專利名稱：人癌胚抗原(cea)的特異性抗體片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學分支，具體而言，本發(fā)明涉及通過重組DNA技術(shù)由小鼠單克隆抗體獲得的單價和二價(二體)形式的單鏈Fv型抗體片段，所述單抗具有已證明的臨床功效，而且對人癌胚抗原是特異的。
背景技術(shù)：
癌胚抗原(CEA)是一種180kDa糖蛋白，優(yōu)先由人胃腸道腫瘤和其它癌細胞分泌的，然而也可以在一些非惡性組織像結(jié)腸粘膜中檢測到。尚未完全闡明它的生理學作用，至今認為它在某些方面與細胞粘附過程有關(guān)(Gold P、Freedman SO，Journal of Experimental Medicine，122467，1965；Zimmermann W等人，PNAS USA，842960-2964，1987；Paxton RJ等人，PNAS USA，84920-924，1987；BeaucheminN等人，Molec Celluar Biol，73221-3230，1987；Gold P、GoldenbergNA，MJM，346-66，1997)。
由于其重復性結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特征，CEA被歸為免疫球蛋白超家族的成員(Oikawa S等人，BBRC，144634-642，1987；Thompson J、Zimmermann W，Tumor Biology，963-83，1988；Hammarstrom S，Seminars in Cancer Biology，67-81，1999)。CEA與該超家族的其它分子具有高度同源性，諸如NCA、阿片抗原(meconium antigen)、A型膽汁糖蛋白(biliar glycoprotein type A)、和妊娠特異性糖蛋白b(vonKleist S、Burtin P，Immunodiagnosis of Cancer，Marcel Dekker，322-341，1979；Buchegger F等人，Int J Cancer，33643-649，1984；Matsuoka Y等人，Cancer Res，422012-2018，1982；Svenberg T，Int J Cancer，17588-596，1976)。
多年來，對循環(huán)中CEA水平的評估被看作是因表達這種抗原的原發(fā)性結(jié)腸直腸腫瘤而進行手術(shù)的患者體內(nèi)可能復發(fā)和/或轉(zhuǎn)移的最佳指標之一(Gold P、Goldenberg NA，MJM，346-66，1997)。CEA循環(huán)水平的測量還延伸成為監(jiān)測已經(jīng)證實了這種腫瘤標記的顯著術(shù)前水平的其它人癌癥(乳房、肺)的方法(Gold P、Goldenberg NA，MJM，346-66，1997)。
由于單克隆抗體生成技術(shù)的開發(fā)(Mab；Kohler G、Milstein C，Nature，25652-53，1975)，用于測量循環(huán)CEA的免疫測定法的特異性得到了改進，它們的使用得到了廣泛延伸。
多年來，還對CEA研究了作為特異引導放射性同位素用于體內(nèi)診斷(Goldenberg DM，Int J of Biol Markers，7183-188，1992)和原位放療(Ledermann等人，Int J Cancer，47659-664，1991)的可能“細胞靶”的情況。還預見了它引導毒素、藥物、和其它生物活性產(chǎn)品到腫瘤細胞的用途(Bagshawe KD，Drug Dev Res，34220-230，1995)。
抗CEA抗體已經(jīng)成為用于這些目的主要載體，最初是多克隆制劑，隨后是小鼠Mab、它們的Fab片段、通過遺傳工程由小鼠Mab獲得的抗體片段，以及最近由在絲狀噬菌體中展示的鼠和人抗體文庫獲得的抗體片段(Hammarstrom S等人，Cancer Res，494852-4858，1989；Hudson PJ，Curr Opinion Immunology，11548-557，1999；GriffithsAD等人，EMBO J，12725-734，1993；Griffiths AD等人，EMBO J，133245-3260，1994；WO93/11236；Chester K等人，1995，WO95/15341；Allen DJ等人，1996，US5872215)。
抗體和抗體片段在原核細胞像大腸桿菌和其它微生物中的表達在本領(lǐng)域已經(jīng)完全建立(Pluchthun A，Bio/Technology，9545-551，1991；Gavilondo J、Larrick JW，Biotechiques，29128-132，134-136，2000)?？贵w和抗體片段在高等真核細胞培養(yǎng)物中的表達對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員而言也是已知的(Reff ME，Curr Opinion Biotech，4573-576，1993；Trill JJ等人，Curr Opinion Biotech，6553-560，1995) 。
未區(qū)分地命名為CB-CEA.1或ior-CEA.1(下文稱為CB/ior-CEA.1)的小鼠Mab在本領(lǐng)域現(xiàn)階段是已知的。該Mab對人CEA具有高特異性，與諸如NCA等分子不具有不期望的交叉反應(yīng)性，也不識別正常組織，但普遍發(fā)現(xiàn)CEA在其中被極化的正常結(jié)腸上皮細胞除外(Tormo B等人，APMIS，971073-1080，1989)。該Mab對CEA具有很高親和力(PérezL等人，Applied Biochem Biotechnol，2479-82，1996)。用99mTc標記的該Mab已經(jīng)成功用于人結(jié)腸直腸腫瘤的診斷和監(jiān)測。放射性免疫檢測的臨床研究顯示它的靈敏度是91.3％，特異性是77.1％，而陽性預測值是82.8％(Oliva JP等人，Rev Esp Med Nucl，134-10，1994)。與目前世界上臨床用于這些目的的唯一的另一種抗CEA單克隆抗體CEA-Scan(99mTc-Arcitumomab，Immunomedics，Morris Plains，NJ，USA)相比，上述數(shù)值使得該Mab的性能更佳。
1992年報道了通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)由提取自生成MabCB/ior-CEA.1的雜交瘤的RNA開發(fā)單鏈Fv(scFv)抗體片段(Ayala M等人，Biotechniques，13790-799，1992)。在隨后的實驗策略中，使用兩個可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的簡并寡核苷酸進行了CB/ior-CEA.1可變結(jié)構(gòu)域的擴增。在大腸桿菌中生成了scFv，并在ELISA和細胞化學研究中證明了對CEA的識別，但是對固定化抗原的親和力比通過天然方法獲得的Fab低200倍(Pérez L等人，Applied Biochem Biotechnol，2479-82，1996)。這同一種scFv片段在Pichia pastoris中得到了克隆、表達、和生成(Freyre FM等人，J Biotechnol，76(2-3)157-163，2000)，但對人CEA的親和力沒有得到任何改進，而且使用放射性標記片段在實驗動物中進行的研究指示其生物分布異常(Pimentel GJ等人，Nucl MedCommun，221089-1094，2001)，因而沒有繼續(xù)其進一步開發(fā)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及通過DNA重組技術(shù)由抗癌胚抗原(CEA)單克隆抗體CB/ior-CEA.1(Tormo B等人，APMIS，971073-1080，1989)獲得的單價和二價(二體)形式的單鏈Fv(scFv)抗體片段。該Mab對CEA具有很高親和力(Pérez L等人，Applied Biochem Biotechnol，2479-82，1996)，而且已經(jīng)成功用于人結(jié)腸直腸腫瘤的診斷和監(jiān)測(OlivaJP等人，Rev Esp Med Nucl，134-10，1994)?？梢酝ㄟ^它們在重組微生物像細菌和酵母中的表達來生成本發(fā)明所報道的scFv單價和二體片段。就像最初的Mab一樣，scFv單價和二體片段對人CEA上依賴碳水化合物保守結(jié)構(gòu)的表位是特異的，并且展示對該抗原有高親和力。scFv單價和二體片段對人正常和腫瘤細胞和組織的體外識別模式與原始Mab相似，因此，一旦放射性標記，它們有能力鑒定在先天無胸腺小鼠中生長的、表達人CEA的腫瘤細胞。scFv單價和二體片段不具有Fc結(jié)構(gòu)域，分子量比小鼠Mab低，這使得它們在出于診斷或治療目的而應(yīng)用于人時有可能能更好的穿透體內(nèi)組織且免疫原性更低。
與先前由相同Mab開發(fā)的其它scFv相比，本發(fā)明所報道的scFv單價和二體片段在重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸中具有重要差異，并且在對CEA的親和力、識別細胞和組織的性能、以及定位在小鼠體內(nèi)生長的生成人CEA的腫瘤的功效方面更為優(yōu)越。
本發(fā)明所報道的重組scFv單價和二體片段是通過PCR以及重組微生物中的克隆和表達由提取自CB/ior-CEA.1雜交瘤的RNA開發(fā)的。使用與用于獲得先前報道的scFv(Ayala等人，Biotechniques，13790-799，1992)不同的寡核苷酸組擴增并分離編碼Mab VH和VL結(jié)構(gòu)域的堿基序列。與先前獲得的scFv相比，本發(fā)明顯示了新的單價和二體scFv在VH和VL結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中具有重要差異，包括VH結(jié)構(gòu)域框架區(qū)1(FR1)和3(FR3)及互補決定區(qū)2(CDR2)中的16個氨基酸，以及VL結(jié)構(gòu)域FR1和FR3中的3個氨基酸。這指示這些結(jié)構(gòu)域具有與先前報道(Ayala等人，Biotechniques，13790-799，1992)不同的克隆來源。在二體的情況中，它在構(gòu)建scFv型分子時所采用的聯(lián)合區(qū)段(接頭)的大小和氨基酸組成方面也與先前獲得的scFv不同。
這些變化在新片段的生物化學和生物學特性中得到了出人意料的反映，使它們的特性與Mab CB/ior-CEA.1非常相似，而且比先前報道的scFv優(yōu)越得多。除了可變結(jié)構(gòu)域中的上述氨基酸變化以外，與先前報道的scFv(Ayala等人，Biotechniques，13790-799，1992)具有相同接頭的新單價scFv片段對人CEA的親和常數(shù)比先前報道的scFv高得多。同樣，二體對人CEA的親和常數(shù)也優(yōu)于這兩種單價scFv形式。就CEA識別、腫瘤細胞和組織的鑒定、缺乏與NCA的交叉反應(yīng)性、以及在移植到小鼠中的生成人CEA的腫瘤中選擇性積累的能力而言，兩種新的scFv單價和二體片段保留了原始Mab的特異性特性，而且所有性能都比先前獲得的scFv優(yōu)越得多。
兩種新的單價和二體scFv的分子量分別比原始Mab低至少5倍和2.5倍，這一事實說明它們有可能在人體內(nèi)更好的穿透組織且免疫原性更低，從而在引導同位素、藥物、毒素、和其它生物活性元件指向表達人CEA的腫瘤方面比Mab CB/ior-CEA.1更有吸引力且可能更優(yōu)越。
本發(fā)明顯示了如何通過PCR使用與編碼信號肽和恒定結(jié)構(gòu)域CH1和Ck的堿基序列雜交的合成寡核苷酸擴增Mab CB/ior-CEA.1的VH和VL結(jié)構(gòu)域。還顯示了通過PCR有可能以這種順序裝配擴增得到的VH和VL結(jié)構(gòu)域，并獲得不同形式的scFv片段，操縱連接各個結(jié)構(gòu)域的接頭的大小。使用14個氨基酸構(gòu)建了單價scFv形式，將該數(shù)目降至5而生成了二體scFv型形式。
本發(fā)明證明了有可能在細菌大腸桿菌和酵母Pichia pastoris中表達單價和二價scFv片段，而且這些片段以特異方式在體外鑒定與腫瘤細胞有關(guān)或無關(guān)的人CEA。本發(fā)明還證明了放射性標記的單價和二體scFv鑒定在小鼠中長成腫瘤的表達人CEA的體內(nèi)腫瘤細胞，展示與MabCB/ior-CEA.1非常相似的性能，而且性能比先前獲得的scFv優(yōu)越得多。本發(fā)明還顯示了純化和鑒定這些新型scFv單價和二體片段的方法。
本發(fā)明所描述的抗體片段可用于癌癥的診斷和治療，優(yōu)勢在于它們衍生自已證明有臨床功效的Mab，其較小的分子量和Fc結(jié)構(gòu)域的缺乏使得它們能夠更好的穿透組織，而且因誘發(fā)人抗小鼠免疫球蛋白應(yīng)答的能力較低而能夠用于重復治療(HAMA；Schroff等人，Cancer Res，45879-885，1985；DeJager等人，Proc Am Assoc Cancer Res，29377，1988)。HAMA應(yīng)答因所施用抗體生物學效應(yīng)的中和、隨后的劑量降低、以及它們能夠引起變態(tài)反應(yīng)、“血清”病、和腎病而難以治療。
術(shù)語抗體及其特異片段該術(shù)語描述了免疫球蛋白或其具有抗原特異性的部分，它們是天然的，或者是部分或完全以合成方式生成的。該術(shù)語還覆蓋具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽或蛋白質(zhì)，所述結(jié)構(gòu)域?qū)⑹强贵w的結(jié)合位點或與其同源。它們可以是天然生成的，或者是部分或完全以合成方式生成的?？贵w的實例是不同類型和亞型的免疫球蛋白及其包含一個或多個抗原結(jié)合位點的片段，諸如Fab、scFv、Fv和二體。
抗體和抗體片段包括包含免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，它可以是天然的，或者是完全或部分通過合成生成的，還包括包含與其它多肽融合的免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其等同物的嵌合分子。
已經(jīng)顯示了完整抗體的片段能夠執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。這些結(jié)合片段的實例是(1)包含免疫球蛋白VL、VH、CL和CH1結(jié)構(gòu)域的Fab片段；(2)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fd片段；(3)由指定抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的Fv片段；(4)由指定抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域聯(lián)合肽接頭而構(gòu)成的scFv片段，所述肽接頭使得這兩個結(jié)構(gòu)域相連而形成抗原結(jié)合位點(Bird等人，Science，242423-426，1988；Huston等人，PNAS USA，855879-5883，1988)；(5)以與scFv相似的方式構(gòu)建成的二體、多價或多特異性片段，但是其中小型接頭不能使同一scFv分子上的VH和VL結(jié)構(gòu)域在其中相關(guān)聯(lián)，而是通過兩個或多個scFv的結(jié)合來形成抗原結(jié)合位點(WO94/13804；Holliger P等人，PNAS USA，906444-6448，1993)；(6)其它片段，像dAb(Ward SE等人，Nature，341544-546，1989)、分離的CDR區(qū)、F(ab′)2片段和雙特異性scFv二聚物(PCT/US92/09965；Holliger P、Winter G，Current OpinionBiotechnol，4446-449，1993；de Haard H等人，Adv Drug DeliveryRev，315-31，1998)。
可以只使用可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)建不含F(xiàn)c區(qū)的二體和scFv，從而潛在降低在施用于人時抗獨特型反應(yīng)的作用。它們還因能在大腸桿菌和重組酵母中生成而特別有用。它們的分子量小于完整免疫球蛋白，從而提高了組織穿透潛力。
抗體結(jié)合位點該術(shù)語描述了抗體中包含與所有抗原或其部分特異反應(yīng)的區(qū)域的部分。當抗原較大時，抗體可以只結(jié)合抗原的特定部分，命名為表位。抗體結(jié)合位點可以由一個或多個抗體可變結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。優(yōu)選的是，抗原結(jié)合位點包含抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)的可變區(qū)(或結(jié)構(gòu)域)。
特異性指抗體或其片段與除了其特異結(jié)合配偶以外的其它分子不展示顯著結(jié)合的情況。該術(shù)語還可用于抗原結(jié)合位點對許多相關(guān)或無關(guān)抗原中出現(xiàn)的特定表位是特異的情況，在這種情況中，結(jié)合位點將能夠結(jié)合攜帶此表位的數(shù)種抗原。
發(fā)明詳述通過本發(fā)明獲得了由一個或多個抗原結(jié)合位點形成的特異多肽分子，所述抗原結(jié)合位點來自對人CEA特異的小鼠Mab。根據(jù)構(gòu)建多肽分子的方式，將抗原結(jié)合位點裝配成單價、二價、和抗體片段的其它形式。
對人CEA特異的單價scFv片段形式的多肽分子展示對該抗原的親和常數(shù)是(5.0±0.4)×109L mol-1，其中包含通過14個氨基酸的聯(lián)合區(qū)段(接頭)以這種順序相連的VH和VL結(jié)構(gòu)域，氨基酸序列如SEQ ID NO16所示。
對人CEA特異的二價scFv片段(二體)形式的多肽分子展示對該抗原的親和常數(shù)是(2.8±0.3)×1010L mol-1，其中包含成對的兩個相同分子，每一個都是由通過5個氨基酸的聯(lián)合區(qū)段(接頭)以這種順序相連的VH和VL結(jié)構(gòu)域形成的，氨基酸序列如SEQ ID NO 17所示。
在本發(fā)明的另一個方面，單價和二體scFv片段不結(jié)合或以非顯著方式結(jié)合正常組織或來自下列正常組織的細胞肝、腎、肺、睪丸、血液、脾和胰腺。就結(jié)腸黏膜而言，單價和二體scFv片段只與腔內(nèi)分泌產(chǎn)物、以及某些腺體或頂端區(qū)反應(yīng)。單價和二體scFv片段與正常淋巴細胞和中性白細胞缺乏反應(yīng)性指示與NCA抗原無重要交叉反應(yīng)性(von Kleist S，Burtin P.，Immunodiagnosis of Cancer。Marcel Dekker.322-341，1979；Buchegger，F(xiàn).等，Int.J.Cancer 33643-649，1984)。
單價和二體scFv片段能與可溶解的CEA、吸附于固體表面的CEA或其生產(chǎn)細胞和腫瘤組織相關(guān)的CEA結(jié)合，其中人結(jié)腸直腸、乳房、肺、胰腺和胃癌尤為突出。單價和二體scFv片段及Mab CB/ior-CEA.1可結(jié)合可溶性人CEA和結(jié)合在固體表面的人CEA結(jié)合，結(jié)合方式與人CEA糖基化的保守性有關(guān)，顯示識別中涉及了此抗原的碳水化合物。
來自本發(fā)明所報道單價和二體scFv片段、保持了CEA結(jié)合能力、已報道的親和力、特異表位識別能力和與本發(fā)明所述片段相似和相當?shù)纳飳W和生化特性的多肽分子被認為是同等的變體形式，也包含于本發(fā)明范圍內(nèi)。這些多肽分子可采取其它重組抗體片段的形式，諸如VL結(jié)構(gòu)域在VH之前的scFv，或Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Facb、三聚體和四聚體scFv等(Winter G，Milstein C，Nature 349293-299，1991；WO94/13804；de Haard，H等，Adv.Drug Delivery Rev.315-31，1998)，并使用了本領(lǐng)域中已知的其它聯(lián)接區(qū)段(接頭)。這些多肽分子還可以采取雙特異抗體分子的形式，其中一部分保留了對CEA的特異性，另一部分具有不同的特異性。
本發(fā)明同樣程度地包含符合以上段落所述特性的單價和二體scFv片段的變體形式，來自所謂的“免疫原性減小了的人源化”，其中可變區(qū)中存在的B和T細胞表位以未改變抗原識別的方式被修飾，但人體內(nèi)所產(chǎn)生分子的免疫原性被降低了，如文獻中所示的Carr FJ等，2000EP983303A1和Rodriguez Perez R等，US5712120-A。本發(fā)明中同樣包含的變體形式是由所謂“CDR移植物”所產(chǎn)生的變體形式，其中一種抗體的CDR序列被放置在并非來自此抗體的序列框架內(nèi)，如文獻EP-B_0239400、EP-A-184187、GB2188638A或EP-A-239400中所述，并保持以相似的親和力結(jié)合CEA的能力、競爭能力、特異表位識別能力和與本發(fā)明所述單價和二體scFv片段相似和同等的生物學和生化特性。
除了抗體序列外，本發(fā)明中所含的抗體分子可包含構(gòu)成肽或多肽的其它氨基酸，或?qū)⒉煌贑EA抗原結(jié)合的功能特性添加到分子中的其它氨基酸，作為如純化或鑒別的標簽、酶或其片段、生物學反應(yīng)調(diào)節(jié)物、毒素或藥物，等等。
依照本發(fā)明，單價和二體scFv片段可以分離或純化的形式施用。
本發(fā)明預見了一些上述多肽分子用作表達CEA的多種類型人癌癥的診斷試劑的用途，例如結(jié)腸癌、肺癌、乳癌或其它腺癌。
特異于上述CEA的多肽分子可被放射性標記并用作成像試劑從而以特定方式證實在人體內(nèi)表達CEA的腫瘤的存在和位置。本發(fā)明提供了測定表達CEA的細胞或腫瘤的存在情況的方法，包括將上述多肽分子與這些細胞接觸并測定它們與細胞的結(jié)合。此方法可用于體內(nèi)，或取自身體的細胞樣品，即體外或離體進行。
本發(fā)明提供了上述多肽分子與人CEA結(jié)合的方法。此結(jié)合可發(fā)生在體外、離體或體內(nèi)。如果結(jié)合發(fā)生在體內(nèi)，此方法可包括將多肽分子施用于哺乳動物，可以是一個或數(shù)個個體。正如此處實驗所證實的，本發(fā)明的單價和二體scFv片段與被轉(zhuǎn)染小鼠腫瘤細胞所表達的人CEA結(jié)合，所說的腫瘤細胞一旦被移植到小鼠體內(nèi)就會長成腫瘤，這為具有特異結(jié)合性的分子及其特性的研究、調(diào)查和開發(fā)提供了有用的實驗?zāi)Ｐ汀?br> 所述抗體對細胞樣品的反應(yīng)性可通過任何合適的方式進行探測。用個別報道分子進行標記是其中的一種可能性。報道分子可產(chǎn)生能被直接或間接檢測且優(yōu)選被測量的信號。報道分子的偶聯(lián)可以是直接或間接的、共價或非共價的。通過肽鍵進行的聯(lián)接可由偶聯(lián)抗體和報道分子的基因融合體的重組表達產(chǎn)生。確定偶聯(lián)的方式不是本發(fā)明的特征，本領(lǐng)域的技術(shù)熟煉人員能根據(jù)其偏愛和綜合知識選擇適當模型。
當放射性核素如125I、111In或99mTc被用于標記單價和二體scFv片段及其同等物時，如果這些核素優(yōu)選定位于腫瘤內(nèi)而非正常組織中，腫瘤組織中放射性標記的存在情況可用伽馬攝相機進行探測和定量。所獲腫瘤影像的質(zhì)量與信號背景的比率直接相關(guān)(Goldenberg DM，Int.J.ofBiol.Markers 1992，7；183-188)。本文中以125I的實驗性使用為例作了說明。
本發(fā)明還提供了有關(guān)的基本原則，以便單價和二體scFv片段及其上述等同變體形式在某些情況下，例如與具有治療效力的分子偶聯(lián)、綴合或結(jié)合時或作為重組融合蛋白產(chǎn)生時可用作治療試劑。依照本發(fā)明，單價和二體scFv片段及其同等變體形式可用于將毒素、放射性、T和NK細胞或其它分子定向于表達CEA的腫瘤，或在生物體內(nèi)產(chǎn)生能導致預期治療效應(yīng)的抗獨特型反應(yīng)。與此相一致的是，本發(fā)明的其它方面涉及治療方法的有關(guān)要素，包括將單價和二體scFv片段或其等同應(yīng)變體形式作為藥物或藥用組合物施用。
依照本發(fā)明，組合物優(yōu)選以“治療有效”量施用于個體，在至少改善一個癥狀的方面足以證實對病人是有益的。所施用劑量、頻率和施用時間間隔的有關(guān)細節(jié)取決于待治療疾病的特性和嚴重性，專家和其它醫(yī)生負責作出這些決定。合適的抗體劑量是本領(lǐng)域眾所周知的(LedermannJ.A.等，Int J.Cancer 47659-664，1991；Bagshawe KD等，抗體、免疫結(jié)合和放射性藥物4915-922，1991)。
組合物可以單獨施用或與其它療法聯(lián)合同時或相繼施用，還取決于待治療的疾病。
與本發(fā)明相符且按本發(fā)明應(yīng)用的藥用組合物除了活性成分外，還可以包括賦形劑、緩沖液、穩(wěn)定劑或可接受的藥用載體、或本領(lǐng)域技術(shù)熟煉人員眾所周知的其它材料。這些材料應(yīng)該無毒，不干擾活性成分的功效，而它們的確切特性可取決于施用的途徑，可以是口服或注射，例如靜脈內(nèi)注射。
符合本發(fā)明的scFv單價和二體片段及其等同變體形式可通過編碼核酸的表達產(chǎn)生。編碼任何這些前述多肽分子的核酸是本發(fā)明的一部分，因為其中包括這些核酸表達的方法。在不同的實施方案中，所說的核酸可編碼SEQ ID No.16和17中所示的氨基酸序列。
為了重組表達單價和二體scFv及其等同變體形式，可選擇或構(gòu)建合適的載體，該載體具有適當?shù)恼{(diào)控序列，包括啟動子、終止子、增強子、聚腺苷酸化信號、標記基因和其它適當?shù)男蛄小］d體可以是質(zhì)粒?？墒褂迷S多已知的核酸操作方法和技術(shù)，例如，核酸構(gòu)建體的制備、聚合酶鏈式反應(yīng)、誘變、測序、將DNA引入細胞和基因表達、蛋白質(zhì)分析，以及許多文獻中詳述的其它方法，如分子克隆實驗室手冊；第二版，Sambrook等，冷泉港實驗室出版社，1989或分子生物學簡要方法，第二版，Ausubel等編輯，John Wiley&Sons，1992或Erlich HA PCR技術(shù)，Stockton出版社，1989。這些文獻中的公開內(nèi)容均在此收編作為參考。
本發(fā)明的另一方面提供了含外源核酸的宿主細胞和在這些宿主細胞中引入所說核酸的方法。核酸的引入可應(yīng)用已知用于此目的的任何技術(shù)。對于細菌和酵母細胞而言，此技術(shù)可以是電穿孔。核酸引入后可刺激或允許核酸的表達，例如，在對基因表達有利的條件下培養(yǎng)宿主細胞。在某實施方案中，本發(fā)明的核酸整合入宿主細胞的基因組中。
在產(chǎn)生后，單價和二體scFv片段及其等同變體形式可以此處所展現(xiàn)的任何形式使用，諸如作為藥物組合物的形式、或診斷產(chǎn)物，或如上所述用于一套試劑中，其中除了特異結(jié)合成分外，還包含一種或多種試劑以測定所說成分與細胞或未聯(lián)接細胞的CEA的結(jié)合。
本發(fā)明的其它方面及其有關(guān)認識對于本領(lǐng)域?qū)＜叶允秋@而易見的。為了對本發(fā)明有完整的了解，且不限制其范圍和影響，本文提供了以下實施例。參照以下圖表附圖簡述

圖1展示了用于在大腸桿菌中表達單價scFv和二體的pJG-1m載體的示意圖。對應(yīng)于用寬水平條標記的載體區(qū)展示了片段克隆位點、c-myc肽、六組氨酸結(jié)構(gòu)域、以及一些結(jié)構(gòu)域間和結(jié)構(gòu)域后區(qū)域的堿基序列(SEQ ID NO13)。
圖2展示了由(1)單價scFv片段(SEQ ID NO 16)和(2)二價片段(二體)(SEQ ID NO 17)的核苷酸序列推導的氨基酸序列(單字母密碼)的比對。兩個構(gòu)建物中的結(jié)構(gòu)域順序都是VH-接頭區(qū)段-VL。兩個分子中所采用的接頭區(qū)段的氨基酸以粗體出現(xiàn)。
圖3通過間接免疫熒光技術(shù)例示了(A)Mab CB/ior-CEA.1、(B)單價scFv、和(C)二體對培養(yǎng)腫瘤細胞AsPC-1(ATCC CRL-1682)中表達的CEA的識別。在A、B、和C中，觀察到了特征性的膜和附近細胞質(zhì)的熒光。放大倍數(shù)是200x。
圖4展示了二體的蛋白水解消化的層析圖譜和通過質(zhì)譜獲得的胰蛋白酶肽的命名。上圖二體胰蛋白酶消化的層析圖譜。下圖二體胰蛋白酶肽命名的概述表。m/z實驗值實驗分子量；m/z理論值理論分子量；Z電荷。在得到的質(zhì)譜中，沒有檢測到對應(yīng)于不正確接頭半胱氨酸的信號。
圖5概述了對二體(SEQ ID NO 21)氨基酸序列的驗證。以粗體概述了通過質(zhì)譜得到確認的蛋白質(zhì)序列區(qū)，而胰蛋白酶消化后未能回收的序列區(qū)域以斜體出現(xiàn)。粗體區(qū)域完全符合由二體堿基序列推導的氨基酸序列。在C端部分還看到了由pJG-1m載體(圖1)提供的c-myc肽和最后六個組氨酸的序列。
圖6展示了給攜帶表達人CEA的腫瘤的小鼠接種用125I放射性標記的下列分子24小時后(條紋柱)和48小時后(無條紋柱)每克組織中注射劑量的百分比由左至右，以四條雙柱分組(a)二體、(b)scFv、(c)F3、和(d)Mab CB/ior-CEA.1。每條柱代表由得自12只小鼠的器官回收的計數(shù)的平均值。結(jié)果證明在24和48小時之間，二體、scFv、和Mab維持腫瘤中的放射性血液中的放射性的高比率，后者維持的比值最高，然后是二聚體分子。F3顯示很低的比值，體內(nèi)性能不足，這可能與它對CEA的親和力較低有關(guān)。
收入本文提及的所有文件作為參考。
實施例1.Mab CB/ior-CEA.1可變結(jié)構(gòu)域的PCR擴增、克隆和測序2.scFv和二體的裝配、在大腸桿菌中的表達以及它們識別人CEA的證明3.scFv和二體在Pichia pastoris中的表達以及它們識別人CEA的證明4.細菌中產(chǎn)生的scFv和二體的純化5.通過蛋白水解和質(zhì)譜對二體進行定性分析
6.去糖基化CEA識別的研究7.在正常組織和腫瘤組織中進行的免疫細胞化學和組織化學研究8.親和常數(shù)的測定9.測定在攜帶因接種B16-CEA13細胞所誘發(fā)的腫瘤的C57BI/6小鼠中125I所標記的片段和抗體的體內(nèi)特異識別實施例1.Mab CB/ior-CEA.1可變結(jié)構(gòu)域的PCR擴增、克隆和測序步驟(a) RNA的純化和可變區(qū)的擴增用TriPureTM試劑(Boehringer-Mannheim)提取來自106個小鼠雜交瘤CB/ior-CEA.1細胞的總RNA(Tormo B等，APMIS.971073-1080，1989)。以寡dT作為引物，用來自RT-PCR試劑盒(Boehringer-Mannheim)的第一鏈cDNA合成系統(tǒng)合成互補DNA(cDNA)。用聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(PCR)特異擴增重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。依照Kabat E等人的報道(US Department of Health and HumanServices，NIH，1991)以及該實驗室先前所進行的實驗(Coloma，MJ等，Biotechniques11152-156，1991)，以小鼠IgG和kappa鏈的共有序列為基礎(chǔ)設(shè)計所應(yīng)用的合成引物。PCR中所用的寡核苷酸序列如表1所示。
表1.用于Mab CB/ior-CEA.1重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)編碼序列的PCR擴增的合成寡核苷酸。
重鏈寡核苷酸1.VH的信號肽(SEQ ID No.1)5′...GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT...3′寡核苷酸2.CH1區(qū)(SEQ ID No.2)5′...AYCTCCACACACAGGRCCAGTGGATAGAC...3′輕鏈寡核苷酸3.VL的信號肽(SEQ ID No.3)5′...GGGGATATCCACCATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA...3′
寡核苷酸4.Ck恒定區(qū)(SEQ ID No.4)5′...ACTGGATGGTGGGAAGATGGA...3′使用了PCR Core試劑盒(Boehringer-Mannheim)進行PCR。PCR的條件為94℃變性1分鐘，55℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，進行25個循環(huán)，最后一個循環(huán)延伸后再以同樣溫度延伸5分鐘，所有循環(huán)均在MJ Research Minicycler裝置中進行。反應(yīng)終體積為100μL。使用的所有寡核苷酸的終濃度是1μM。
用QIAquick凝膠提取試劑盒(QIAGEN，GmbH)在低熔點瓊脂糖凝膠(Sigma)中純化具有約320-530bp預期大小的DNA擴增片段，并獨立克隆入設(shè)計成DNA片段“平端”克隆的pMOS載體(AmershamPharmacia Biotech)中。
步驟(b).可變區(qū)的核苷酸序列為了測定克隆入載體pMOS的輕鏈和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列，使用了制造商所推薦的寡核苷酸(Amersham Pharmacia Biotech)。用Pharmacia的ALFexpress II裝置(Amersham Biosciences)和“ThermusSequences 5 Cy Terminator Kit”通過自動化的方式獲得堿基序列。分別選擇質(zhì)粒pVL2和pVH5作為VL和VH序列的代表。
實施例2.scFv和二體的裝配、在大腸桿菌中的表達以及它們識別人CEA的證明步驟(a).可變區(qū)的再擴增以及scFv和二體的裝配用PCR將質(zhì)粒pVH5和pVL2中所包含的VH和VL結(jié)構(gòu)域裝配成scFv和二體的形式。
以質(zhì)粒pVH5和pVL2中的VH和VL序列為基礎(chǔ)設(shè)計合成的寡核苷酸。這些包括用于載體pJG-1m中克隆和摻入14個氨基酸和5個氨基酸長的接頭片段以供單體scFv和二體裝配的限制性位點(表II和III)。
表II.用于scFv和二體片段構(gòu)建的連接區(qū)段(接頭)的氨基酸序列。
scFv -接頭L1EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID No.5)
二體.-接頭L2GGGGS(SEQ ID No.6)表III.用于scFv和二體裝配PCR中的合成寡核苷酸。
寡核苷酸5ApaL1-FR1 VH(SEQ ID No.7)5′...TCTCACAGTGCACAGGAAGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGG...3′寡核苷酸614個氨基酸長的接頭/FR4 VH(SEQ ID No.8)5′...GTCGACTTTGGATTCGGAGCCTGATCCTGAGGATTTACCCTCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT...3′寡核苷酸714個氨基酸長的接頭/FR1 VL(SEQ ID No.9)5′...GAGGGTAAATCCTCAGGATCAGGCTCCGAATCCAAAGTCGACGACATTGTGATGACCCAGTC...3′寡核苷酸8NotI-FR4 VL(SEQ ID No.10)5′...AAGGAAAAAAGCGGCCGCTTTCAGCTCCAGCTTGGTT...3′寡核苷酸95個氨基酸長的接頭/FR4 VH(SEQ ID No.11)5′...AGAGCCGCCGCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT...3′寡核苷酸105個氨基酸長的接頭/FR1 VL(SEQ ID No.12)5′...GGTGGCGGCGGCTCTGACATTGTGATGACCCAGTCT...3′為了裝配片段，第一步先進行獨立的PCR擴增1.對于會產(chǎn)生單價scFv的結(jié)構(gòu)域-反應(yīng)1用質(zhì)粒pVH5為模板，寡核苷酸5和6為引物(表III)。反應(yīng)2用質(zhì)粒pVL2為模板，寡核苷酸7和8為引物(表III)。
2.對于會產(chǎn)生二體的結(jié)構(gòu)域-反應(yīng)3用質(zhì)粒pVH5為模板，寡核苷酸5和9為引物(表III)。反應(yīng)4用質(zhì)粒pVL2為模板，寡核苷酸8和10為引物(表III)。
PCR所用的條件和試劑上文已有描述。所有使用的寡核苷酸的終濃度均為1μM。
為進行scFv的裝配，進行新的PCR，即將4μL的反應(yīng)溶液1和反應(yīng)溶液2與終濃度1μM的寡核苷酸5和8(表III)以及終濃度0.01μM的寡核苷酸6和7(表III)混合。
為進行二體的裝配，進行新的PCR，即將4μL的反應(yīng)溶液3和反應(yīng)溶液4與終濃度1μM的寡核苷酸5和8(表III)以及終濃度0.01μM的寡核苷酸6和7(表III)混合。
如先前所述，檢測所擴增DNA片段主要為約700bp的條帶，并從低熔點瓊脂糖凝膠中分離此條帶。
步驟(b).克隆入pJG-1m載體中。
載體pJG-1m是設(shè)計成在大腸桿菌周質(zhì)中表達抗體片段的質(zhì)粒(圖1)。它的主要元件有LacZ啟動子、信號肽、用于插入基因片段的限制性酶切位點ApaL I和Not I、c-myc肽和編碼6個組氨酸的序列。最后一個元件用作通過固定化金屬離子親和層析進行表達產(chǎn)物純化的標簽(IMAC；Porath J.Port.Expr.Purif.3263-281，1992)。用于將所述scFv克隆入載體的限制性酶切位點堿基序列和被添加入scFv的C-末端氨基酸的堿基序列如圖1所示(SEQ ID No.13)。
用ApaL I和Not I(Promega)限制性內(nèi)切酶消化相應(yīng)于scFv和二體的DNA片段以及pJG-1m載體，并用T4 DNA連接酶(Promega)獨立連接各條帶和載體。用電穿孔將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細胞(XL-1 Blue菌株；Stratagene)，將所轉(zhuǎn)化的細胞在固體選擇性培養(yǎng)基(LB瓊脂，含100μg/mL氨芐青霉素)中37℃培養(yǎng)16小時。所用的方法參見分子克隆，實驗室手冊，第二版，Sambrook，F(xiàn)ritsch，Maniatis.1989。
從數(shù)個菌落中純化質(zhì)粒DNA后選擇重組的質(zhì)粒(QIAGENMiniPrep試劑盒)，用針對預期連接產(chǎn)物已描述的限制性內(nèi)切酶進行消化來做相應(yīng)的檢查。在限制性酶切分析中，得到相應(yīng)于線性化載體的約3.5kb的條帶和相應(yīng)于scFv和二體抗體片段編碼基因的約700bp的條帶。
通過前述步驟，用特異地設(shè)計成從外部與載體pJG-1m克隆區(qū)雜交的引物(表IV)對各構(gòu)建體的5個克隆進行測序。
表IV.經(jīng)PCR裝配并克隆入載體pJG-1m中的scFv和二體堿基測序的合成寡核苷酸。
寡核苷酸11.(SEQ ID No.14)5′...GTTGTTCCTTTCTATTCTCAC...3′
寡核苷酸12.(SEQ ID No.15)5′...CTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTC...3′衍生自單價scFv(克隆pJG1m-25)和二體(克隆pJG1m-18)堿基序列的氨基酸序列如圖2所示(SEQ ID No.16和SEQ ID No.17)。相對于先前所研究出的scFv(Ayala M等，Biotechniques13790-799，1992)，現(xiàn)在獲自新的單價scFv和二體的VH和VL序列在VH FR1、CDR2和FR3結(jié)構(gòu)域內(nèi)顯出有16個不同的氨基酸，在VL FR1和FR3結(jié)構(gòu)域內(nèi)顯出有3個不同的氨基酸。
這些結(jié)果顯示，用于構(gòu)建新的單價scFv和二體、擴增和克隆自雜交瘤CB/ior-CEA.1的可變結(jié)構(gòu)域可來自與先前所報道的scFv克隆擴增中所用RNA不同的RNA。
新的單價scFv的接頭區(qū)段與先前所報道的scFv的接頭區(qū)段相同。新的二價scFv(二體)的連接區(qū)段與先前所獲得的scFv的連接區(qū)段不同，因為它只包括5個氨基酸。在這些實驗中也證實了接頭區(qū)段L1和L2的序列，如表II中所示。
步驟(c)用SDS-PAGE和Western印跡法證實scFv和二體在大腸桿菌中的表達用含兩種抗體片段信息的質(zhì)粒pJG1m-25和pJG1m-18獨立轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細胞。此菌株允許異源蛋白質(zhì)在周質(zhì)中表達或分泌到培養(yǎng)基中。
將被轉(zhuǎn)化的細菌鋪于固體選擇性培養(yǎng)基上并在37℃培養(yǎng)16小時。將兩個構(gòu)建體各自的代表性菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD530nm＝1，在培養(yǎng)基中加入1mM IPTG誘導12小時。將細胞離心，并用滲壓休克法和短暫的超聲處理(數(shù)秒)分離細胞周質(zhì)成分，用于在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上進行電泳分析。此試驗顯示了在兩個構(gòu)建體中有預期分子大小(約27kDa)的蛋白質(zhì)表達，隨后用Western印跡法對此進行了檢驗，檢驗中使用特異于此蛋白質(zhì)所含之c-myc肽的Mab(9E10)作為一抗，隨后使用與辣根過氧化物酶綴合的兔抗鼠IgG抗體(Sigma)。蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠向Hybond C Extra硝酸纖維素膜的轉(zhuǎn)移在半干的轉(zhuǎn)移裝置(BioRad)上進行。在顯影中使用了DAB(Sigma)不溶性底物。
對于兩個構(gòu)建體，用Mab 9E10鑒別到了具有所述大小的重組蛋白質(zhì)。
步驟(d)用ELISA檢驗scFv和二體對人CEA的特異識別用濃度1μg/mL的人CEA(Calbochem219369)包被聚乙烯平板(Costar，96孔乙烯檢測平板)進行ELISA檢驗。在用脫脂牛奶封閉平板后，加入以1∶5、1∶10和1∶20稀釋于PBS-2％脫脂牛奶中、相應(yīng)于兩種構(gòu)建體的細菌周質(zhì)樣品，并在室溫保溫2小時。
為了檢測片段與CEA的連接，使用了Mab 9E10(1μg/mL)，隨后用來自Sigma的與過氧化物酶綴合的鼠抗鼠IgG抗體。洗滌數(shù)次后，將OPD(Sigma)和H2O2作為生色團和底物用于使反應(yīng)液呈色，在LabSystem Multiskan MS中492nm波長處讀數(shù)，以對反應(yīng)液進行定量分析。
在此檢測中，將Mab CB/ior-CEA.1用作陽性對照。將經(jīng)無插入片段的載體pJG-1m轉(zhuǎn)化的TG1細胞的周質(zhì)部分和不相關(guān)Mab作為陰性對照。此外，用以下無關(guān)抗原包被平板10μg/mL牛血清白蛋白(BSA，Sigma)、10μg/mL卵清蛋白、10μg/mL溶菌酶、10μg/mL匙孔血藍蛋白(Sigma)。所有平板上都包括了只放置無抗原的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(空白)的孔。吸收值至少比陰性對照所產(chǎn)生吸收值大4倍的樣品被認為是陽性的。
在這些實驗中，scFv和二體構(gòu)建體的周質(zhì)樣品就其識別吸附在聚乙烯板上的人CEA的能力而言的結(jié)果是陽性的。這些相同樣品對所有無關(guān)抗原是陰性的。
步驟(e)在ELISA和間接免疫熒光中通過scFv和二體識別與細胞有關(guān)聯(lián)的人CEA將所有在培養(yǎng)物中表達CEA的人腫瘤細胞系LoVo(ATCCCCL-229)、AsPC-1(ATCC CRL-1682)和LS 174T(ATCC CL-188)接種于96孔聚乙烯板(Costar)上。一旦細胞匯合，用PBS將孔漂洗兩次，傾去溶液，在空氣中晾干。然后用1∶1混合的冷丙酮-甲醇將細胞固定于塑料制品上3分鐘。用蒸餾水漂洗數(shù)次除去殘余物后，平板用作ELISA檢測中的固相，其中加入了按1∶2、1∶8和1∶16稀釋于PBS-2％脫脂奶中的相應(yīng)于兩個構(gòu)建體的細菌周質(zhì)樣品，在室溫保溫2小時。漂洗數(shù)次后，使用Mab 9E10(1μg/mL)，然后使用綴合了過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體(Sigma)檢測片段與CEA的聯(lián)接。漂洗數(shù)次后，用生色團OPD(Sigma)和作為底物的H2O2使反應(yīng)顯色，用LabSystems MultiskanMS閱讀儀在492nm波長處對反應(yīng)物進行定量分析。為進行閱讀步驟，將上清轉(zhuǎn)移到新鮮平板上。在檢測中將Mab CB/ior-CEA.1用作陽性對照。將相應(yīng)于用無插入片段的載體pJG-1m所轉(zhuǎn)化的TG1細胞的周質(zhì)部分和無關(guān)Mab用作陰性對照。具有不表達CEA的人細胞HEK293(ATCCCRL-1573)的平板也用作陰性對照。陽性的標準與先前步驟中所述ELISA中用的標準相似。
在此實驗中，scFv和二體構(gòu)建體的周質(zhì)樣品只識別LoVo、AsPC-1和LS 174T細胞。所有的陰性對照都是陰性的。用這種方式，證實了scFv和二體通過細胞-ELISA對固定于聚苯乙烯板上的表達此抗原的人腫瘤細胞上的人CEA進行鑒定的能力。
在另一實驗中，將LoVo、AsPC-1和LS 174T細胞接種于35mm直徑的聚苯乙烯板(COSTAR)上并培養(yǎng)至細胞匯合。用PBS漂洗平板兩次，傾去溶液，在空氣中晾干，然后用1∶1混合的冷丙酮-甲醇將細胞固定于塑料制品上。用蒸餾水漂洗數(shù)次以除去殘余物后，將平板用作間接免疫熒光檢測中的固相。為了進行此檢測，在表面上以固定化小室確定一些環(huán)形區(qū)域，在其中將相應(yīng)于兩個構(gòu)建體的細菌周質(zhì)樣品以1∶2、1∶4和1∶8稀釋于PBS-3％BSA中的稀釋液獨立進行保溫。使用了與細胞-ELISA中所用同樣的陽性和陰性對照。
在潮濕的容器內(nèi)室溫(RT)保溫1小時，然后用冷的PBS-3％BSA漂洗數(shù)次，添加Mab 9E10(10μg/mL)至所有的單層細胞上，仍在潮濕的容器中室溫保溫1小時。用冷PBS-3％BSA漂洗數(shù)次后，將單層細胞與綴合了異硫氰酸熒光素(FITC，Sigma)并1∶64稀釋于PBS-3％BSA的抗小鼠IgG抗體在黑暗潮濕的容器中保溫30分鐘，然后用PBS-3％BSA漂洗5次，再用PBS洗一次，最后用Evans Blue溶液染色幾分鐘。
用BS-10％甘油覆蓋細胞單層，用蓋玻片封閉，然后用安裝在Olympus BHT顯微鏡中的熒光附件Olympus BH2-RFL進行檢測。HEK293人細胞培養(yǎng)平板也用作陰性對照。在膜和細胞質(zhì)中出現(xiàn)蘋果綠熒光被確定為陽性結(jié)果的標準，條件是這種現(xiàn)象不會出現(xiàn)于陰性對照樣品中或?qū)EA呈陰性的人細胞中。
在此實驗中，scFv和二體構(gòu)建體的周質(zhì)樣品只識別LoVo、AsPC-1和LS 174T細胞。陰性對照的結(jié)果是陰性的。用這種方式證實了利用scFv和二體通過間接的免疫熒光鑒定固定于聚苯乙烯板上的表達此抗原的人腫瘤細胞上的人CEA的能力。實施例的結(jié)果如圖3所示。
實施例3.scFv和二體在Pichia pastoris中的表達和它們識別人CEA的證明步驟(a)scFv和二體的再擴增以及在載體pPS7中的克隆分別以構(gòu)建體pJG1-25和pJG1-18為模板，通過PCR擴增編碼scFv和二體的基因，所用寡核苷酸設(shè)計成在基因的5’和3’末端添加NcoI位點(寡核苷酸13和14；表V)，其目的是克隆入Phchia pastoris表達載體pPS7中。擴增的步驟與先前所述的相同。質(zhì)粒pPS7是整合載體，包含相應(yīng)于醇氧化酶(AOX.1)啟動子的1.15kb片段，隨后是編碼釀酒酵母蔗糖轉(zhuǎn)化酶(sucII)分泌信號的基因、NcoI單克隆位點、保證轉(zhuǎn)錄完成的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapt)960bp片段以及作為選擇標記的釀酒酵母HIS3基因。另外此載體還包含一2.1kb片段，相應(yīng)于AOX.1基因的3’序列。所有這些元件均被插入載體pUC18中(Herrera Martinez LS等，EP0438200 A1)。
表V.在擴增和修飾編碼VH最初幾個堿基和VL最后幾個堿基的序列、在pPS7載體中克隆scFv和二體以及這些克隆測序的PCR中應(yīng)用的合成寡核苷酸。
寡核苷酸13.NcoI-FR1 VH(SEQ ID No.18)
5′...CATGCCATGGGGAATCCGAAGTGAAGCTGGTGGAG...3′寡核苷酸14.NcoI-6個組氨酸(反義)(SEQ ID No.19)5′...CATGCCATGGATCCCGGGGTGATGGTGATGGTGATG...3′寡核苷酸15.醇氧化酶pAOX.1啟動子(SEQ ID No.20)5′...GACTGGTTCCAATTGACAAGC...3′在用NcoI(Promega)消化相應(yīng)于scFv和二體的擴增條帶后，將它們分別與事先已用此酶消化的載體pPS7連接，連接產(chǎn)物以獨立的方式轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL-1Blue菌株中。用菌落PCR分析相應(yīng)于各重組載體轉(zhuǎn)化的菌株的分離菌落，所用引物中的一個與啟動子雜交(寡核苷酸15，表V)，而另一個與VL的3’末端雜交(寡核苷酸8，表III)。選擇包含插入方向正確的片段的菌落。依照先前所述的步驟(實施例1步驟b)用寡核苷酸15(表V)進行克隆基因的測序。獲自重組質(zhì)粒pPSM2(scFv)和pPSM3(二體)VH和VL結(jié)構(gòu)域的序列與先前在SEQ ID No.16和SEQID No.17所列舉的序列一致。
事先用限制性酶PvuII(Promega)消化兩種已提及的質(zhì)粒，通過電穿孔轉(zhuǎn)化MP36his3野生型菌株，并在組氨酸缺陷型基本培養(yǎng)基上進行選擇，由此獲得具有這兩種質(zhì)粒的Pichia pastoris重組菌株。由于在Pichiapastoris基因組中具有特異位點的重組質(zhì)粒的重組機制不同，對于每個構(gòu)建體而言可能分離到兩個不同表型的分泌菌株(a)在重組過程中AOX.1基因不受影響，并因此在甲醇培養(yǎng)基中生長且長勢與野生型菌株相似的菌株(Mut+)，和(b)其中的AOX.1基因被表達盒取代且在甲醇存在時顯示生長較慢的菌株(Mut s)。
步驟(b)表達研究對抗體片段表達的研究是從生長于選擇性MD培養(yǎng)基(酵母氮堿、生物素、葡萄糖)平板中的原養(yǎng)型菌落His+開始。將所選擇的菌落在50mL試管內(nèi)接種于10mL富BMGY的緩沖培養(yǎng)基(酵母提取物、蛋白胨、磷酸鉀、酵母氮堿、生物素和甘油)中，28℃150rpm旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。當培養(yǎng)物以SPECTRONIC GENESIS 2裝置檢測到600nm處的吸收值達到2個OD單位時，將這些培養(yǎng)物用2000rpm離心10分鐘。將細胞沉淀懸浮于以甲醇(BMMY)代替甘油作為唯一碳源的10mL豐富培養(yǎng)基中。從此刻開始在96個小時內(nèi)每天在培養(yǎng)物中添加純甲醇至終濃度達到1％，誘導目的蛋白質(zhì)。用無插入片段的載體所轉(zhuǎn)化的MP36his3菌株被用作陰性對照。
培養(yǎng)結(jié)束后，將細胞離心，收集在誘導階段代謝產(chǎn)生的培養(yǎng)基，再次離心使其最終變得澄清，在15％SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠中進行電泳以檢測scFv或二體。此檢測顯示了在兩種情況下均有符合預期分子量(約27kDa)的蛋白質(zhì)表達，這一點后來通過Western印跡法，以Mab 9E10為一抗，綴合了辣根過氧化物酶的兔抗鼠IgG抗體(Sigma)為二抗進行了檢測。如上所述進行轉(zhuǎn)膜。在顯色過程中，用DAB(Sigma)作為不溶性底物。對于所說的兩種構(gòu)建體，用Mab 9E10鑒定重組蛋白質(zhì)。
步驟(c)在ELISA中scFv和二體對人CEA的識別ELISA檢測與先前所述用于大腸桿菌來源材料的ELISA非常相似，其中用相似的固相、試劑以及包被、保溫、顯影和陽性對照條件。將被誘導的重組菌株的代謝培養(yǎng)物樣品稀釋于PBS-1％牛奶中，以100μL/孔的量添加到各孔中，室溫保溫2小時。將相應(yīng)于菌株MP36his3的代謝培養(yǎng)基和無關(guān)Mab用作陰性對照。當吸收值比陰性對照所產(chǎn)生的值至少大4倍時，此樣品被認為是陽性的。
在此實驗中，表達于Pichia pastoris中的scFv和二體構(gòu)建體誘導階段代謝培養(yǎng)基樣品對于其吸附于聚苯乙烯板上的人CEA的識別能力而言是陽性的。
步驟(d)用細胞-ELISA和間接免疫熒光識別與細胞相關(guān)聯(lián)的人CEAELISA檢測與先前所述用于大腸桿菌來源材料的ELISA非常相似，其中用相似的固相、試劑以及包被、保溫、顯影和陽性對照條件。將被誘導的重組菌株的代謝培養(yǎng)物樣品稀釋于PBS-2％牛奶中并添加到固定有LoVo、AsPC-1和LS 174T細胞的平板中，室溫溫和攪拌2小時。在檢測中將Mab CB/ior-CEA.1用作陽性對照。將用無插入片段的載體pPS7轉(zhuǎn)化過的菌株MP36his經(jīng)過代謝的誘導階段培養(yǎng)物和無關(guān)的Mab作為陰性對照。另外，用具有人HEK293細胞的平板作為陰性對照。
在此實驗中，通過ELISA證實了scFv和二體特異識別固定于聚苯乙烯支持物上的人腫瘤細胞上的人CEA的能力。
間接免疫熒光檢測與先前所述用于大腸桿菌來源材料的檢測非常相似，其中使用了相似的培養(yǎng)細胞、固定條件、試劑、保溫、顯影、設(shè)置、顯微鏡觀察和陽性標準。在具有固定的LoVo、AsPC-1和LS 174T細胞的平板上確定獨立的區(qū)域，向其中施加稀釋于PBS-3％BSA、0.02％疊氮化鈉中的對應(yīng)于兩個構(gòu)建體的重組菌株原種誘導培養(yǎng)物樣品和陰性對照。
在潮濕的容器內(nèi)室溫(RT)保溫1小時，隨后用冷的PBS-BSA-疊氮化鈉漂洗數(shù)次，在室溫添加Mab 9E10至所有的細胞單層上1小時，仍在潮濕的容器中進行。用冷PBS-3％BSA漂洗數(shù)次后，在黑暗潮濕的容器中將細胞單層與1∶64稀釋于PBS-3％BSA中的綴合了異硫氰酸熒光素的抗小鼠IgG抗體(Sigma)一起保溫30分鐘。用PBS 3％BSA漂洗平板5次，用PBS洗一次，最后用Evans Blue溶液染色幾分鐘。在覆蓋了PBS-10％甘油的細胞單層上放上蓋玻片，并用紫外光顯微鏡檢測。
在此檢測中，將Mab CB/ior-CEA.1用作陽性對照。用經(jīng)無插入片段的pPS7轉(zhuǎn)化的MP36his3被誘導培養(yǎng)基和無關(guān)Mab作為陰性對照。具有HEK293細胞的載玻片也用作陰性對照。在此實驗中，分泌重組scFv和二體的被誘導培養(yǎng)物樣品只識別LoVo、AsPC-1和LS 174T細胞。陰性對照的結(jié)果是陰性的。通過間接免疫熒光法證實了產(chǎn)生于Pichiapastoris中的scFv和二體特異識別固定于聚苯乙烯板上的表達此抗原的人腫瘤細胞上的人CEA的能力。
實施例4.-純化細菌中產(chǎn)生的scFv和二體步驟(a)用固定化離子金屬親和層析(IMAC)和離子交換純化scFv和二體片段由載體pJG-1m提供的、重組蛋白質(zhì)中存在的6組氨酸結(jié)構(gòu)域被用于純化。這些序列使蛋白質(zhì)對金屬離子(例如Zn2+、Cu2+、Ni2+)具有極高的親和力，所說的金屬離子能螯合到不同的層析支持物上，從而能簡單并可再現(xiàn)地進行純化。
將如前文所述獲得的重組細菌進行離心并通過滲壓休克和短暫的超聲波處理(數(shù)秒)分離周質(zhì)內(nèi)容物，然后在偶聯(lián)緩沖液(Tris-HCl20mM、1M NaCl、20mM咪唑，pH7.0)中透析72小時。將含scFv和二體的細菌周質(zhì)制品直接分別施加到Sepharose-IDA-Cu2+基質(zhì)(Pharmacia)上。一旦蛋白質(zhì)被偶聯(lián)后，首先用10倍體積的偶聯(lián)緩沖液漂洗凝膠，然后以相似的方式用漂洗緩沖液(Tris-HCl 20mM、1MNaCl、150mM咪唑，pH7.0)漂洗，以去除大腸桿菌污染蛋白質(zhì)。用Tris-HCl 20mM、1M NaCl、250mM咪唑，pH7.0洗脫scFv和二體。將洗脫峰部分的樣品進行12％SDS-PAGE電泳以證實目的蛋白質(zhì)的存在。在UltraFree 15(Amicon)設(shè)備中濃縮含scFv和二體的洗脫組分，在含Tris-HCl 20mM，pH8.7的緩沖溶液中進行透析，然后用離子交換柱進行第二步純化。為了進行這一步，將樣品加到Mono Q柱(Pharmacia)上，并用線性NaCl梯度(0-1M)進行洗脫。將所收集峰的樣品在12％SDS-PAGE中檢查。證實了存在預期大小(約27kDa)的scFv和二體。通過SDS-PAGE和銀染方法估計最終獲得的兩種分子的純度非常相似，都接近95％。在UltraFree 15(Amicon)設(shè)備中將純scFv和二體峰濃縮至高達2mg/mL。在完成與本發(fā)明前述步驟相似的步驟后用ELISA檢驗純化制品的生物學活性。所有的樣品均保存于4℃。
步驟(b)通過凝膠過濾分析scFv和二體用分子篩色譜法研究依照前述步驟純化的scFv和二體，以確定樣品的均一性和多聚體的存在。為此使用了Superdex 200(Pharmacia)和HPLC裝置中的凝膠過濾常規(guī)方法。確定了scFv濃縮于約27kDa的主峰中，這相應(yīng)于單體的形式。二體主要呈現(xiàn)為約45kDa的大小，相應(yīng)于二聚物的形式。
實施例5.-通過蛋白水解和質(zhì)譜對二體進行定性分析將純化的二體用含pH8.3的1％NH4HCO3和2mol/L濃度尿素的緩沖溶液在4℃透析過夜。用測序級的胰蛋白酶(Promega)以1∶50的酶∶底物比率在37℃將透析后的蛋白質(zhì)消化4小時。通過用等體積的1％三氟乙酸水溶液酸化來終止蛋白水解，然后貯存于-20℃待進行與質(zhì)譜儀偶聯(lián)的液相色譜(LC-MS)分析。
在液相色譜AKTA Basic(Amersham Pharmacia Biotech)中100分鐘內(nèi)用0％-80％溶液B的線性梯度通過反相色譜分離胰蛋白酶消化產(chǎn)物。用于產(chǎn)生梯度的溶液是AH2O/TFA 0.05％和B乙腈/TFA 0.05％。
通過在線地與LC-MS混合質(zhì)譜儀的色譜系統(tǒng)與正交幾何QTOF-2(Micromass Ltd.)系列聯(lián)合的方式，用電噴射離子化質(zhì)譜(ESI-MS)分析蛋白水解消化產(chǎn)生的組分。在LC-MS檢測中，在0.98秒內(nèi)記錄350-1800的質(zhì)譜，每隔0.02秒進行一次掃描。用碘化鈉和碘化銫混合物組成的鹽溶液校準質(zhì)譜儀。圓錐體和毛細管內(nèi)所用的電壓分別為50和3000伏。用軟件包MassLinx v 3.5(Micromass Ltd.)處理光譜。
在圖4及其附表中可見二體胰蛋白酶水解產(chǎn)物的色譜圖和二體胰蛋白酶水解肽的分布概要。從圖4附表的組分8和12的概要中明顯可見，在ESI-MS色譜中未檢測到顯示有錯誤連接的半胱氨酸的信號，包括分別在第22和第95位以及第147和第212位半胱氨酸之間通過二硫鍵(-S-S-)連接的肽(20Phe-Arg31)-S-S-(87Ser-Arg97)和(143Val-Lys148)-S-S-(186Ile-Lys228)。
用ESI-MS來分析肽，通過單一的胰蛋白酶水解就可獲得92％的二體序列(圖5)。此序列與從堿基序列推斷的氨基酸序列完全一致，所說序列包括通過PCR擴增自產(chǎn)生Mab CB/ior-CEA.1的雜交瘤的總RNA的VH和VL結(jié)構(gòu)域(SEQ ID No.16和17)、5個氨基酸長的接頭區(qū)段(SEQID No.10)以及C-末端部分，由載體pJG-1m所提供的c-myc肽序列和最后6個組氨酸(圖2)。
實施例6.-有關(guān)去糖基化CEA識別的研究用特異于N-糖基化的內(nèi)切糖苷酶PNGase F(New England Biolabs)將人CEA(Calbochem)進行酶促去糖基化。將CEA溶于20mM pH7.8的磷酸鹽緩沖液中并用SDS和2-巰基乙醇在100℃變性5分鐘。然后加入NP40和1μl PNGase F，于37℃2小時。在SDS-PAGE中用考馬斯藍染色分析對照樣品和去糖基化樣品，用內(nèi)切糖苷酶消化后分子大小有了顯著的減小(近50％)。用(a)Mab CB/ior-CEA.1、(b)純化的二價scFv(二體)或(c)獲自小鼠的抗人CEA抗血清作為一抗，隨后對于(a)和(b)來說使用綴合了辣根過氧化物酶的抗Mab CB/ior-CEA.1的Fab的多克隆抗體，而對于(c)來說使用綴合了辣根過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體，進行Western印跡雜交。轉(zhuǎn)膜和呈色與本發(fā)明前文中Western印跡法的有關(guān)描述相似。Mab CB/ior-CEA.1和二體只識別未去糖基化的抗原。多克隆抗血清識別去糖基化前和去糖基化后的CEA。
通過識別特異外源凝集素的斑點印跡系統(tǒng)分析天然的人CEA樣品。所應(yīng)用的外源凝集素是Sambucus nigra凝集素(SNA)和Maackiaamurensis凝集素(MAA)，分別特異于α2，6和α2，3連接的末端syalicacid。應(yīng)用于這些實驗中的外源凝集素已經(jīng)與洋地黃毒苷連接，它可以被標記了堿性磷酸酶的抗洋地黃毒苷抗體識別。對外源凝集素-寡糖相互作用呈陽性的樣品通過與特異于磷酸酶的底物(4-硝基四唑藍氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽混合物)反應(yīng)而被顯色。胎球蛋白在此實驗中被用作兩種外源凝集素的陽性對照。天然CEA被SNA識別而不被MAA識別，這一事實顯示了α2，6連接的末端syalic酸非常普遍。
然后用酶NANAsaII和能水解末端syalic acid α2，6的外切糖苷酶(syalidase)消化人CEA。消化產(chǎn)物在SDS-PAGE中分離，然后用MabCB/ior-CEA.1和獲自小鼠的抗人CEA抗血清作為一抗，通過Western印跡法進行有關(guān)它們識別作用的研究。結(jié)果顯示兩種樣品均識別天然CEA對照，而只有小鼠抗CEA抗血清識別用NANAsaII消化過的CEA。
實施例7.-在人正常組織和腫瘤組織中進行的免疫細胞化學和組織化學研究用來自尸檢材料的正常組織和腫瘤組織個體的樣品進行組織研究。用最小份的組織塊證實已描述的Mab CB/ior-CEA.1的識別(Tormo B等，APMIS 971073-1080，1989)。樣品包括肺癌、皮膚癌、乳腺癌、子宮頸癌、食道癌和腎癌；結(jié)腸癌、前列腺癌、胰腺癌、膽囊癌、小腸癌和胃癌；神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)和肉瘤來源的腫瘤，以及正常的結(jié)腸黏膜和正常的組織，如肝、腎、肺、睪丸、脾和胰腺，還包括血液細胞。
對過去所報道的方法(Tormo B等，APMIS 971073-1080，1989)作一些修改后進行研究。依照常規(guī)步驟將組織樣品在10％緩沖甲醛中固定、脫水、清洗并包埋于石蠟中。用蘇木精-曙紅將切片染色進行組織病理學研究。通過組織病理學分析包埋塊的連續(xù)切片被用作免疫過氧化物酶技術(shù)。
用3％的H2O2處理去石蠟、再水合的切片30分鐘以封閉內(nèi)源性的過氧化物酶，在磷酸緩沖鹽水(PBS)中漂洗，隨后與稀釋于PBS-1％牛血清白蛋白(稀釋緩沖液)中的樣品一起保溫1小時。然后，將玻片與1∶100稀釋的生物素化多克隆IgG兔抗體一起保溫30分鐘，所說的抗體是用Mab CB/ior-CEA.1免疫而獲得的，之后與1∶500稀釋的過氧化物酶-鏈霉親和素復合物(Amersham)一起保溫相似的時間。
被檢測的樣品是(a)濃度為20μg/mL的Mab CB/ior-CEA.1(陽性對照)(b)如實施例4中步驟(a)所述、濃度為50μg/mL的已純化的大腸桿菌scFv(c)如實施例4中步驟(a)所述、濃度為50μg/mL的已純化的大腸桿菌二體(d)先前獲得的scFv，它在這些實施例中被稱為“F3”(Ayala等，Biotechniques 13790-799，1992；Perez L等，AppliedBiochem.Biotechnol.2479-82，1986)，已純化且濃度為50μg/mL和100μg/mL。
所有的稀釋均在稀釋緩沖液中進行，溫育是在潮濕容器內(nèi)室溫下進行的。在各步之前用稀釋緩沖液或PBS漂洗3次，1分鐘/次。通過與含3mg二氨基聯(lián)苯胺、5mL PBS和5mL 30％H2O2的溶液一起保溫5-10分鐘使免疫過氧化物酶反應(yīng)顯色。用Meyer氏蘇木精復染玻片。特征性的褐色反應(yīng)表現(xiàn)為陰性，三個漸增的強度水平(1+、2+、3+)的陽性。在各張玻片上含待測樣品的部分被標記，而含稀釋緩沖液的鄰近區(qū)作為陰性對照。
為了進行血液細胞中的研究，首先要去除紅血球，然后將白細胞鋪于包被了明膠的玻璃載片上，用1∶1(V∶V)的丙酮∶甲醇固定。操作的其余部分基本上如上文所述進行。
有關(guān)被研究組織的已獲結(jié)果總結(jié)于表VI中。所研究的正常組織(肝、腎、肺、睪丸、血液、脾、胰腺)不被所說片段或Mab識別。在結(jié)腸粘膜的情形中，與先前已獲得的對于Mab CB/ior-CEA.1、F3 scFv以及新型scFv和二體的結(jié)果一致，專門與腔內(nèi)分泌產(chǎn)物以及某些腺體的頂端區(qū)域反應(yīng)。F3 scFv的反應(yīng)強度較低，這種現(xiàn)象隨后在對于幾種腫瘤的實驗中也觀察到了。在血液細胞的情況中，Mab、scFv和二體未顯示出與正常淋巴細胞和嗜中性粒細胞的反應(yīng)，表明它們?nèi)狈εcNCA抗原的重要交叉反應(yīng)性。與此相反，F(xiàn)3 scFv顯示出對這些細胞有較少的識別。
Mab、scFv和二體與大部分胃腸來源的腫瘤反應(yīng)，在多數(shù)情形中在腫瘤細胞的頂端表面和細胞質(zhì)中均觀察到強的標記。這些樣品均不標記造血和肉瘤來源的腫瘤，或來自上皮的其它腫瘤，但乳房微管癌和肺大細胞癌是例外。在分化良好的結(jié)腸癌情形中，在細胞質(zhì)頂端區(qū)和腔內(nèi)分泌產(chǎn)物中有強標記，而在中等分化和分化不足的腺癌中則在全部細胞質(zhì)內(nèi)均觀察到有標記。只有少數(shù)樣品例外，相對于這三個分子而言染色強度非常類似。
在F3的情形中，觀察到了染色強度的普遍降低，即使在某些情況下應(yīng)用了比scFv和二體所用量高兩倍的濃度，仍能觀察到此現(xiàn)象。較低的染色強度可能造成被其它抗體識別的某些樣品不被F3識別。
表VI.用不同抗體進行的免疫細胞化學和組織化學研究。

注表中的數(shù)字代表染色陽性的情形/被研究情形的總數(shù)目。如果沒有括號存在，陽性樣品的染色強度在2+和3+之間；Ca癌；ADC腺癌；HDGHodgkin；BD分化良好；MD中等程度分化；PD分化不良。(*)標記出現(xiàn)局現(xiàn)于腔內(nèi)分泌產(chǎn)物和某些腺體的頂端區(qū)；(a)染色強度可歸為1+級別的陽性情形；(b)識別淋巴細胞和嗜曙紅細胞的強度可歸為1+級別；(c)6個陽性情形中有2個顯示的染色強度可歸為1+級別。
實施例8.-親和常數(shù)的測定為了測定親和常數(shù)，使用了基于質(zhì)量作用定律的非競爭性ELISA方法(Beatty JD等，J.Immunol Meth.100173-184，1987)。親和常數(shù)Kaff等于[AgAb]/[Ag][Ab]，其中AgAb是抗原-抗體復合物的L/mol(M-1)，[Ag]是游離抗原的濃度(mol)，而[Ab]是游離抗體的濃度(mol)。
用4個系列稀釋度且均為雙份的人CEA(Calbochem)包被聚乙烯ELISA平板(Costar)。用PBS-1％脫脂奶封閉平板。將樣品(scFv F3、scFv、二體、Mab CB/ior-CEA.1，均已純化)以不同的濃度施加到平板上。漂洗后，將相應(yīng)于上述前三個樣品的孔與Mab 9E10(10μg/mL)一起保溫，而在相應(yīng)于Mab CB/ior-CEA.1的孔中則施加了封閉液。下一步是將1∶2500稀釋的綴合了過氧化物酶的抗小鼠IgG抗體(Sigma)，37℃保溫1小時。所使用的底物是OPD，反應(yīng)顯色15分鐘。在LabSystemsMultiskan MS裝置中讀取492nm處的吸收值。
將各種情形下的光密度值(OD)作為繪圖的縱坐標(y)，ng/mL濃度的常用對數(shù)值作為橫坐標(x)。將OD100作為信號保持最大值時的OD。對于各條曲線，計算OD100的一半值(OD50)。測定對于各條曲線而言在OD50處各樣品的濃度值，用以下公式進行親和力計算Kaff＝(n-1)/2(n)，其中的n＝[Ab’]t/[Ab]t。[Ab’]t是相應(yīng)于最高待比較抗原濃度時OD50值處的樣品濃度，而[Ab]t是相應(yīng)于最低待比較抗原濃度時OD50值處的樣品濃度。對于4條已獲得的曲線，進行6次可能的親和測定，最終的Kaff為這幾次測定的平均。
表VII反應(yīng)了對于被檢測的各變體計算得到的Kaff值。scFv的Kaff值為(5.0±0.4)×109L mol-1，比F3的Kaff值(Kaff＝(9.2±0.8)×107L mol-1)高1個半數(shù)量級。后一個值基本上與用不同方法測定F3所計算得到的Kaff相符(Perez L等，Applied Biochem.Biotechnol.2479-82，1996)。二體的Kaff值為(2.8±0.3)×1010L mol-1，而Mab CB/ior-CEA.1的Kaff值則為(6.1±0.5)×1010L mol-1。
表VII.由已進行的實驗計算的親和值。

Kaff親和常數(shù)，由6次測定的平均值±標準偏差(括弧內(nèi))計算得到。實施例9.-在患有通過接種B16-CEA13細胞而誘發(fā)的腫瘤的C57Bl/6小鼠內(nèi)測定被125I所標記的片段和抗體的特異體內(nèi)識別為了測定抗體片段的體內(nèi)特異識別，通過lodogen方法用125I(Amersham，UK)標記以下分子(Fraker PJ，Speck JC Jr，BiochemBiophys Res Comm 80849-857，1978)(a)純化自大腸桿菌的scFv；(比活1.1MBq/5μg)(b)純化自大腸桿菌的二體；(比活1.2MBq/5μg)(c)Mab CB/ior-CEA.1；(比活1.8MBq/5μg)(d)純化的scFv F3(Ayala等，Biotechniques 13790-799，1992；Perez L等，Applied Biochem.Biotechnol.2479-82，1996)(比活1.0MBq/5μg)。
用薄層層析分析放射性標記產(chǎn)物來確定蛋白質(zhì)的摻入，發(fā)現(xiàn)了95-98％的放射性。在以下體系中檢測放射標記的產(chǎn)物探測CEA的能力用CEA(5μg/mL；Calbochem)包被聚苯乙烯管，封閉并加入放射標記的樣品，調(diào)節(jié)抗體的量使其能被固相材料上所俘獲。保溫后漂洗一次，對于上述樣品(a)-(d)，分別測定到80％、79％、83％和81％的放射性被固相材料所俘獲，證明了放射標記步驟未明顯影響抗體的生物學活性。
為了研究生物分布，將實驗動物分成4組，每組有12只C57Bl/6小鼠(CENPALAB，Cuba)。用腋下注射的方式以1×106個B16-CEA13細胞/只的量接種動物。7天后腫瘤可見且可觸摸(約為0.3-0.5g)，此后將待檢測的放射性標記產(chǎn)物從尾靜脈注射入小鼠，在12、24、48小時后處死小鼠，手術(shù)取出腫瘤和以下正常組織脾、肝、腎、腸、肌肉、骨髓和血液。放射性的積聚表示為注射劑量的百分率/克組織。通過標準樣品的注射劑量進行校正。用伽馬閃爍計數(shù)器測定放射性。
通過用克隆于pDisplayTM載體(目錄號V660-20，Invitrogen)中的編碼人CEA胞外結(jié)構(gòu)域的基因進行轉(zhuǎn)染來獲得這些實驗中所用的B16-CEA13細胞。用提取自CRL-1682細胞的RNA，通過設(shè)計成改變已公布的人CEA序列的寡核苷酸進行PCR得到該基因。純化重組質(zhì)粒pDisplay-CEA并用Lipofectamine PLUSTM(Gibco-BRL)轉(zhuǎn)染入C57Bl/6小鼠B16-F10黑素瘤細胞(ATCC CRL-6475)，每次轉(zhuǎn)染用5μg DNA。用4.0mg/mL硫酸遺傳霉素(G418；Gibco-BRL)對穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子進行14天的選擇，之后通過有限稀釋法將繼續(xù)存活的培養(yǎng)細胞進行克隆，以Mab CB/ior-CEA.1為一抗通過間接的免疫熒光法鑒定在其表面表達人CEA的那些克隆，利用綴合了FITC的抗小鼠IgG抗體(Sigma)進行顯色。發(fā)現(xiàn)有73％的克隆中有80％以上的細胞呈現(xiàn)特異的膜熒光，顯示了人CEA經(jīng)正確折疊和糖基化后暴露于其表面。
將B16-F10未轉(zhuǎn)染細胞用作對照。將通過間接免疫熒光法選擇為陽性的克隆復制品進行增殖并通過腋下途徑分別注射入C57BI/6小鼠，每只動物注射1×106個細胞。在產(chǎn)生腫瘤的10個克隆中選擇具有較快和漸進性生長特征的克隆(命名為B16-CEA13)，用于此處報道的實驗中。
圖6顯示了在不同時間從每種被研究組織中回收的放射性百分率(相對于所注射的整體而言)，以及腫瘤中放射性血液中放射性的比率。表VIII的結(jié)果證實了在24小時和48小時之間，對于二體、scFv和Mab而言，腫瘤中放射性血液中放射性的比率保持較高的水平，后者最高，其次是二聚物分子。先前獲得的F3 scFv顯示了非常低的值，它對CEA的親和力的降低可能與其體內(nèi)表現(xiàn)不好相關(guān)。
表VIII.移植了表達人CEA的小鼠B16-CEA13黑素瘤的C56Bl/6小鼠血液中放射性腫瘤放射性的比率。測定了用125I放射性標記的不同分子注射動物后24小時和48小時的值。每個比率都是計算由12只小鼠回收的組織的平均值得到的。

序列表<110>Center for Genet ic Engineering and Biotechnology<120>對人癌胚抗原(CEA)特異的抗體片段<130>序列表實例<140>01<141>2002-04-03<160>21<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>1ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>2ayctccacac acaggrccag tggatagac 29<210>3<211>40<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>3ggggatatcc accatggagw cacakwctca ggtctttrta 40<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>4actggatggt gggaagatgg a 21<210>5<211>14<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述接頭I<400>5Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp1 5 10<210>6<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述接頭II<400>6Gly Gly Gly Gly Ser1 5
<210>7<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>7tctcacagtg cacaggaagt gaagctggtg gagtctggg39<210>8<211>63<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>8gtcgactttg gattcggagc ctgatcctga ggatttaccc tctgaggaga ctgtgagagt 60ggt 63<210>9<211>62<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>9gagggtaaat cctcaggatc aggctccgaa tccaaagtcg acgacattgt gatgacccag 60tc62<210>10<211>37<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>10aaggaaaaaa gcggccgctt tcagctccag cttggtt37<210>11<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>11agagccgccg ccacctgagg agactgtgag agtggt 36<210>12<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>12ggtggcggcg gctctgacat tgtgatgacc cagtct 36<210>13<211>108<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述載體<400>13cctttctatt ctcacagtgc acaggaaatc aaagcggccg cagggtccga acaaaaactc 60atctcagaag aggatctgaa ttcccatcat catcaccatc actaataa108
<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>14gttgttcctt tctattctca c 21<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>15ctcttctgag atgagttttt gttc 24<210>16<211>241<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述scFv<400> 16Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Ile Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser115 120 125Glu Ser Lys Val Asp Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met130 135 140Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln145 150 155 160Asn Ala Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser165 170 175Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Ser Arg Asn Ser Gly Val Pro180 185 190Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile195 200 205Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr210 215 220Asn Ser Tyr Pro Leu Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu225 230 235 240Lys<210>17<211>232<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述二體<400>17Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly15 10 15Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Ile Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met115 120 125Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser130 135 140Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ala Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr145 150 155 160Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser165 170 175Ser Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly180 185 190Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala195 200 205Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Val Thr Phe Gly210 215 220
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys225230<210>18<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>18catgccatgg ggaatccgaa gtgaagctgg tggag 35<210>19<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述寡聚物<400>19catgccatgg atcccggggt gatggtgatg gtgatg 36<210>20<211>21<212>DNA<<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述二體MS<400>20gactggttcc aattgacaag c 21<210>21<211>255<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述二體MS<400>21Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Asn Arg Tyr20 25 30Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Phe Ile Ser Ser Asp Gly Ile Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu65 70 75 80Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Val Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly100 105 110Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Ile Met115 120 125Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser130 135 140Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Ala Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr145 150 155 160Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile Tyr Ser Ala Ser165 170 175Ser Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Ile Thr Gly Ser Gly Ser Gly180 185 190Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala195 200 205
Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu Val Thr Phe Gly210 215 220Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Ala Ala Ala Gly Ser Glu Gln Lys225 230 235 240Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Ser His His His His His His245 250 25權(quán)利要求
1.由提取自產(chǎn)生Mab CB/ior-CEA.1的雜交瘤的RNA獲得的單體scFv型抗體片段，所述抗體片段對可溶性形式、吸附于固體表面、或細胞中存在的人癌胚抗原(CEA)是特異的，而且顯示對CEA的親和常數(shù)是(5.0±0.4)×109Lmol-1，對這種抗原的識別依賴其糖基化的保留。
2.依照權(quán)利要求1的單體scFv型抗體片段，特征為其氨基酸序列如SEQ ID NO 16所示。
3.由提取自產(chǎn)生Mab CB/ior-CEA.1的雜交瘤的RNA獲得的二價(二體)scFv型抗體片段，所述抗體片段對可溶性形式、吸附于固體表面、或細胞中存在的人癌胚抗原(CEA)是特異的，而且顯示對CEA的親和常數(shù)是(2.8±0.3)×1010Lmol-1，對這種抗原的識別依賴其糖基化的保留。
4.依照權(quán)利要求3的二價(二體)scFv型抗體片段，特征為其氨基酸序列如SEQ ID NO 17所示。
5.依照權(quán)利要求1-4的抗體片段，特征為它們用于鑒定表達人CEA的腫瘤細胞。
6.對人CEA特異的重組或合成重組抗體，特征為它們包含SEQID NO 16和SEQ ID NO 17所示可變結(jié)構(gòu)域VH和VL的氨基酸序列，并人工連接成Fab片段的形式，其它scFv變體，雙特異性抗體，或者與生物學或生物化學活性結(jié)構(gòu)域融合。
7.依照權(quán)利要求1-6的抗體片段，特征為它們是在重組細菌或酵母中、在經(jīng)轉(zhuǎn)染昆蟲或哺乳動物細胞中、或者在經(jīng)遺傳修飾的生物體中生成的。
8.依照權(quán)利要求1-7的抗體片段，特征為它們額外包含放射性標記或通過其它方法可檢測的標記物，或者具有抗腫瘤潛力的化學或生物學試劑。
9.包含依照權(quán)利要求1-8的抗體片段的藥物組合物，其可用于治療表達CEA的人腫瘤。
10.包含依照權(quán)利要求1-8的抗體片段的藥物組合物，其可用于經(jīng)成像技術(shù)對表達CEA的人腫瘤進行體內(nèi)放射性定位。
11.包含依照權(quán)利要求1-8的抗體片段、用于體外或離體診斷的試劑，用于檢測與細胞相關(guān)聯(lián)或無關(guān)聯(lián)的人CEA。
12.通過重組DNA的遺傳操作獲得的、表達依照權(quán)利要求1-8的抗體片段的細胞，這些細胞可以是細菌、酵母、昆蟲細胞、哺乳動物細胞、或植物細胞。
13.通過重組DNA的遺傳操作獲得的、表達依照權(quán)利要求1-8的抗體片段的多細胞生物體，這些生物體是轉(zhuǎn)基因動物或轉(zhuǎn)基因植物。
14.通過重組DNA的遺傳操作獲得的、編碼依照權(quán)利要求1-8的抗體片段的載體，這些載體是質(zhì)粒或能夠整合到宿主細胞中的序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過重組DNA技術(shù)由抗癌胚抗原(CEA)單克隆抗體(Mab)CB/ior－CEA.1獲得的單價和二價(二體)單鏈Fv型(scFv)抗體片段。該單抗對CEA具有高親和力，可用于人體內(nèi)結(jié)腸直腸腫瘤的診斷和監(jiān)測。與原始Mab一樣，單價scFv片段和二體對人CEA也有高親和力，并且識別依賴碳水化合物的保留的表位。二體和單價scFv片段對CEA的親和常數(shù)分別為(5.0±0.4)×10
文檔編號C07K16/30GK1649901SQ03809658
公開日2005年8月3日 申請日期2003年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月29日
發(fā)明者J·V·加維朗多考利, M·阿亞拉艾維拉, F·D·L·M·弗里爾阿美達, B·E·阿瑟維多卡斯特羅, H·貝爾卡希亞, L·T·羅克納瓦羅, L·J·岡薩雷斯洛佩斯, J·A·克里瑪塔艾爾維利斯, R·芒特希諾塞古伊 申請人:遺傳工程與生物技術(shù)中心