專利名稱：含有il-6拮抗劑作為有效成分的牛皮癬的預防或治療劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分的牛皮癬的預防或治療劑。
IL-6在細胞上通過兩種蛋白質傳遞其生物學活性。其一是，IL-6結合的分子量約80kD的配體結合性蛋白質的IL-6受體(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967～981，Yamasaki，K.et al.，Science(1987)241，825～828)。IL-6受體除了跨細胞膜在細胞膜上表達的膜結合型外，主要也作為從其細胞外區(qū)域形成的可溶性IL-6受體存在。
另一個是與非配體結合性的信號傳遞有關的分子量約130kD的膜蛋白質gp130。IL-6和IL-6受體通過形成IL-6/IL-6受體復合體、然后和gp130結合，使IL-6的生物學活性被傳遞入細胞內(Taga，T.et al.，Cell(1989)58，573～581)。
IL-6拮抗劑為阻礙IL-6的生物學活性傳遞的物質。到目前為止，已知對于IL-6的抗體(抗IL-6抗體)、對于IL-6受體的抗體(抗IL-6受體抗體)、對于gp130的抗體(抗gp130抗體)、IL-6變異體、IL-6或IL-6受體部分肽等。
關于抗IL-6受體抗體，有很多報告(Novick，D.et al.，Hybridoma(1991)10，137～146、Huang，Y.W.et al.，Hybridoma(1993)12，621～630、國際專利申請公開號WO 95-09873、法國專利申請公開號FR2694767、美國專利號US 521628)。已知其中之一是通過將小鼠抗體PM-1(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900～2906)的互補決定區(qū)(CDR)向人抗體移植得到的人源化PM-1抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)。
牛皮癬一般為慢性·難治性的皮膚病，具有在圓形或橢圓形的紅色隆起部分(紅斑)上形成白色或銀白色的角質的外觀。牛皮癬為炎癥性角化癥的代表性皮膚病，該炎癥性角化癥為同時發(fā)生通過淋巴細胞等的白血球侵入皮膚產生的“炎癥”、和皮膚的表皮變厚且角質層也變厚的“角化癥”的皮膚癥狀。
牛皮癬按照癥狀可分為尋常性牛皮癬、關節(jié)癥性牛皮癬、膿皰性牛皮癬、掌跖膿皰癥、及滴狀牛皮癬，但其發(fā)病原因或發(fā)病機制不明確。但是，由于具有淋巴細胞抑制活性的環(huán)胞菌素A具有牛皮癬的治療效果等，存在淋巴細胞參與的學說。
作為牛皮癬的治療劑，已知有為抑制皮膚炎癥的甾類外用藥、環(huán)胞菌素A內服藥、氨甲喋呤內服藥、紫外線療法等；為抑制表皮增殖(角化癥)的維生素D外用藥、維生素A類(體卡松)內服藥、紫外線療法等；以及為治療其它個別關聯(lián)癥狀的非甾體類消炎鎮(zhèn)痛藥(對關節(jié)癥牛皮癬的關節(jié)炎)、抗生素(對關聯(lián)的感染癥)等。
但是，到目前為止，在牛皮癬中沒有進行使用抗IL-6受體抗體等的IL-6拮抗劑特異地抑制IL-6生物學活性的試驗，還不知道抗IL-6受體抗體等的IL-6拮抗劑對牛皮癬會顯示治療效果。
即，(1)本發(fā)明提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有IL-6拮抗劑作為有效成分。
(2)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有對IL-6受體的抗體作為有效成分。
(3)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有對IL-6受體的單克隆抗體作為有效成分。
(4)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有對人IL-6受體的單克隆抗體作為有效成分。對人IL-6受體的單克隆抗體，優(yōu)選為PM-1抗體。
(5)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有對小鼠IL-6受體的單克隆抗體作為有效成分。對小鼠IL-6受體的單克隆抗體，優(yōu)選為MR16-1抗體。
(6)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有對IL-6受體的重組型抗體作為有效成分。對IL-6受體的重組型抗體，優(yōu)選為具有人抗體恒定區(qū)域(C區(qū)域)。
(7)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體作為有效成分。
(8)本發(fā)明還提供一種牛皮癬的預防或治療劑，其含有人源化PM-1抗體作為有效成分。
發(fā)明的實施方案本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑，若為顯示牛皮癬的預防或治療效果的物質，則不管其來源、種類及形狀。
IL-6拮抗劑為隔斷IL-6產生的信號傳遞、阻礙IL-6的生物學活性的物質。IL-6拮抗劑優(yōu)選為對IL-6、IL-6受體及gp130的任一個的結合具有阻礙作用的物質。作為IL-6拮抗劑，可以列舉例如抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gp130抗體、IL-6變異體、可溶性IL-6受體變異體或者IL-6或IL-6受體的部分肽、以及和它們顯示相同活性的低分子物質。
本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，可以使用公知的手段作為多克隆或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體，有產生于雜交瘤中的抗體、以及通過基因工程的手段產生于用含有抗體基因的表達型載體轉化的宿主中的抗體。該抗體通過與IL-6結合，阻礙IL-6與IL-6受體結合、阻斷IL-6的生物學活性向細胞內傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MH166(Matsuda，T.et al.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951～956)或SK2抗體(Sato，K.et al.，第21次日本免疫學會總會、學術紀錄(1991)21，166)等。
產生抗IL-6抗體的雜交瘤，基本可以使用公知技術、如下所述進行制備。即，使用IL-6作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進行免疫，得到的免疫細胞按照通常的細胞融合法和已知的親代細胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆的抗體產生細胞來制備。
具體地，制備抗IL-6抗體可按下面的方法進行。例如，作為取得抗體的致敏抗原被使用的人IL-6可以通過使用Eur.J.Biochem(1987)168，543～550、J.Immunol.(1988)140，1534～1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685～2688中公開的IL-6基因/氨基酸序列得到。
在已知的表達型載體系中插入IL-6的基因序列、使適當?shù)乃拗骷毎D化后，用公知的方法純化來自該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中的目的IL-6蛋白質，可將該純化IL-6蛋白質作為致敏抗原使用。另外，也可以將IL-6蛋白質與其它蛋白質的融合蛋白質作為致敏抗原使用。
本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，可以使用公知的手段作為多克隆抗體或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體，有產生于雜交瘤中的物質、和通過基因工程的手段，產生于用含有抗體基因的表達型載體轉化的宿主中的物質。該抗體通過與IL-6受體結合，阻礙IL-6與IL-6受體結合、阻斷IL-6的生物學活性向細胞內傳遞。
作為這種抗體，可以列舉MR16-1抗體(Tamura，T.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924～11 928)、PM-1抗體(Hirata，Y.et al.，J.Immunol.(1989)143，2900～2906)、AUK12-20抗體、AUK64-7抗體或AUK146-15抗體(國際專利申請公開號WO 92-19759)等。其中，作為特別優(yōu)選的抗體可以列舉PM-1抗體。
另外，產生PM-1抗體的雜交瘤細胞株作為PM-1，基于布達佩斯條約，在1988年7月12日、作為FERM BP-2998被國際保藏在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心( 305-5466日本茨城縣つくば市東1段1號1中央第6)。另外，產生MR16-1抗體的雜交瘤細胞株作為大鼠-小鼠雜交瘤MR16-1，基于布達佩斯條約，在1997年3月13日、作為FERM BP-5875被國際保藏在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心( 305-5466日本茨城縣つくば市東1段1號1中央第6)。
產生抗IL-6受體單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用已知技術、如下進行制備。即，使用IL-6受體作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進行免疫，得到的免疫細胞按照通常的細胞融合法和已知的親代細胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆抗體的產生細胞來制備。
具體地說，制備抗IL-6受體抗體可按下面的方法進行。例如，作為引起抗體的致敏抗原被使用的人IL-6受體可以通過使用在歐洲專利申請公開號EP 325474中公開的、小鼠IL-6受體可以通過使用在日本專利申請公開號特開平3-155795中公開的IL-6受體基因/氨基酸序列來得到。
IL-6受體蛋白質，有在細胞膜上表達的蛋白質和從細胞膜脫離的蛋白質(可溶性IL-6受體)(Yasukawa，K.et al.，J.Biochem.(1990)108，673～676)兩種?？扇苄訧L-6受體抗體是由與細胞膜結合的IL-6受體的實質性細胞外區(qū)域構成的，在缺損跨細胞膜區(qū)域或跨細胞膜區(qū)域和細胞內區(qū)域方面與膜結合型IL-6受體不同。IL-6受體蛋白質只要是在本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的制備中作為致敏抗原使用，就可以使用任一種IL-6受體。
在已知的表達型載體系中插入IL-6受體的基因序列、使適當?shù)乃拗骷毎D化后，用已知的方法純化來自該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中的目的IL-6受體蛋白質，可將該純化IL-6受體蛋白質作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達IL-6受體的細胞或IL-6受體蛋白質和其它蛋白質的融合蛋白質作為致敏抗原使用。
含有含編碼人IL-6受體的cDNA的質粒pIBIBSF2R的大腸桿菌(E.coli)，基于布達佩斯條約，在1989年1月9日、作為HB101-pIBIBSF2R，保藏號FERM BP-2232被國際保藏在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心( 305-5466日本茨城縣つくば市東1段1號1中央第6)。
本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，可以使用公知的手段作為多克隆或單克隆抗體得到。作為本發(fā)明中使用的抗gp130抗體，特別優(yōu)選來自哺乳動物的單克隆抗體。作為來自哺乳動物的單克隆抗體，有產生于雜交瘤中的抗體、和通過基因工程的手段產生于用含有抗體基因的表達型載體轉化的宿主中的抗體。該抗體通過和gp130結合，阻礙IL-6/IL-6受體復合體與gp130結合、阻斷IL-6的生物學活性向細胞內傳遞。
作為這種抗體，可以列舉AM64抗體(特開平3-219894)、4B11抗體和2H4抗體(US 5571513)B-S12抗體以及B-P8抗體(特開平8-291199)等。
產生抗gp130單克隆抗體的雜交瘤，基本可以使用公知技術、如下所述進行制備。即，使用gp130作為致敏抗原、將其按照通常的免疫方法進行免疫，得到的免疫細胞通過通常的細胞融合法和公知的親代細胞融合，通過通常的篩選法，可以通過篩選單克隆抗體的產生細胞來制備。
具體地，制備單克隆抗體可按下面的方法進行。例如，作為引起抗體的致敏抗原被使用的gp130可以使用在歐洲專利申請公開號EP 411946中公開的gp130基因/氨基酸序列來得到。
在已知的表達型載體系中插入gp130的基因序列、使適當?shù)乃拗骷毎D化后，用已知的方法純化來自該宿主細胞中或培養(yǎng)上清液中的目的gp130蛋白質，可將該純化gp130受體蛋白質作為致敏抗原使用。另外，也可以將表達gp130的細胞或gp130蛋白質和其它蛋白質的融合蛋白質作為致敏抗原使用。
作為用致敏抗原免疫的哺乳動物，雖沒有特別的限制，但是優(yōu)選考慮與在細胞融合中使用的親代細胞的相容性來進行選擇，一般地可以使用嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠等。
用致敏抗原免疫動物時可以按已知的方法進行。例如，作為一般的方法，通過在哺乳動物的腹腔內或皮下注射致敏抗原進行。具體地說，用適量的PBS(磷酸鹽緩沖生理鹽水)或生理鹽水等稀釋致敏抗原、懸濁液根據(jù)需要混合通常的佐劑，例如弗氏完全佐劑，乳化后，優(yōu)選每4～21日向哺乳動物給藥數(shù)次。另外，致敏抗原免疫時也可以使用適當?shù)妮d體。
這樣進行免疫、確認血清中所期望的抗體水平上升后，從哺乳動物中取出免疫細胞、進行細胞融合。作為進行細胞融合的優(yōu)選的免疫細胞，特別可以列舉脾細胞。
作為和上述免疫細胞融合的另一親代細胞的哺乳動物骨髓瘤細胞，適宜使用以前、已知的各種細胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immnol.(1979)123，1548～1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1～7)、NS-1(Kohler.G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511～519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405～415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269～270)、F0(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1～21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313～323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131～133)等。
上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的細胞融合基本可以按照已知的方法、例如Milstein等的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3～46)等進行。
更具體地說，上述細胞融合例如可在細胞融合促進劑存在下，在通常的營養(yǎng)培養(yǎng)液中進行。作為融合促進劑，可使用例如聚乙二醇(PEG)、日本血細胞凝集病毒(HVJ)等，進一步，根據(jù)需要，為了提高融合效率、也可以添加二甲基亞砜等的輔助溶劑來使用。
免疫細胞和骨髓瘤細胞的使用比例，例如，相對于骨髓瘤細胞、免疫細胞優(yōu)選為1～10倍。作為上述細胞融合中使用的培養(yǎng)液，例如，可以使用在上述骨髓瘤細胞株的增殖中適合的RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液，除此之外，還可使用在該種細胞培養(yǎng)中可使用的通常的培養(yǎng)液，進一步，也可能并用胎牛血清(FCS)等的血清補液。
細胞融合是將上述免疫細胞和骨髓瘤細胞的規(guī)定量在上述培養(yǎng)液中充分混合，通常在30～60％(w/v)的濃度下添加預先加熱至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量為1000～6000左右的PEG溶液，通過混合形成目的融合細胞(雜交瘤)。然后，通過反復進行依次添加適當?shù)呐囵B(yǎng)液，離心除去上清液的操作、可以除去雜交瘤的繁殖中不優(yōu)選的細胞融合劑等。
該雜交瘤通過在通常的選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)來進行選擇。在該HAT培養(yǎng)液中的培養(yǎng)，持續(xù)使目的雜交瘤以外的細胞(非融合細胞)滅絕所需的充分的時間、通常要持續(xù)數(shù)日～數(shù)周。然后，實施通常的極限稀釋法、進行產生目的抗體的雜交瘤的篩選和純株培養(yǎng)。
另外，除了在人以外的動物中免疫抗原得到上述雜交瘤以外、將人淋巴細胞在體外被所期望的抗原蛋白質或抗原表達細胞致敏、使致敏B淋巴細胞和人骨髓瘤細胞、例如U266融合，也可以得到對期望的抗原或抗原表達細胞具有結合活性的所期望的人抗體(參照特公平1-59878)。進一步，也可以對具有人抗體基因儲藏庫的轉基因動物給與抗原或抗原表達細胞，按上述方法得到所期望的人抗體(參照國際專利申請公開號WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。
產生這樣制備的單克隆抗體的雜交瘤，在通常的培養(yǎng)液中傳代培養(yǎng)，另外，也可在液氮中長期保存。
從該雜交瘤取得單克隆抗體時，可以采用將該雜交瘤用通常的方法培養(yǎng)、得到其培養(yǎng)上清液的方法，或將雜交瘤投入與其有相容性的哺乳動物中使其增殖、得到其腹水的方法等。前者的方法適于得到高純度的抗體，另一方面，后者的方法適于抗體的大量生產。
例如，產生抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制備，可以按照特開平3-139293中公開的方法進行?？梢赃M行將基于布達佩斯條約，在1988年7月12日、作為FERM BP-2998被國際保藏在獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心( 305-5466日本茨城縣つくば市東1段1號1中央第6)的產生PM-1抗體的雜交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔內、得到腹水，從該腹水純化PM-1抗體的方法，或將該雜交瘤在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中、例如10％胎牛血清、含有5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)RPMI1640培養(yǎng)基、雜交瘤SFM培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBCO-BRL制)等中培養(yǎng)，由該培養(yǎng)上清液純化PM-1抗體的方法。
本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用基因重組技術，由雜交瘤克隆抗體基因，將其整合入適當?shù)妮d體，然后將載體導入宿主中而產生的重組型抗體(例如，參照Borrebaeck C.A.K.and Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具體地，產生目的抗體的細胞，例如由雜交瘤分離編碼抗體的可變(V)區(qū)域的mRNA。mRNA的分離可以按照公知的方法，例如胍超離心法(Chirgwin，J.M.et al.，Biochemistry(1979)18，5294～5299)、AGPC法(Chomczynski，P.et al.，Anal.Biochem.(1987)162，156～159)等制備總RNA，使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)等制備mRNA。另外，通過使用QuickPrep mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)直接制備mRNA。
由得到的mRNA使用逆轉錄酶合成抗體V區(qū)域的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV逆轉錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒等進行。另外，進行cDNA的合成及擴增中也可以使用5′-Ampli FINDER RACE試劑盒(Clontech制)及PCR的5′-RACE法(Frohman，M.A.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998～9002；Belyavsky，A.et al.，Nucleic AcidsRes.(1989)17，2919～2932)。由得到的PCR產物純化目的DNA片斷，與載體DNA連結。進一步，由此制備重組載體、導入大腸桿菌等中、選擇集落制備所期望的重組載體。目的DNA的堿基序列可通過已知的方法、例如脫氧法確認。
若得到編碼目的抗體的V區(qū)域的DNA、將其和編碼期望的抗體恒定區(qū)域(C區(qū)域)的DNA連結，插入表達型載體中。另外，也可以將含有編碼抗體的V區(qū)域的DNA整合入含有抗體C區(qū)域的DNA的表達型載體中。
制備本發(fā)明中使用的抗體，是將下述的抗體基因整合入表達型載體，以使其在表達控制區(qū)域、例如在增強子、啟動子的控制下表達。然后，通過該表達型載體轉化宿主細胞、可以使抗體表達。
本發(fā)明中，以降低對人的異種抗原性等作為目的、可以使用人為地改變了的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體。這些修飾抗體可以用已知的方法制備。
嵌合抗體可通過將編碼上述得到的抗體V區(qū)域的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連結，通過將其整合入表達型載體中、導入宿主產生得到(參照歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO92-19759)。使用該已知方法，可以得到本發(fā)明中有用的嵌合抗體。
例如，含有編碼嵌合PM-1抗體的L鏈及H鏈的V區(qū)域的DNA的質粒，分別被命名為pPM-k3和pPM-h1，具有該質粒的大腸桿菌基于布達佩斯條約，在1991年2月11日分別作為NCIMB 40366和NCIMB 40362被國際保藏在國立工業(yè)和海洋微生物保藏有限公司。
人源化抗體也被稱為重構人抗體，是將人以外的哺乳動物、例如小鼠抗體的互補決定區(qū)(CDR)移植入人抗體的互補決定區(qū)得到的抗體，也知道其一般的基因重組方法(參照歐洲專利申請公開號EP 125023、國際專利申請公開號WO 92-19759)。
具體地說，設計為連結小鼠抗體的CDR和人抗體的構架區(qū)域(FR)的DNA序列，通過PCR法由在制造成末端部分具有重疊部分的多個寡核苷酸合成。將得到的DNA與編碼人抗體C區(qū)域的DNA連結，然后通過整合入表達型載體中，將其導入宿主產生可得到(參照歐洲專利申請公開號EP 239400、國際專利申請公開號WO 92-19759)。
通過CDR連結的人抗體的FR，可選擇互補決定區(qū)域形成良好的抗原結合部位的物質。根據(jù)需要，也可以置換抗體可變區(qū)域的構架區(qū)域的氨基酸以使重構人抗體的互補決定區(qū)形成適當?shù)目乖Y合部位(Sato，K.et al.，Cancer Res.(1993)53，851～856)。
在嵌合抗體、人源化抗體中也可以使用人抗體C區(qū)域。作為人抗體C區(qū)域，可以列舉Cγ，例如，可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，為了改善抗體及其產生的穩(wěn)定性，也可以修飾人抗體C區(qū)域。
嵌合抗體由來自人以外的哺乳動物的抗體的可變區(qū)域和來自人的抗體C區(qū)域構成，人源化抗體由來自人以外的哺乳動物的抗體的互補決定區(qū)域和來自人抗體的構架區(qū)域和C區(qū)域構成，為了降低人體內的抗原性，它們作為本發(fā)明中使用的抗體是有用的。
作為本發(fā)明中使用的人源化抗體的優(yōu)選具體實例，可以列舉人源化PM-1抗體(參照國際專利申請公開號WO 92-19759)。
如上所述構建的抗體基因，可以通過公知的方法使之表達、取得。在哺乳類細胞的情況下，可通過功能性結合了經常使用的有用的啟動子、被表達的抗體基因、在其3′側下游的poly A信號的DNA或含有該DNA的載體使之表達。例如作為啟動子/增強子，可以列舉人巨細胞病毒立即早期啟動子/增強子。
另外，作為其它在本發(fā)明中使用的可用于抗體表達時的啟動子/增強子，也可以使用逆轉錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿病毒40(SV40)等的病毒啟動子/增強子或人促進因子-1α(HEF1α)等來自哺乳類細胞的啟動子/增強子。
例如，使用SV 40啟動子/增強子時，按照Mulligan等的方法(Mulligan，R.C.et al.，Nature(1979)277，108～114)，或者，在使用HEF1α啟動子/增強子時，按照Mizushima等的方法(Mizushima，S.and Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易地實施。
在大腸桿菌的情況下，可以功能性結合被經常使用的有用的啟動子、為了抗體分泌的信號序列、被表達的抗體基因并使之表達。例如作為啟動子，可以列舉1acZ啟動子、araB啟動子。在使用1acZ啟動子時，可以按照Ward等的方法(Ward，E.S.et al.，Nature(1989)341，544～546；Ward，E.S.et al.FASEB J.(1992)6，2422～2427)，使用araB啟動子時，可以按照Better等的方法(Better，M.et al.Science(1988)240，1041～1043)。
作為為了抗體分泌的信號序列，在產生于大腸桿菌的周質間隙時，可以使用pelB信號序列(Lei，S.P.et al J.Bacteriol.(1987)169，4379～4383)。分離產生于周質間隙的抗體后，將抗體的結構適當?shù)卦僬郫B使用(例如，參照WO 96/30394)。
作為復制起點，可以使用來自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒(BPV)等的物質，進一步，為了增加宿主細胞系中的基因復制數(shù)量，表達型載體，可以含有氨基糖苷磷酸轉移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標記。
為了制備本發(fā)明中使用的抗體，可以使用任意的生產系。對于另制造抗體的生產系，有體外和體內的生產系。作為體外的生產系，可以列舉使用真核細胞的生產系或使用原核細胞的生產系。
使用真核細胞時，有使用動物細胞、植物細胞、或真菌細胞的生產系。作為動物細胞，已知(1)哺乳類細胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉鼠腎)、Hela、Vero等，(2)兩棲類細胞，例如爪蟾卵細胞，或(3)昆蟲細胞，例如sf9、sf21、Tn5等。作為植物細胞，已知來自煙草(Nicotiana tabacum)的細胞，可以將其進行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細胞，已知酵母、例如酵母(Saccharomyces)屬、例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，絲狀真菌、例如曲霉(Aspergillus)屬、例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核細胞時，有使用細菌細胞的生產系。作為細菌細胞，已知大腸桿菌(E.coli)、枯草桿菌。
通過轉化將目的抗體基因導入這些細胞中，通過在體外培養(yǎng)被轉化的細胞可得到抗體。培養(yǎng)按公知的方法進行。例如，作為培養(yǎng)液，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等的血清補液。另外，通過將導入了抗體基因的細胞移入動物的腹腔等，也可以在體內產生抗體。
另一方面，作為體內的生產系，可以列舉使用動物的生產系或使用植物的生產系。使用動物時，有使用哺乳類動物、昆蟲的生產系等。
作為哺乳動物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。另外，作為昆蟲，可以使用蠶。使用植物時，例如可以使用煙草。
在這些動物或植物中導入抗體基因，在動物或植物的體內使抗體產生，然后回收。例如，在編碼山羊β酪蛋白那樣的在乳汁中固有產生的蛋白質的基因中插入抗體基因作為融合基因進行制備。將含有插入了抗體基因的融合基因的DNA片斷注入山羊的胚胎中，將該胚胎導入母山羊體內。從容納該胚胎的山羊生出的轉基因山羊或其子孫產生的乳汁中可得到所期望的抗體。為了增加由轉基因山羊產生的含有期望抗體的乳汁量，也可以對轉基因山羊使用適宜的激素。(Ebert，K.M.et al.，Bio/Technology(1994)12，699～702)。
另外，使用蠶時，可使蠶感染插入了目的抗體基因的桿狀病毒，通過該蠶的體液得到期望的抗體(Maeda，S.et al.，Nature(1985)315，592～594)。另外，使用煙草時，在植物表達用載體、例如pMON 530中插入目的抗體基因，在根癌病菌樣的細菌中導入該載體。使煙、例如煙草感染該細菌，通過該煙葉可得到期望的抗體(Julian，K.-C.Ma et al.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131～138)。
如上所述，在用體外或體內的生產系產生抗體時，可以將編碼抗體重鏈(H鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別整合入表達型載體中、同時轉化宿主，或者也可以將編碼H鏈和L鏈的DNA整合入單一的表達型載體中、使宿主轉化(參照國際專利申請公開號WO 94-11523)。
本發(fā)明中使用的抗體，只要適于使用在本發(fā)明中，也可以是抗體的片斷或其修飾物。例如，作為抗體的片斷，可以列舉Fab、F(ab′)2、Fv或H鏈和L鏈的Fv用適當?shù)倪B接物連結而成的單鏈Fv(scFv)。
具體地說，抗體用酶、例如木瓜酶、胃蛋白酶處理生成抗體片斷，或者，構建編碼這些抗體片斷的基因、將其導入表達型載體中后，在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_(例如，參照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968～2976、Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476～496、Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，476～496、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652～663、Rousseaux，J.et al.，Methods in Enzymology(1989)121，663～669、Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132～137)。
scFv可以通過連結抗體的H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域得到。該scFv中，H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域通過連接物、優(yōu)選通過肽連接物連結(Huston，J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，5879～5883)。scFv中H鏈V區(qū)域和L鏈V區(qū)域可以是來自上述記載的抗體的任一種。作為連結V區(qū)域的肽連接物，可以使用例如由12～19個氨基酸殘基組成的任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA，可以通過將編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)域的DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)域的DNA作為模板，使用規(guī)定其兩端的引物對，通過PCR法將這些序列中編碼期望的氨基酸序列的DNA部分擴增，然后，進一步組合引物對并擴增得到，該引物規(guī)定編碼肽連接物部分的DNA并使其兩端分別連結H鏈、L鏈。另外，一旦制備編碼scFv的DNA、則可以按照常規(guī)方法得到含有它們的表達型載體和該表達型載體轉化的宿主，另外，使用該宿主按照常規(guī)方法，可以得到scFv。
這些抗體的片斷，可以與上述相同，取得它的基因并使之表達、通過宿主產生。本申請權利要求范圍內所說的“抗體”中也包含這些抗體的片斷。
作為抗體的修飾物，可以使用和聚乙二醇(PEG)等各種分子結合的抗體。本申請權利要求范圍內所說的“抗體”中也包含了這些抗體的片斷。為了得到這種抗體修飾物，可通過對得到的抗體進行化學修飾得到。這些方法在該領域已經被確立。
如上所述生產、表達的抗體可以從細胞內外、宿主分離純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可以用親和層析進行。作為親和層析中使用的層析柱，可以列舉例如蛋白質A柱、蛋白質G柱。作為蛋白質A柱中使用的載體，可以列舉例如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.等。此外，可以使用在通常的蛋白質中使用的分離、純化方法，沒有什么限制。
例如，若適當選擇、組合除上述親和層析以外的色譜法、過濾、超濾、鹽析、透析等，可以分離、純化本發(fā)明中使用的抗體。作為色譜法，可以列舉例如離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾等。這些色譜法適用于HPLC(高效液相色譜)。另外，也可以使用反相HPLC(反相HPLC)。
上述所得抗體的濃度測定可以通過吸光度的測定或ELISA等進行。即，用吸光度的測定時，用PBS(-)適當稀釋后、測定280nm的吸光度、1mg/ml相當于1.35OD、算出濃度。另外，用ELISA時，可以如下進行測定。即，將用0.1M碳酸氫鹽緩沖液(pH 9.6)稀釋至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAGO制)100μl加入96孔板(Nunc制)中，在4℃下溫育1夜、固定化抗體。封閉后、添加適當稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或作為標準品的人IgG(CAPPEL制)100μl、室溫下溫育1小時。
洗滌后，加入稀釋了5000倍的堿性磷酸酯酶標記的抗人IgG(BIOSOURCE制)100μl，在室溫下溫育1小時。洗滌后，加入底物溶液溫育后、用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)測定405nm的吸光度，算出目的抗體的濃度。
本發(fā)明中使用的IL-6變異體，具有和IL-6受體的結合活性、且為不傳遞IL-6的生物學活性的物質。即，雖然IL-6變異體相對于IL-6受體與IL-6競爭結合，但是由于不傳遞IL-6的生物學活性，故將阻斷IL-6產生的信號傳遞。
IL-6變異體是通過置換IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基、引入變異而制備的。雖然不管作為IL-6變異體原料的IL-6的由來，但是若考慮到抗原性等、優(yōu)選人IL-6。
具體地說，IL-6的氨基酸序列可以使用已知的分子模型程序、例如WHATIF(Vriend et al.，J.Mol.Graphics(1990)8，52～56)來預測其二次結構，通過進一步評價被置換的氨基酸殘基對總體的影響來進行。決定適當?shù)闹脫Q氨基酸殘基后、以含有編碼人IL-6基因的堿基序列的載體作為模板，按照通常使用的PCR法引入變異使氨基酸被置換，可以得到編碼IL-6變異體的基因。按照需要，將其整合入適當?shù)谋磉_型載體中、按照上述重組型抗體的表達、產生及純化方法可以得到IL-6變異體。
作為IL-6變異體的具體實例，在Brakenhoff et al.，J.Biol.Chem.(1994)269，86～93、及Savino et al.，EMBO J.(1994)13，1357～1367、WO 96-18648、WO 96-17869中有公開。
本發(fā)明中使用的IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，具有和各自IL-6受體或IL-6的結合活性，且為不傳遞IL-6生物學活性的物質。即，IL-6部分肽或IL-6受體部分肽與IL-6受體或IL-6結合，通過捕捉它們可特異地阻礙IL-6與IL-6受體的結合。其結果表明，由于不傳遞IL-6的生物學活性，因此將阻斷IL-6產生的信號傳遞。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽是由在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中與IL-6和IL-6受體的結合相關區(qū)域的一部分或全部的氨基酸序列組成的肽。這種肽通常由10～80、優(yōu)選為20～50、更優(yōu)選為20～40個氨基酸殘基組成。
IL-6部分肽或IL-6受體部分肽，可通過在IL-6或IL-6受體的氨基酸序列中特定與IL-6和IL-6受體的結合相關的區(qū)域，將其一部分或全部的氨基酸序列用通常已知的方法、例如基因工程方法或肽合成法來制備。
通過基因工程方法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可將編碼期望的肽的DNA序列整合入表達型載體中，按照上述重組型抗體的表達、產生及純化方法可以得到。
通過肽合成法制備IL-6部分肽或IL-6受體部分肽時，可以使用在肽合成中通常用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具體地說，也可以按照續(xù)藥品的開發(fā)第14卷肽合成監(jiān)修矢島治明廣川書店1991年中記載的方法進行。作為固相合成法，可以使用使與要合成的肽的C末端對應的氨基酸與例如在有機溶劑中不溶性的支撐體結合，通過交互重復進行將用適當?shù)谋Ｗo基團保護了α-氨基及側鏈官能團的氨基酸按從C末端到N末端方向的順序逐一縮合氨基酸的反應、和使樹脂上結合的氨基酸或肽的α-氨基的保護基團脫離的反應，使肽鏈延長的方法。固相肽合成法根據(jù)使用的保護基團種類，可大致分為Boc法和Fmoc法。
這樣合成目的肽后，進行脫保護反應以及將肽鏈從支撐體切斷的反應。與肽鏈的切斷反應中，在Boc法中可以通常使用氟化氫或三氟甲磺酸、而Fmoc法中可以使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氫中，在苯甲醚存在的情況下處理上述保護肽樹脂。然后，進行保護基團的脫離和支撐體的切斷、回收肽。通過將其凍結干燥、可以得到粗肽。另一方面，在Fmoc法中，例如在TFA中可以進行與上述相同的操作，進行脫保護反應以及從肽鏈切斷支撐體的反應。
得到的粗肽，由于適用于HPLC，可以進行分離、純化。洗脫時，可以使用在蛋白質的純化中通常使用的水-乙腈系溶劑在最適條件下進行。分別取得相當于所得色譜法的曲線峰的餾分、將其冷凍干燥。對于這樣純化的肽餾分、通過根據(jù)質譜分析的分子量解析、氨基酸組成分析、或氨基酸序列解析等來鑒定。
IL-6部分肽及IL-6受體部分肽的具體實例，在特開平2-188600、特開平7-324097、特開平8-311098及美國專利公報US 5210075中公開。
本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑的IL-6信號傳遞阻礙活性，可以用通常使用的方法評價。具體地說，培養(yǎng)IL-6依賴性細胞MH60.BSF2，向其中加入IL-6、同時使IL-6拮抗劑共存，由此可以測定IL-6依賴性細胞的3H-胸苷的攝取。另外，培養(yǎng)IL-6受體表達細胞U266、加入125I標記的IL-6，同時加入IL-6拮抗劑，由此測定與IL-6受體表達細胞結合的125I標記的IL-6。在上述分析體系中，如果除了使IL-6拮抗劑存在的組以外、還準備不含IL-6拮抗劑的陰性對照組，比較兩者得到的結果可以評價IL-6拮抗劑的IL-6抑制活性。
確認本發(fā)明的效果時，可以通過例如在移植CD4+CD45RBhighT細胞、產生類似牛皮癬病變的動物中給與本發(fā)明中使用的IL-6拮抗劑，觀察皮膚組織，評價牛皮癬類似病變的改善來進行。
為誘導牛皮癬類似病變的CD4+CD45RBhighT細胞例如可以通過F2(BALB/c×129/SvJ)小鼠脾臟來制備，可以按照下述實施例中記載的方法進行。另外，作為誘導牛皮癬類似病變的動物，可以使用例如小鼠等、優(yōu)選SCID小鼠等。
如下述實施例所示，通過給與抗IL-6受體抗體，在產生牛皮癬癥狀的實驗動物中，可以確認牛皮癬類似病變的改善、顯示出抗IL-6受體抗體等的IL-6拮抗劑具有牛皮癬治療效果。
本發(fā)明中治療對象為哺乳動物。治療對象的哺乳動物優(yōu)選為人。
本發(fā)明的預防或治療劑，可以口服或非口服地在全身或局部給藥。例如，可以選擇點滴等靜脈內注射、肌肉內注射、腹腔內注射、皮下注射、栓劑、灌腸、口服性腸溶劑等，根據(jù)患者的年齡、癥狀來選擇適當?shù)慕o藥方法。有效給藥量，每次在1kg體重0.01mg～100mg的范圍內選擇?；蛘?，也可以選擇給每個患者1～1000mg、優(yōu)選5～50mg的給藥量。
本發(fā)明的預防或治療劑，也可以同時含有在給藥路徑下藥物所容許的載體或添加物。作為這種載體及添加物的例子，可以列舉水、藥物中容許的有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、明膠、瓊脂、一縮二丙二醇、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蠟、硬脂酰醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作為藥品添加物容許的表面活性劑等。使用的添加物，按照劑型可以從上述中適宜選擇或組合使用，但不限于這些。
實施例方法按照Schon MP等(Nature Medicine(1997)3，183～188)的方法，將BALB/c小鼠脾臟細胞溶血后、用MACS柱及FACS Vantage，制備CD4+CD45RBhighT細胞，按4.0×105細胞/只i.p.移植入C.B-17 scid小鼠中。
細胞移植15分鐘后按2mg/只i.p.給藥抗IL-6受體抗體(MR16-1)。在陰性和陽性對照組(非細胞移植組和細胞移植組)中給與PBS。然后，在1mg/只/周下進行MR16-1給藥、從細胞移植后經過約8周后對小鼠施行安樂死、取其耳朵用福爾馬林固定。按照規(guī)定方法，制備病理組織，HE染色后，觀察耳的皮膚組織，按照下述標準進行牛皮癬類似病變的等級判定。
-正常、±稍微看出表皮肥厚、+看出表皮肥厚、++顯著看出表皮肥厚。
統(tǒng)計分析是通過SAS、進行Wilcoxson的定序和檢測、統(tǒng)計學顯著水平為5％。
結果如表1所示，通過移植細胞可以看到有意地牛皮癬類似病變等級上升、表示實驗系統(tǒng)確立。通過向細胞移植組中給與抗IL-6受體抗體MR16-1，可以確認能有意地改善牛皮癬類似病變等級。由此顯示，抗IL-6受體抗體成為新型牛皮癬治療藥的可能性。
表1病理組織評價

參考例1.人可溶性IL-6受體的制備使用含有編碼按Yamasaki等的方法(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825～828)得到的IL-6受體的cDNA的質粒pBSF2R.236，通過PCR法制備可溶性IL-6受體。用限制酶Sph I消化質粒pBSF2R.236，得到IL-6受體cDNA、將其插入mp18(Amersham制)中。使用設計為以便在IL-6受體cDNA中導入終止密碼子的合成寡引物，通過體外突變形成系統(tǒng)(Amersham制)、用PCR法在IL-6受體cDNA中導入變異。通過該操作終止密碼子被導入氨基酸345的位置，可得到編碼可溶性IL-6受體的cDNA。
為了在CHO細胞中表達可溶性IL-6受體，使其與質粒pSV(Pharmacia制)連結，得到質粒pSVL344。在含有dhfr的cDNA的質粒pECEdhfr中插入用Hind III-SalI切斷的可溶性IL-6受體cDNA，得到CHO細胞表達質粒pECEdhfr344。
通過磷酸鈣沉淀法(Chen，C.et al.，Mol.Cell.Biol.(1987)7，2745～2751)向dhfr-CHO細胞株DXB-11(Urlaub，G.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，4216～4220)轉染10μg的質粒pECEdhfr344。將轉染的CHO細胞用含有1mM谷氨酰胺、10％透析FCS、100U/ml青霉素和100μ/ml鏈霉素的不含核苷的αMEM選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3周。
被選擇的CHO細胞用極限稀釋法篩選，得到單一的CHO細胞克隆。用20nM～200nM濃度的氨基喋呤擴增該CHO細胞克隆，得到產生人可溶性IL-6受體的CHO細胞株5E27。用含有5％FBS的伊斯考夫改良的杜爾貝科培養(yǎng)基(IMDM、Gibco制)培養(yǎng)CHO細胞株5E27。回收培養(yǎng)上清液，用ELISA測定培養(yǎng)上清液中的可溶性IL-6受體的濃度。其結果表明，可以確認在培養(yǎng)上清液中存在可溶性IL-6受體。
參考例2.抗人IL-6抗體的制備用10μg的重組型IL-6(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41)和弗氏完全佐劑一起免疫BALB/c小鼠，每周連續(xù)進行免疫至血清中能檢出抗IL-6抗體為止。從局部淋巴節(jié)中取出免疫細胞，用聚乙二醇1500使其與骨髓瘤細胞株P3U1融合。按照使用HAT培養(yǎng)液的Oi等的方法(Selective Methods in Cellular Immunology，W.H.Freeman and Co.，SanFrancisco，351，1980)選擇雜交瘤，建立產生抗人IL-6抗體的雜交瘤。
產生抗人IL-6抗體的雜交瘤如下所示進行IL-6結合分析。即，將柔軟的聚乙烯制的96孔板(Dynatech Laboratories，Inc.制，Alexandria，VA)在0.1M的碳酸氫鹽碳酸鹽緩沖溶液(pH9.6)中用100μl的山羊抗小鼠Ig(10μg/ml，Cooper Biomedical，Inc制Malvern，PA)在4℃下包被一夜。然后，將板用含有100μl的1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS在室溫下處理2小時。
將其用PBS洗滌后，在各孔中加入100μl的雜交瘤培養(yǎng)上清液、在4℃下溫育一夜。洗滌該板后、在各孔中加入125I標記的重組型IL-6使其達到2000cpm/0.5ng/孔，洗滌后用γ計數(shù)器(Beckman Gamma 9000，Beckman Instruments，F(xiàn)ullerton，CA)測定各孔的放射活性。通過IL-6結合分析，216雜交瘤克隆中32個雜交瘤克隆為陽性。在這些克隆中可得到最終穩(wěn)定的MH166.BSF2。該雜交瘤產生的抗IL-6抗體MH166具有IgG1κ型的亞型。
然后，使用IL-6依賴性小鼠雜交瘤克隆MH60.BSF2調查與MH166抗體導致的雜交瘤增殖相關的中和活性。將MH60.BSF2細胞分別注入小孔中達到1×104/200μl/孔，向其中加入含有MH166抗體的試樣，培養(yǎng)48小時，加入0.5μCi/孔的3H胸苷(New England Nuclear，Boston，MA)后，進而連續(xù)培養(yǎng)6小時。將細胞放置在玻璃濾紙上，用自動采集機(LaboMash Science Co.，Tokyo，Japan)處理。作為對照使用兔抗IL-6抗體。
其結果，MH166抗體劑量依賴性地阻礙被IL-6誘導的MH60.BSF2細胞的3H胸苷的攝取。由此可知，MH166抗體中和IL-6的活性。
參考例3.抗人IL-6受體抗體的制備使按Hirata等的方法(Hirata，Y.et al.J.Immunol.(1989)143，2900～2906)制備的抗IL-6受體抗體MT18與通過CNBr活化的瓊脂糖4B(Pharmacia Fine Chemicals制，Piscataway，NJ)按照附上的配方結合，純化IL-6受體(Yamasaki，K.et al.，Science(1988)241，825～828)。將人骨髓瘤細胞株U266用含有1％毛地黃皂苷(Wako Chemicals制)、10mM三乙醇胺(pH7.8)及0.15M NaCl的1mM對氨基苯基甲磺酰氟鹽酸鹽(Wako Chemicals制)(毛地黃皂苷緩沖液)裂解，和與瓊脂糖4B珠結合的MT18抗體混合。然后，將該珠用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次、作為用于免疫的部分純化IL-6受體。
用由3×109個U266細胞得到的上述部分純化IL-6受體每10天免疫BALB/c小鼠4次，然后用常規(guī)方法制備雜交瘤。用下述方法調查來自陽性孔的雜交瘤培養(yǎng)上清液對IL-6受體的結合活性。用35S-蛋氨酸(2.5mCi)標記的5×107個U266細胞，用上述毛地黃皂苷緩沖液使之溶化。將可裂解的U266細胞和0.04ml容量的與瓊脂糖4B殊結合的MT18抗體混合，然后，用毛地黃皂苷緩沖液洗滌6次，使用0.25ml毛地黃皂苷緩沖液(pH3.4)使35S-蛋氨酸標記的的IL-6受體洗脫，用0.025ml的1M Tris(pH7.4)中和。
將0.05ml的雜交瘤培養(yǎng)上清液和0.01ml的蛋白G瓊脂糖(Phramacia制)混合。洗滌后，將瓊脂糖和上述制備的0.005ml35S標記的IL-6受體溶液一起溫育。用SDS-PAGE分析免疫沉降物，研究與IL-6受體反應的雜交瘤培養(yǎng)上清液。其結果確立了反應陽性雜交瘤克隆PM-1。產生于雜交瘤PM-1的抗體具有IgG1κ型的亞型。
用人骨髓瘤細胞株U266研究雜交瘤PM-1產生的抗體相對于人IL-6受體的IL-6的結合抑制活性。人重組型IL-6用大腸桿菌制備(Hirano，T.et al.，Immunol.Lett.(1988)17，41～45)、用Bolton-Hunter試劑(NewEngl and Nuclear，Boston，MA)進行125I標記的(Taga，T.et al.，J.Exp.Med.(1987)166，967～981)。
將4×105個U266細胞與70％(v/v)雜交瘤PM-1的培養(yǎng)上清液和14000cpm的125I標記的IL-6一起培養(yǎng)一小時。將70μl樣品鋪到400μl的微植菌聚乙烯管中的300μl的FCS上，離心后，測定細胞上的放射活性。
結果表明，雜交瘤PM-1產生的抗體抑制IL-6與IL-6受體的結合。
參考例4.抗小鼠IL-6受體抗體的制備通過Saito，T.et al.，J.Immunol.(1991)147，168～173記載的方法，制備對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
在含有10％FCS的IMDM培養(yǎng)液中培養(yǎng)產生小鼠可溶性IL-6受體的CHO細胞，從其培養(yǎng)上清液使用將抗小鼠IL-6受體抗體RS12(參照上述Saito，T.et al)固定于Affigel 10凝膠(Biorad制)的親和性色譜柱純化小鼠可溶性IL-6受體。
混合得到的小鼠可溶性IL-6受體50μg和弗氏完全佐劑，向ウイスタ一大鼠的腹部注射。2周后開始用弗氏不完全佐劑追加免疫。第45天采集大鼠脾臟細胞，使2×108個脾臟細胞按照常規(guī)方法與1×107個小鼠骨髓瘤細胞P3U1和50％的PEG1500(Boehringer Mannheim制)細胞融合后，在HAT培養(yǎng)基中篩選雜交瘤。
在包被了兔抗大鼠IgG抗體(Cappel制)的板上加入雜交瘤培養(yǎng)上清液后，使小鼠可溶性IL-6受體反應。然后，通過使用兔抗小鼠IL-6受體抗體和堿性磷酸酯酶標記的的綿羊抗兔IgG的ELISA法篩選對于小鼠可溶性IL-6受體產生抗體的雜交瘤。對已確認產生抗體的雜交瘤克隆進行2次亞篩選，得到單一的雜交瘤克隆。此克隆被命名為MR16-1。
用MH60.BSF2細胞(Matsuda，T.et al.，J.Immunol.(1988)18，951～956)用3H胸苷的攝取研究該雜交瘤產生的抗體在小鼠IL-6的信息傳遞中的中和活性。在96孔板上制備MH60.BSF2細胞至1×104個/200μl/孔。在該板上加入10pg/ml的小鼠IL-6和MR16-1抗體或RS12抗體12.3～1000ng/ml，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)44小時后，加入1μCi/孔的3H胸苷。4小時后測定3H胸苷的攝取。結果表明，MR16-1抗體抑制MH60.BSF2細胞的3H胸苷攝取。
因此表明，雜交瘤MR16-1產生的抗體，能阻礙IL-6與IL-6抗體的結合。
工業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明，顯示了抗IL-6受體抗體等的IL-6拮抗劑具有牛皮癬的治療效果。因此，可以明確IL-6拮抗劑作為牛皮癬等的治療劑是有用的。
對第13條規(guī)則的2中規(guī)定的被保藏微生物的說明國際保藏單位名稱獨立行政法人產業(yè)技術綜合研究所專利生物保藏中心地址 305-5466日本茨城縣つくば市東1段1號1中央第6保藏日及保藏號(1)保藏微生物的名稱HB101-pIBIBSF2R保藏日1989年1月9日保藏號FERM BP-2232(2)保藏微生物的名稱PM1保藏日1989年7月12日保藏號FERM BP-2998(3)保藏微生物的名稱大鼠-小鼠雜交餾MR16-1保藏日1997年3月13日保藏號FERM BP-587權利要求
1.一種牛皮癬的預防或治療劑，其中含有白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑作為有效成分。
2.如權利要求1記載的預防或治療劑，其中IL-6拮抗劑是對于IL-6受體的抗體。
3.如權利要求2記載的預防或治療劑，其中對IL-6受體的抗體為對IL-6受體的單克隆體抗體。
4.如權利要求3記載的預防或治療劑，其中對IL-6受體的抗體為對人IL-6受體的單克隆抗體。
5.如權利要求3記載的預防或治療劑，其中對IL-6受體的抗體為對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
6.如權利要求2～5的任一項記載的預防或治療劑，其中對IL-6受體的抗體為重組型抗體。
7.如權利要求4記載的預防或治療劑，其中對人IL-6受體的單克隆抗體為PM-1抗體。
8.如權利要求5記載的預防或治療劑，其中對小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
9.如權利要求2～4的任一項記載的預防或治療劑，其中對IL-6受體的抗體為對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
10.如權利要求9記載的預防或治療劑，其中對IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
11.一種白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑的用途，用于制備牛皮癬的預防或治療劑。
12.如權利要求11記載的用途，其中IL-6拮抗劑為對IL-6受體的抗體。
13.如權利要求12記載的用途，其中對IL-6受體的抗體為對IL-6受體的單克隆體抗體。
14.如權利要求13記載的用途，其中對IL-6受體的抗體為對人IL-6受體的單克隆抗體。
15.如權利要求13記載的用途，其中對IL-6受體的抗體為對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
16.如權利要求12～15的任一項記載的用途，其中對IL-6受體的抗體為重組型抗體。
17.如權利要求14記載的用途，其中對人IL-6受體的單克隆抗體為PM-1抗體。
18.如權利要求15記載的用途，其中對小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
19.如權利要求12～14的任一項記載的用途，其中對IL-6受體的抗體為對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
20.如權利要求19記載的用途，其中對IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
21.一種牛皮癬的預防或治療方法，包括向對象給與白細胞介素-6(IL-6)拮抗劑。
22.如權利要求21記載的方法，其中IL-6拮抗劑是對IL-6受體的抗體。
23.如權利要求22記載的方法，其中對IL-6受體的抗體為對IL-6受體的單克隆體抗體。
24.如權利要求23記載的方法，其中對IL-6受體的抗體為對人IL-6受體的單克隆抗體。
25.如權利要求23記載的方法，其中對IL-6受體的抗體為對小鼠IL-6受體的單克隆抗體。
26.如權利要求22～25的任一項記載的方法，其中對IL-6受體的抗體為重組型抗體。
27.如權利要求24記載的方法，其中對人IL-6受體的單克隆抗體為PM-1抗體。
28.如權利要求25記載的方法，其中對小鼠IL-6受體的單克隆抗體為MR16-1抗體。
29.如權利要求22～24的任一項記載的方法，其中對IL-6受體的抗體為對IL-6受體的嵌合抗體或人源化抗體。
30.如權利要求29記載的方法，其中對IL-6受體的人源化抗體為人源化PM-1抗體。
全文摘要
一種牛皮癬的預防或治療劑，含有白細胞介素－6(IL－6)拮抗劑、例如對IL－6受體的抗體。
文檔編號C07K16/28GK1471406SQ01817848
公開日2004年1月28日 申請日期2001年10月25日 優(yōu)先權日2000年10月25日
發(fā)明者伊藤裕章, 吉崎和幸, 西本憲弘, 岸本忠三, 島岡伸, 北村秀智, 杉本正道, 赤松健一, 一, 三, 幸, 弘, 智, 道 申請人:中外制藥株式會社