(quán)利要求109的方法，其中所述的至少一種表觀遺傳學沉默基因包括至少一種腫瘤抑制基因。
117.權(quán)利要求116的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括載脂蛋白D，神經(jīng)介肽U，或者CRIP-1。
118.權(quán)利要求116的方法，其中所述的腫瘤抑制基因包括神經(jīng)介肽B基因，或者G蛋白信號通路受體2基因。
119.權(quán)利要求110的方法，其中所述多聚核苷酸包含在載體內(nèi)。
120.權(quán)利要求119的方法，其中所述載體是病毒載體。
121.權(quán)利要求112的方法，其中所述多聚核苷酸包含基質(zhì)。
122.權(quán)利要求121的方法，其中所述基質(zhì)是脂質(zhì)體。
123.權(quán)利要求109的方法，其中所述試劑包括去甲基化試劑。
124.權(quán)利要求123的方法，其中所述的去甲基化試劑是5-氮雜-2′-脫氧胞苷。
125.權(quán)利要求109的方法，其中施用所述試劑包括將所述試劑施于患者體內(nèi)食道鱗片狀細胞癌細胞所在位點。
126.一種分離的寡聚核苷酸，包括在SEQ ID NOS1至127的任何一個中所列的寡聚核苷酸。
127.多種分離的寡聚核苷酸，包括權(quán)利要求126中所述的分離的寡聚核苷酸的至少兩種。
128.一對擴增引物，包括列在SEQ ID NOS1至127中的一個正向引物和一個反向引物，其中所述擴增引物對可以擴增在表2中所列的核酸分子的一部分。
129.權(quán)利要求128的擴增引物對，其可以特異性地擴增所述核酸分子的甲基化的5′端調(diào)控區(qū)域。
130.權(quán)利要求129的擴增引物對，包括列在SEQ ID NOS1，2，和65至127中的一個正向引物和一個反向引物，其可以特異性地擴增所述核酸分子的甲基化的5′端調(diào)控區(qū)域。
131.權(quán)利要求128的擴增引物對，其可以特異性地擴增所述核酸分子的非甲基化的5′端調(diào)控區(qū)域。
132.權(quán)利要求131的擴增引物對，包括SEQ ID NOS3和4。
133.試劑盒，其包含權(quán)利要求126的至少一種分離的寡聚核苷酸。
134.權(quán)利要求133的試劑盒，其包含多種分離的寡聚核苷酸。
135.權(quán)利要求134的試劑盒，其中所述的多種包括至少一對含有正向引物和反向引物的擴增引物。
136.權(quán)利要求135的試劑盒，其包含多種擴增引物對。
137.權(quán)利要求135的試劑盒，其中所述的擴增引物對包括甲基化特異性擴增引物對，非甲基化特異性擴增引物對，或者含有至少一對甲基化特異性擴增引物對和至少一對非甲基化特異性擴增引物對的組合。
138.權(quán)利要求133的試劑盒，進一步包含修飾甲基化胞嘧啶殘基的試劑。
139.權(quán)利要求133的試劑盒，進一步包含甲基化敏感型限制性內(nèi)切酶。
140.權(quán)利要求133的試劑盒，進一步包含用于進行擴增反應的試劑。
全文摘要
提供了用于鑒定包括表觀遺傳學上沉默的腫瘤抑制基因在內(nèi)的表觀遺傳學沉默基因的基因組篩選方法。還提供了檢測癌癥的方法，所述癌癥例如食道鱗片狀細胞癌或者頭頸部鱗片狀細胞癌，還提供了治療患有這樣的癌癥的患者的方法。
文檔編號C07H21/04GK101080499SQ03809647
公開日2007年11月28日 申請日期2003年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月7日
發(fā)明者D·西德蘭斯基, S·B·貝林, J·赫爾曼, H·鈴木 申請人:約翰霍普金斯大學