專利名稱：凝血因子VⅡ或VⅡa樣分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)多肽偶聯(lián)物，其制備及在治療中的用途，特別是治療多種凝血相關(guān)疾病的用途。
背景技術(shù)：
凝血是由多種血液組分(或因子)之間復(fù)雜的相互作用組成的逐漸導(dǎo)致纖維蛋白凝塊形成的過(guò)程。通常參與被稱為凝血“級(jí)聯(lián)反應(yīng)”的血液組分是原酶或酶原，即，不具有酶活性的蛋白，激活劑的作用可使其轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?。FVII就是這些凝血因子中的一種。
FVII是一種維生素K依賴性血漿蛋白，在肝中合成，并以分子量為53kDa的單鏈糖蛋白形式分泌到血液中(Broze & Majerus，J.Biol.Chem 1980；2551242-1247)。FVII酶原在單一位點(diǎn)R152-I153處被蛋白酶水解，產(chǎn)生由一個(gè)二硫鍵連接的雙鏈，從而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚孕问?FVIIa)。FVIIa與組織因子的復(fù)合體(FVIIa復(fù)合體)可將凝血因子IX和凝血因子X(jué)均轉(zhuǎn)變?yōu)槠浠钚孕问?，接下?lái)的反應(yīng)導(dǎo)致快速的凝血酶產(chǎn)生以及纖維蛋白形成(Osterud & Rapaport，Proc Natl Acad Sci USA 1977；745260-5264)。
FVII經(jīng)歷翻譯后修飾，包括依賴維生素K的羧基化，導(dǎo)致在該分子N末端區(qū)產(chǎn)生10個(gè)γ羧基谷氨酸殘基。因此，SEQ ID NO1中第6，7，14，16，19，20，25，26，29和35位殘基是Gla結(jié)構(gòu)域中對(duì)于FVII活性重要的γ羧基谷氨酸殘基。其他翻譯后修飾包括在第145和322位的兩個(gè)天然產(chǎn)生的N-糖基化位點(diǎn)，以及在第52和60位的兩個(gè)天然產(chǎn)生的O-糖基化位點(diǎn)處分別連接糖組分。
編碼人FVII(hFVII)的基因被定位于13號(hào)染色體的q34-qter9(de Grouchy等，Hum Genet 1984；66230-233)。其包含9個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為12.8Kb(O′Hara等，Proc Natl Acad Sci USA 1987；845158-5162)。FVII的基因組構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)與其它維生素K依賴性原凝血蛋白的結(jié)構(gòu)相似，外顯子1a和1b編碼信號(hào)序列；外顯子2編碼多肽和Gla結(jié)構(gòu)域；外顯子3編碼一段短的疏水區(qū)；外顯子4和5編碼表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域；以及外顯子6到8編碼絲氨酸蛋白酶的催化結(jié)構(gòu)域(Yoshitake等，Biochemistry 1985；243736-3750)。
利用X射線晶體成像的方法(Banner等，Nature，1996；38041和Zhang等，J.Mol.Biol，1999；2852089)，已報(bào)道了hFVIIa(Pike等，PNAS.U.S.A.，1999；968925-30和Kemball-Cook等，J.Struct.Biol，1999；127-213-223)，hFVIIa與可溶性組織因子的復(fù)合體，以及hFVII的小片段的實(shí)驗(yàn)三維結(jié)構(gòu)(Muranyi等，Biochemistry，1998；3710605和Kao等，Biochemistry，1999；387097)。
關(guān)于FVII蛋白工程化突變體的報(bào)道相對(duì)較少(Dickinson & Ruf，J BioChem，1997；27219875-19879，Kemball-Cook等，J Biol Chem，1998；2738516-8521，Bharadwaj等，J Biol Chem，1996；27130685-30691，Ruf等，Biochemsitry，1999；381957-1966)。
已報(bào)道了FVII在BHK或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)(WO92/15686，WO91/11514，WO88/10295)，以及FVII和kex2內(nèi)切蛋白酶在真核細(xì)胞中的共表達(dá)(WO00/28065)。
人重組FVIIa的商品化制劑以NovoSeven的名稱出售。NovoSeven指明用于治療血友病A或B患者的出血發(fā)作。NovoSeven是市售的可治療出血發(fā)作的唯一有效并且可靠的rFVIIa。
WO91/1154中報(bào)道了FVII的一種無(wú)活性形式，其中152的精氨酸和/或153的異亮氨酸被修飾。這些氨基酸位于活化位點(diǎn)。WO96/12800描述了一種絲氨酸蛋白酶抑制劑導(dǎo)致的FVIIa的失活；Petersen等說(shuō)明了FVIIa在I153的α氨基酸基團(tuán)氨甲?；瘜?dǎo)致的失活(Eur J Biochem，1999；261124-129)。這種失活形式可以與野生型FVII或FVIIa競(jìng)爭(zhēng)對(duì)組織因子的結(jié)合以及抑制凝血活性。這提示這種FVIIa的失活形式可用于治療極易產(chǎn)生凝血的患者，如患膿毒病的患者，其易于發(fā)作心肌梗塞或血栓性中風(fēng)。
在“Summary Basis for Approval for NovoSeven”(FDA參考號(hào)96-0597)中報(bào)道了rFVIIa的循環(huán)半壽期為2.3小時(shí)。相對(duì)高的劑量和頻繁地給藥對(duì)于達(dá)到并維持期望的療效和預(yù)防效果是必需的。因此，難以獲得足夠的劑量調(diào)控，而頻繁地靜脈給藥對(duì)于患者的生活方式造成了限制。
目前rFVIIa治療的另一個(gè)問(wèn)題是該分子對(duì)于蛋白酶解的相對(duì)不穩(wěn)定。與凍干粉產(chǎn)品相反，蛋白酶解是獲得溶液型制劑的一個(gè)主要障礙。獲得穩(wěn)定的溶液型制劑的好處在于方便患者操作，并且，在緊急情況下，便于更快地起作用，而這有可能是一種救生。在WO88/10295中公布了試圖通過(guò)對(duì)主要蛋白酶解位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)誘變預(yù)防蛋白酶的水解。
具有更長(zhǎng)循環(huán)半壽期的分子將降低必需的給藥次數(shù)。鑒于現(xiàn)有FVIIa需要經(jīng)常注射，而且很有可能在獲得更好的治療性FVIIa水平的同時(shí)增強(qiáng)療效，很明顯需要改進(jìn)FVIIa或FVIIa樣分子。
延長(zhǎng)蛋白的循環(huán)半壽期的一種方法是確保該蛋白的腎清除率降低。這可以通過(guò)將該蛋白與一種化學(xué)組分偶聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)，該化學(xué)組分可賦予該蛋白降低的腎清除率。
此外，化學(xué)組分與該蛋白的連接，或?qū)Ρ┞队诘鞍酌附庾饔玫陌被岬娜〈?，可有效阻止蛋白酶接觸從而避免對(duì)該蛋白的降解。聚乙二醇(PEG)就是一種這樣的化學(xué)組分，可用于制備治療性蛋白產(chǎn)品。
WO98/32466提示，F(xiàn)VII和其他許多蛋白一樣，可以被PEG化，但對(duì)此該文獻(xiàn)沒(méi)有提供更進(jìn)一步的信息。
發(fā)明簡(jiǎn)述本申請(qǐng)公開(kāi)了改進(jìn)的FVII和FVIIa分子，特別是重組的hFVII和hFVIIa分子，其提供一個(gè)或多個(gè)上述所期望的益處。所以，本發(fā)明偶聯(lián)物與現(xiàn)有商品化rFVIIa比較提供了一種或多種改進(jìn)的特性，包括延長(zhǎng)了功能性體內(nèi)半壽期和/或延長(zhǎng)了血漿半壽期，和/或增加了生物利用率和/或降低了對(duì)蛋白酶解的敏感性。因此，使用本發(fā)明偶聯(lián)物進(jìn)行治療可以獲得優(yōu)于現(xiàn)有rFVIIa復(fù)合物的多種優(yōu)點(diǎn)，如注射間隔更長(zhǎng)。
相應(yīng)的，一方面本發(fā)明涉及包含至少一個(gè)共價(jià)連接到多肽上的非多肽組分的偶聯(lián)物，其中該多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa的序列在于，其至少引入或去除一個(gè)包含所述多肽連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
本發(fā)明的另一方面涉及一種多肽，其中該多肽的氨基酸序列不同于SEQID NO1中野生型FVII或hFVIIa的氨基酸序列在于，其至少引入或去除一個(gè)包含所述多肽連接基團(tuán)的氨基酸殘基。這種新的FVII多肽被認(rèn)為可用于治療、診斷以及其他目的，但特別感興趣的是作為制備本發(fā)明偶聯(lián)物的中間產(chǎn)物。
另一方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物多肽部分的核苷酸序列；包含本發(fā)明核苷酸序列的表達(dá)載體；包含本發(fā)明核苷酸序列或本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明偶聯(lián)物的藥物組合物以及制備和使用這種偶聯(lián)物的方法。
發(fā)明詳述定義在本申請(qǐng)和本發(fā)明的全文中，使用下列定義術(shù)語(yǔ)“偶聯(lián)物”(或可互換為“偶聯(lián)的多肽”)表示由一個(gè)或多個(gè)多肽與一個(gè)或多個(gè)非多肽組分(如聚合物分子、親脂化合物、糖組分及有機(jī)衍生劑)共價(jià)連接而形成的雜合(復(fù)合或嵌合的意思)分子。優(yōu)選地，偶聯(lián)物在有關(guān)濃度和條件下是可溶的，即在生理液體如血液中可溶。本發(fā)明偶聯(lián)多肽的實(shí)施例包括糖基化的和/或PEG化的多肽。
術(shù)語(yǔ)“共價(jià)連接”表示該多肽和非多肽組分或者彼此直接共價(jià)連接，或者通過(guò)一個(gè)或多個(gè)間插組分，如橋、間隔子或連接部分，間接地共價(jià)連接。
術(shù)語(yǔ)“非偶聯(lián)多肽”是偶聯(lián)物的多肽部分。
本文所用術(shù)語(yǔ)“非多肽組分”表示能夠與本發(fā)明多肽的連接基團(tuán)偶聯(lián)的分子。此類分子的優(yōu)選實(shí)例包括聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機(jī)衍生劑。在本文中用于本發(fā)明的偶聯(lián)物時(shí)，應(yīng)理解為非多肽組分通過(guò)多肽連接基團(tuán)連接到偶聯(lián)物的多肽部分。如上說(shuō)明，非多肽組分可能直接共價(jià)地連接到連接基團(tuán)，或通過(guò)一個(gè)或多個(gè)間插組分，如橋、間隔子或連接部分，間接地共價(jià)連接到連接基團(tuán)。
術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”被定義為由兩個(gè)或多個(gè)單體共價(jià)連接形成的分子，其中所述單體無(wú)一是氨基酸殘基，除非聚合物是人白蛋白或另一種豐富血漿蛋白。術(shù)語(yǔ)“聚合物”可與術(shù)語(yǔ)“聚合物分子”互換。該術(shù)語(yǔ)涵蓋經(jīng)體外糖基化連接的碳水化合物分子，所述體外糖基化即體外進(jìn)行的合成性糖基化，其通常涉及碳水化合物分子與多肽連接基團(tuán)共價(jià)連接，任選使用交聯(lián)劑。
體內(nèi)糖基化如N-或O-糖基化(下文作進(jìn)一步描述)連接的碳水化合物分子在本文中稱作“糖組分”。除指明偶聯(lián)物中非多肽組分如聚合物分子或糖組分的數(shù)目外，偶聯(lián)物中所含或本發(fā)明其它部分所指的“非多肽組分”表示偶聯(lián)物中的一個(gè)或多個(gè)非肽部分，如聚合物分子或糖組分。
術(shù)語(yǔ)“連接基團(tuán)”表示多肽的能夠與非多肽組分如聚合物分子、糖組分、親脂性化合物或有機(jī)衍生劑偶聯(lián)的功能基團(tuán)，特別是其氨基酸殘基或碳水化合物組分。有用的連接基團(tuán)及其相配的非多肽組分表示在下圖中。
對(duì)于體內(nèi)N-糖基化來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“連接基團(tuán)”以非常規(guī)方式用于表示構(gòu)成N-糖基化位點(diǎn)的氨基酸殘基(序列為N-X-S/T/C，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸殘基，N是天冬酰胺并且S/T/C是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸，優(yōu)選絲氨酸或蘇氨酸并且最優(yōu)選蘇氨酸)。盡管N-糖基化位點(diǎn)的天冬酰胺殘基是在糖基化期間與糖組分連接的殘基，但這種連接不能完成，除非該N-糖基化位點(diǎn)存在其它氨基酸殘基。
因此，當(dāng)非多肽組分是糖組分，并且偶聯(lián)是通過(guò)N-糖基化實(shí)現(xiàn)時(shí)，與目的多肽氨基酸序列改變聯(lián)用的術(shù)語(yǔ)“含有非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基”應(yīng)理解為構(gòu)成N-糖基化位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被改變，改變方式是功能性的N-糖基化位點(diǎn)被引入氨基酸序列或從所述序列除去。
在本申請(qǐng)中，氨基酸命名和原子的命名(如，CA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、C等)按Protein DataBank(PDB)(www.pdb.org)所定義的來(lái)使用，此定義基于IUPAC命名法(IUPAC命名法以及氨基酸和肽的符號(hào)(殘基命名、原子命名等)，Eur.J.Biochem.，138，9-37(1984)以及其勘誤Eur.J.Biochem.，152，1(1985))。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸殘基”表示包含在下組中的氨基酸殘基丙氨酸(Ala或A)、半胱氨酸(Cys或C)、天冬氨酸(Asp或D)、谷氨酸(Glu或E)、苯丙氨酸(Phe或F)、甘氨酸(Gly或G)、組氨酸(His或H)、異亮氨酸(Ile或I)、賴氨酸(Lys或K)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸(Met或M)、天冬酰胺(Asn或N)、脯氨酸(Pro或P)、谷氨酰胺(Gln或Q)、精氨酸(Arg或R)、絲氨酸(Ser或S)、蘇氨酸(Thr或T)、纈氨酸(Val或V)、色氨酸(Trp或W)和酪氨酸(Tyr或Y)殘基。
用于鑒定氨基酸位置的術(shù)語(yǔ)舉例說(shuō)明如下G124表示SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中第124位被甘氨酸殘基占據(jù)，G124R表示第124位甘氨酸殘基被精氨酸殘基取代。備選取代可以“/”表示，如K32D/E表示第32位的賴氨酸被天冬氨酸或谷氨酸所取代。多取代以“+”表示，如K143N+X145S/T表示第143位賴氨酸殘基被天冬酰胺殘基所取代，并且第145位的天冬酰胺殘基被絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基所取代。額外氨基酸的插入，如在G124之后插入一個(gè)丙氨酸殘基，表示為G124GA。氨基酸殘基的缺失以星號(hào)表示。例如，第124位甘氨酸的缺失表示為G124*。除非另有說(shuō)明，此處氨基酸殘基的序號(hào)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO1所示野生型FVII/FVIIa的氨基酸序列。
此處所用與特定突變相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“不同于”是指除特定的氨基酸差異外許可存在另外的差異。例如，除了去除和/或引入包含非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基外，F(xiàn)VII或FVIIa多肽可能還包含與這些氨基酸殘基的引入和/或去除無(wú)關(guān)的其他取代。因此，除了此處公布的氨基酸改變(這些氨基酸改變目的在于，去除和/或引入非多肽組分的連接基團(tuán))外，可理解本發(fā)明多肽的氨基酸序列，如果需要可包含其他改變，這些改變不一定必須與連接位點(diǎn)的引入或去除有關(guān)，即其他的取代、插入或缺失。例如，這些改變可能包括去除N-和/或C末端的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或在N-和/或C末端引入一個(gè)或多個(gè)額外的氨基酸殘基，如在N末端加入一個(gè)甲硫氨酸殘基，以及“保守性氨基酸取代”，即，取代是在具有相同特性的氨基酸，例如，小氨基酸，酸性氨基酸，極性氨基酸，堿性氨基酸，疏水氨基酸和芳香族氨基酸之間進(jìn)行取代。
本發(fā)明中優(yōu)選的取代特別選自下表所列出的保守取代組。
術(shù)語(yǔ)“突變”和“取代”在此可互換使用。
術(shù)語(yǔ)“核苷酸序列”表示兩個(gè)或多個(gè)核苷酸分子的連續(xù)片段。核苷酸序列可以是基因組、cDNA、RNA、半合成或合成來(lái)源或其任意組合。
術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈反應(yīng)”或“PCR”通常指一種用于體外擴(kuò)增所需核苷酸序列的方法，例如，按美國(guó)專利4683195描述的方法。一般來(lái)說(shuō)，PCR方法涉及使用能夠與模板核酸優(yōu)先雜交的寡核苷酸引物來(lái)使引物延伸合成反應(yīng)反復(fù)循環(huán)“細(xì)胞”、“宿主細(xì)胞”、“細(xì)胞系”和“培養(yǎng)細(xì)胞”在本文中可互換使用并且這些術(shù)語(yǔ)都應(yīng)當(dāng)理解為包括細(xì)胞生長(zhǎng)或培養(yǎng)所產(chǎn)生的后代。“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可互換使用，指將DNA引入細(xì)胞的過(guò)程。
“可操作連接的”指兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列通過(guò)酶促連接等方式共價(jià)連接在彼此相關(guān)的構(gòu)象中，使序列行使正常功能。例如，編碼前序列或分泌前導(dǎo)序列的核苷酸序列如果表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，則被可操作性連接到該多肽的核苷酸序列上；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子如果能影響該序列的轉(zhuǎn)錄，則與編碼序列可操作性連接；核糖體的結(jié)合位點(diǎn)如果處在促進(jìn)翻譯的位置則與編碼序列可操作連接。通常，“可操作連接的”意指被連接的核苷酸序列是鄰接的，并且在分泌引導(dǎo)區(qū)的情況下，是鄰接的而且在閱讀狀態(tài)下。連接在方便的限制性位點(diǎn)來(lái)完成。如果不存在此類位點(diǎn)，那么使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭和標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法。
術(shù)語(yǔ)“引入”主要指包含非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基的引入，特別是通過(guò)取代現(xiàn)存氨基酸殘基，或者通過(guò)插入另外的氨基酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“去除”主要指包含非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基的去除，特別是通過(guò)將該氨基酸殘基用另外的氨基酸殘基取代的方式去除，或者使預(yù)去除的氨基酸殘基缺失(沒(méi)有取代)。
術(shù)語(yǔ)“FVIIa”或“FVII”多肽指單鏈形式的FVII分子。
術(shù)語(yǔ)“FVIIa”或“FVIIa多肽”指活化的雙鏈形式的FVIIa分子，其中所述單鏈形式R152和I153之間的肽鍵被剪切。當(dāng)本文中SEQ ID NO1的氨基酸序列用于說(shuō)明FVIIa的氨基酸序列時(shí)，應(yīng)理解其中一條鏈包含1-152位的氨基酸殘基，另一條鏈包含153-406位的氨基酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“rFVII”和“rFVIIa”分別指重組技術(shù)產(chǎn)生的FVII和FVIIa分子。
術(shù)語(yǔ)“hFVII”和“hFVIIa”分別指野生型人FVII和FVIIa。
術(shù)語(yǔ)“催化位點(diǎn)”用于指由FVII多肽的S344，D242和H193組成的催化三聯(lián)體。
術(shù)語(yǔ)“活性FVIIa”，“活性FVIIa多肽”，“活性FVIIa偶聯(lián)物”或“活性偶聯(lián)物”用于指具有至少10％的野生型hFVIIa催化活性的FVIIa多肽或偶聯(lián)物。文中所用催化活性可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)在檢測(cè)催化活性的方法章節(jié)或檢測(cè)低水平催化活性的方法章節(jié)中所說(shuō)明的方法來(lái)確定(參見(jiàn)文中材料和方法一節(jié))。用以上所述分析時(shí)，所述活性偶聯(lián)物優(yōu)選具有野生型hFVIIa催化活性的至少15％，例如至少20％，如至少25％，更優(yōu)選至少30％，如至少40％，最優(yōu)選至少50％，如至少60％。
優(yōu)選，活性偶聯(lián)物可以結(jié)合組織因子，并進(jìn)一步活化血漿凝血因子X(jué)和/或IX。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性FVIIa多肽或其偶聯(lián)物與野生型FVIIa相比，具有至少25％的凝血活性，如與野生型FVIIa相比具有至少50％的凝血活性，如與野生型FVII相比具有至少75％的凝血活性。因此，活性FVIIa多肽或其偶聯(lián)物的凝血活性與野生型FVIIa相比，優(yōu)選在25-200％的范圍內(nèi)。具體地，優(yōu)選FVIIa多肽或其偶聯(lián)物的凝血活性與野生型FVIIa相比在30-150％的范圍內(nèi)，如凝血活性與野生型FVIIa相比在30-100％的范圍內(nèi)。凝血活性可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法檢測(cè)，如在材料和方法一節(jié)中進(jìn)一步討論的。然而，特別優(yōu)選根據(jù)“檢測(cè)凝血活性的方法”章節(jié)(參見(jiàn)材料和方法部分)中說(shuō)明的方法確定凝血活性。
與給定的物質(zhì)聯(lián)用的術(shù)語(yǔ)“免疫原性”旨在表示該物質(zhì)可誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)反應(yīng)的能力。免疫反應(yīng)可以是細(xì)胞或抗體介導(dǎo)的反應(yīng)(對(duì)免疫原性更進(jìn)一步的定義參見(jiàn)，如，RoittEssential Immunnology(8th Edition，Blackwell))。一般來(lái)說(shuō)，抗體反應(yīng)性下降提示免疫原性下降。免疫原性可通過(guò)本領(lǐng)域任何已知的方法來(lái)測(cè)定，如體內(nèi)方法或體外方法。
術(shù)語(yǔ)“無(wú)活性FVIIa”，“無(wú)活性FVIIa多肽”，“無(wú)活性的FVIIa偶聯(lián)物”或“無(wú)活性偶聯(lián)物”用于指活性低于野生型hFVIIa催化活性的10％的FVIIa多肽或偶聯(lián)物。文中所用催化活性可適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)檢測(cè)催化活性的方法章節(jié)或檢測(cè)低水平催化活性的方法章節(jié)中所說(shuō)明的方法來(lái)確定(參見(jiàn)文中材料和方法章節(jié))。采用以上所述分析時(shí)，無(wú)活性偶聯(lián)物的催化活性優(yōu)選低于野生型hFVIIa催化活性的8％，如6％，例如低于5％，更優(yōu)選低于4％，如低于3％，最優(yōu)選低于2％，例如低于1％。
通常，無(wú)活性偶聯(lián)物與野生型hFVIIa相比，體外或體內(nèi)凝血活性顯著降低。這種無(wú)活性的FVII或FVIIa多肽或偶聯(lián)物可能與野生型FVII或FVIIa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合組織因子，從而抑制凝血活性。優(yōu)選這種無(wú)活性FVII或FVIIa多肽或偶聯(lián)物與野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低于野生型的1％。更優(yōu)選這種無(wú)活性FVII或FVIIa多肽或偶聯(lián)物與野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低于野生型的0.05％。最優(yōu)選這種無(wú)活性FVII或FVIIa多肽或偶聯(lián)物與野生型hFVII或hFVIIa相比，凝血活性低于野生型的0.01％。凝血活性可以與上述相同的方式，通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法來(lái)檢測(cè)，如在材料和方法中進(jìn)一步討論的。然而，特別優(yōu)選根據(jù)“檢測(cè)凝血活性的方法”章節(jié)(參見(jiàn)材料和方法部分)中說(shuō)明的方法確定凝血活性。
術(shù)語(yǔ)“功能性體內(nèi)半壽期”使用其通常的含義，即多肽或偶聯(lián)物在體內(nèi)/靶器官中仍具有50％生物活性的時(shí)間，或者多肽或偶聯(lián)物的活性為最初活性的50％的時(shí)間。作為測(cè)定功能性體內(nèi)半壽期的另一種方法，可測(cè)定“血清半壽期”，即，50％多肽或偶聯(lián)物分子在被清除之前在血漿或血流中循環(huán)的時(shí)間。血清半壽期的測(cè)定常常比測(cè)定功能性體內(nèi)半壽期簡(jiǎn)單并且血清半壽期的大小通?？梢院芎玫卣f(shuō)明功能性體內(nèi)半壽期大小。血清半壽期的其它可替換術(shù)語(yǔ)包括“血漿半壽期”、“循環(huán)半壽期”、“血清清除率”、“血漿清除率”和“清除半壽期”。該多肽或偶聯(lián)物通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)、腎、脾或肝中一個(gè)或多個(gè)的作用，通過(guò)組織因子、SEC受體或其他受體介導(dǎo)的清除作用，或通過(guò)特異或非特異的蛋白水解作用而清除。通常清除依賴于大小(相對(duì)于腎小球過(guò)濾的截留值而言)、電荷、連接的碳水化合物鏈，以及是否存在該蛋白的細(xì)胞受體。保留的功能通常選自前凝血?jiǎng)⒌鞍酌附饣蚴荏w結(jié)合活性。功能性體內(nèi)半壽期和血清半壽期可通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何合適的方法來(lái)測(cè)定，測(cè)定方法在下文材料和方法節(jié)作進(jìn)一步討論。
涉及功能性體內(nèi)半壽期或血漿半壽期的術(shù)語(yǔ)“增加”用于表示偶聯(lián)物或多肽的相應(yīng)半壽期經(jīng)可比條件下的測(cè)定，相對(duì)于參照分子如未偶聯(lián)的rFVIIa(如NovoSeven)的半壽期在統(tǒng)計(jì)學(xué)上是顯著增加的。例如，相應(yīng)的半壽期可能增加至少約25％，如至少約50％，例如增加至少約100％，150％，200％，250％，300％，500％或100％。
術(shù)語(yǔ)“腎清除”使用其通常的含義，即發(fā)生在腎的清除，例如，通過(guò)腎小球過(guò)濾、腎小管排泄或在腎小管細(xì)胞中的降解來(lái)完成。腎清除取決于偶聯(lián)物的物理特性，包括大小(直徑)流體體積、對(duì)稱性、形狀/剛性和電荷。通常來(lái)說(shuō)，大約為67kDa的分子量被認(rèn)為是腎清除的截留值。腎清除可通過(guò)任何合適的測(cè)定方法來(lái)建立，如已建立的體內(nèi)測(cè)定方法。通常，腎清除通過(guò)將標(biāo)記的(如，放射標(biāo)記的或熒光標(biāo)記的)多肽偶聯(lián)物給予患者并測(cè)定收集的患者尿液中的標(biāo)記物活性來(lái)測(cè)定。腎清除的下降經(jīng)過(guò)可比條件下與相應(yīng)參照多肽，如相應(yīng)的非偶聯(lián)多肽，非偶聯(lián)的相應(yīng)野生型多肽，或其他偶聯(lián)多肽(如與本發(fā)明無(wú)關(guān)的偶聯(lián)多肽)進(jìn)行比較而確定。優(yōu)選，偶聯(lián)物的腎清除率比相應(yīng)的參照多肽降低至少50％，優(yōu)選降低至少75％，最優(yōu)選降低至少90％。
本發(fā)明偶聯(lián)物表現(xiàn)對(duì)蛋白酶解敏感性降低的性質(zhì)是非常重要的；包含水解產(chǎn)物的組合物與那些偶聯(lián)物沒(méi)有被水解或僅有小部分被水解的組合物相比，通常具有更小的特異性。此外，給藥組合物中非生理降解產(chǎn)物可能會(huì)激發(fā)患者的免疫系統(tǒng)。
術(shù)語(yǔ)“對(duì)蛋白酶解降低的敏感性”主要指經(jīng)可比條件下的檢測(cè)，該偶聯(lián)物與非偶聯(lián)的野生型FVIIa相比，對(duì)蛋白酶解的敏感性降低。優(yōu)選，蛋白酶解降低了至少10％，如至少25％(例如降低了10％-25％)，更優(yōu)選降低了至少35％，如至少降低了50％(例如降低了10％-50％，如25％-50％，更優(yōu)選降低了60％，如至少降低了75％，或甚至降低了至少90％。更優(yōu)選，蛋白酶解降低了100％。因此，優(yōu)選本發(fā)明的偶聯(lián)物與野生型FVIIa相比蛋白酶解程度小，即與非偶聯(lián)的野生型FVIIa相比，本發(fā)明偶聯(lián)物的蛋白酶解優(yōu)選降低了10％-100％，如降低了25％-100％，更優(yōu)選降低了50％-100％，最優(yōu)選降低了75％-100％。
本發(fā)明人建立了一種合適的初步體外檢測(cè)方法，其可用于評(píng)估這種偶聯(lián)物對(duì)蛋白酶解的敏感性是否降低(自身蛋白酶解減少)。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，經(jīng)“對(duì)蛋白酶解敏感性降低的檢測(cè)”節(jié)中說(shuō)明的方法、“檢測(cè)催化活性”節(jié)中的方法或“檢測(cè)低水平催化活性方法”節(jié)(參見(jiàn)本文材料和方法節(jié))中說(shuō)明的方法檢測(cè)，本發(fā)明偶聯(lián)物與野生型FVIIa相比對(duì)蛋白酶解的敏感性降低。
術(shù)語(yǔ)“親代FVII”或“親代多肽”是指本發(fā)明中將被修飾的分子。典型的親代FVII是hFVII或hFVIIa(包括rFVIIa(NovoSeven))，其具有SEQ IDNO1所示氨基酸序列。
“變體”是一種多肽，其與親代多肽有一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的差異，通常有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個(gè)氨基酸殘基的差異。本發(fā)明的偶聯(lián)物本發(fā)明偶聯(lián)物是開(kāi)發(fā)FVII或FVIIa改進(jìn)分子的總體新策略產(chǎn)生的。更具體的，通過(guò)去除和/或引入含有所述非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基，特異地改變多肽使該分子更易于與選定的非多肽組分偶聯(lián)，使偶聯(lián)模式最佳化(如，確保非多肽組分以最適量最佳分布在FVII或FVIIa分子表面并確保分子中只存在將偶聯(lián)的連接基團(tuán))，從而獲得新的偶聯(lián)分子，其與現(xiàn)有的FVII和FVIIa分子相比，具有或不具有FVII的活性，此外具有一種或多種改進(jìn)的特性。例如，當(dāng)含有所選非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基總數(shù)增加到或降低到一個(gè)最佳水平時(shí)，該偶聯(lián)物的腎清除率通常因偶聯(lián)導(dǎo)致的分子形狀、大小和/或電荷的改變而顯著降低。
本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)VII或FVIIa多肽的一個(gè)以上的氨基酸殘基被改變，例如所述改變包括去除和引入包含所選非多肽的連接基團(tuán)的氨基酸殘基。除了去除和/或引入氨基酸殘基外，該多肽可能包含其他與非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基的去除和引入無(wú)關(guān)的取代或糖基化。該多肽還可能與絲氨酸蛋白酶抑制劑連接，以抑制該多肽的催化位點(diǎn)。
包含非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基，無(wú)論是被去除或引入，其選擇基于所選非多肽組分的性質(zhì)，并且，多數(shù)情況下，基于將多肽和非多肽組分之間偶聯(lián)所用的方法。例如，當(dāng)非多肽組分是聚合物分子，如聚乙二醇或聚環(huán)氧烷衍生的分子時(shí)，包含連接基團(tuán)的氨基酸殘基可選自賴氨酸，半胱氨酸，天冬氨酸，谷氨酸，組氨酸，或酪氨酸，優(yōu)選半胱氨酸和賴氨酸，特別優(yōu)選賴氨酸。
非多肽組分連接基團(tuán)被引入本發(fā)明FVII或FVIIa多肽中或從所述多肽中被去除時(shí)，進(jìn)行修飾的多肽部位優(yōu)選位于該多肽的表面，更優(yōu)選是由有25％以上側(cè)鏈暴露于溶劑中的那些氨基酸殘基占據(jù)的位置，優(yōu)選所述氨基酸超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于溶劑中。經(jīng)過(guò)對(duì)人FVII或FVIIa分子三維結(jié)構(gòu)的分析已鑒定出這些位置，所述方法見(jiàn)本文材料與方法一節(jié)。此外，該位置優(yōu)選是FVII分子中位于組織因子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)外和/或活性位點(diǎn)區(qū)外的部分。這些區(qū)域在下文材料和方法中得以識(shí)別。然而，值得強(qiáng)調(diào)的是，某些情況下(如期望獲得無(wú)活性的偶聯(lián)物)在這些區(qū)域內(nèi)或其附近進(jìn)行突變是有利的。例如，認(rèn)為非多肽組分的一個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)，如體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的連接基團(tuán)，插入到FVII分子的活性位置區(qū)或活性位置結(jié)合槽的脊上是有利的。在下文材料與方法中定義了這種活性位點(diǎn)區(qū)及活性位點(diǎn)結(jié)合槽的脊，其由以下殘基構(gòu)成I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F(xiàn)195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F(xiàn)328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344，G345，(3346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405(活性位置區(qū))；和N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370(活性位置結(jié)合槽的脊)
為了確定連接基團(tuán)的最佳分布，基于FVII或FVIIa分子的三維結(jié)構(gòu)計(jì)算該多肽表面的氨基酸殘基間的距離。更具體的，對(duì)包含這種連接基團(tuán)的氨基酸殘基的CB間的距離，或一種氨基酸的功能基團(tuán)(賴氨酸的NZ，天冬氨酸的CG，谷氨酸的CD，半胱氨酸的SG)與包含連接基團(tuán)的另一種氨基酸殘基的CB間的距離進(jìn)行了確定。對(duì)于甘氨酸，使用CA而非CB。在本發(fā)明偶聯(lián)物的FVII或FVIIa多肽部分中，任何所述距離優(yōu)選大于8，特別優(yōu)選大于10，以避免或降低異源偶聯(lián)。
去除連接基團(tuán)時(shí)，包含這種基團(tuán)并占據(jù)以上所述位置的相應(yīng)氨基酸殘基優(yōu)選用一種不同的氨基酸殘基取代，該氨基酸殘基不包含所述非多肽組分的連接基團(tuán)。通常，將要去除的氨基酸殘基是可產(chǎn)生不利偶聯(lián)的氨基酸殘基，如位于多肽功能位點(diǎn)或其附近的氨基酸殘基(因?yàn)檫@些位點(diǎn)的偶聯(lián)可能因破壞受體識(shí)別而導(dǎo)致所產(chǎn)生的偶聯(lián)物失活或FVII或FVIIa的活性降低)。本文中術(shù)語(yǔ)“功能位點(diǎn)”是指對(duì)于FVII或FVIIa的功能或作用必不可少的或有關(guān)的氨基酸殘基。這種氨基酸殘基是所述功能位點(diǎn)的一部分。該功能位點(diǎn)可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法確定，優(yōu)選通過(guò)對(duì)FVIIa-組織因子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行識(shí)別(參見(jiàn)Banner等，Nature 1996；38041-46)。
引入連接基團(tuán)時(shí)，包含這種基團(tuán)的氨基酸殘基被引入該位置，優(yōu)選通過(guò)取代占據(jù)該位置的氨基酸殘基實(shí)現(xiàn)。
FVII或FVIIa多肽中存在并可用于偶聯(lián)的連接基團(tuán)的確切數(shù)量依賴于期望通過(guò)偶聯(lián)達(dá)到的效果。獲得的效果取決于，例如偶聯(lián)的性質(zhì)和程度(例如非多肽組分的確定，期望或可能與多肽偶聯(lián)的非多肽的數(shù)目，偶聯(lián)應(yīng)該發(fā)生的部位或應(yīng)該避免偶聯(lián)發(fā)生的部位等)。
功能性體內(nèi)半壽期取決于偶聯(lián)物的分子量，而延長(zhǎng)半壽期所需連接基團(tuán)的數(shù)目因此依賴于所述非多肽組分的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)通過(guò)Laemmli，U.K.，Nature Vol 227(1970).P680-85中的SDS-PAGE測(cè)定時(shí)，本發(fā)明偶聯(lián)物具有至少67kDa，特別是至少70kDa的分子量。FVII具有大約53kDa的分子量，因此，為獲得所期望的作用，需要另外添加大約10-20kDa。這可通過(guò)例如，偶聯(lián)2到4個(gè)10kDa的PEG分子或本文描述的其它方法實(shí)現(xiàn)。
為了避免對(duì)親代分子的結(jié)構(gòu)和功能造成太多破壞，通常偶聯(lián)物的多肽部分具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列90％以上的同一性，優(yōu)選95％以上，如96％以上。具體的，偶聯(lián)物多肽部分通常具有與SEQ ID NO1所示氨基酸序列97％以上的同一性，如98％以上，99％以上，99.25％以上，99.25％以上或99.5％以上。
氨基酸序列同源性/同一性可以便利地用如ClustalW程序(版本1.8，1999年6月)，使用缺省參數(shù)經(jīng)序列比對(duì)確定(Thompson等，1994，ClustalWImproving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting，position-specific gap penalties and weight matrix choice，Nucleic Acids Research，224673-4680)，或通過(guò)使用GENEDOC版本2.5(Nicholas，K.B.，Nicholas H.B.Jr.，and Deerfield，D.W.II.1997 GeneDocAnalysis and Visualization of Genetic Variation，EMBNEW.NEWS 414；Nicholas，K.B.and Nicholas H.B.Jr.1997 GeneDocAnalysis and Visualizationof Genetic Variation)從PEAM家族信息庫(kù)版本4.0(http//pfam.wustl.edu/)(NucleicAcids Res.1999 Jan 1；27(1)260-2)中確定。
換一種說(shuō)法，根據(jù)本發(fā)明將改變的氨基酸殘基的總數(shù)(與SEQ ID NO1氨基酸序列相比)通常不超過(guò)15個(gè)。優(yōu)選，本發(fā)明偶聯(lián)物的FVII或FVIIa多肽部分或本發(fā)明的多肽包含一個(gè)氨基酸序列，其與SEQ ID NO1所示氨基酸序列有1-15個(gè)氨基酸殘基，通常是1-10個(gè)或2-10個(gè)氨基酸殘基的差異，例如1-8個(gè)或2-8個(gè)氨基酸殘基，如3-7個(gè)或4-6個(gè)氨基酸殘基的差異。因此，通常偶聯(lián)物的多肽部分或本發(fā)明的多肽包含與SEQ ID NO1所示氨基酸序列不同的氨基酸序列，其區(qū)別至多為15個(gè)氨基酸殘基(如15個(gè)氨基酸殘基)，至多14個(gè)氨基酸殘基(如14個(gè)氨基酸殘基)，至多13個(gè)氨基酸殘基(如13個(gè)氨基酸殘基)，至多12個(gè)氨基酸殘基(如12個(gè)氨基酸殘基)，至多11個(gè)氨基酸殘基(如11個(gè)氨基酸殘基)，至多10個(gè)氨基酸殘基(如10個(gè)氨基酸殘基)，至多9個(gè)氨基酸殘基(如9個(gè)氨基酸殘基)，至多8個(gè)氨基酸殘基(如8個(gè)氨基酸殘基)，至多7個(gè)氨基酸殘基(如7個(gè)氨基酸殘基)，至多6個(gè)氨基酸殘基(如6個(gè)氨基酸殘基)，至多5個(gè)氨基酸殘基(如5個(gè)氨基酸殘基)，至多4個(gè)氨基酸殘基(如4個(gè)氨基酸殘基)，至多3個(gè)氨基酸殘基(如3個(gè)氨基酸殘基)，至多2個(gè)氨基酸殘基(如2個(gè)氨基酸殘基)。
類似地，本發(fā)明的偶聯(lián)物通常包含，如1-15個(gè)非多肽組分，通常1-10個(gè)非多肽組分或2-10個(gè)非多肽組分，如1-8或2-8個(gè)非多肽組分，如1-6，1-4，3-7或4-6個(gè)非多肽組分。
優(yōu)選，本發(fā)明偶聯(lián)物與rFVIIa(如NovoSeven)相比，具有一項(xiàng)或多項(xiàng)以下改進(jìn)的特性功能性體內(nèi)半壽期延長(zhǎng)；血漿半壽期延長(zhǎng)，腎清除率降低以及對(duì)蛋白酶解的敏感性降低。
從WO88/10295中獲知FVII/FVIIa的蛋白酶解發(fā)生在該分子中的多個(gè)蛋白酶解位點(diǎn)，即在K32，K38，I42，Y44，K143，R290，R315，K341，R392，R396以及R402(或位于K32-D33，K38-L39，I42-S43，Y44-S45，K143-R144，R290-G291，R315-K316，K341-G342，R392-S393，R396-P397以及R402-A403之間)。因此，增加例如功能性體內(nèi)半壽期、增加血漿半壽期或降低對(duì)蛋白酶解敏感性的一個(gè)優(yōu)選策略是在這些蛋白酶解位點(diǎn)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)和/或其附近改變親代多肽，所用方法是在這些位點(diǎn)上或其附近引入非多肽組分。因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在上述鑒定出的一個(gè)或多個(gè)位置上，或相對(duì)于直接參與蛋白酶解的位置-4，-3，-2，-1，1，2，3，4，優(yōu)選位置-2，-1，1，2，如位置-1，1上，引入了連接基團(tuán)。
更具體的，優(yōu)選將非天然產(chǎn)生的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，特別是非天然產(chǎn)生的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)(參見(jiàn)以下)，引入選自以下的位置28-48，139-147，286-294，311-319，338-345和388-406。具體的，優(yōu)選將體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，如體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)(參見(jiàn)以下)，引入選自以下的位置30-34，36-46，141-144，288-292，313-317，341-343，390-398和400-404。更優(yōu)選，將體內(nèi)糖基化位點(diǎn)，如體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)(參見(jiàn)以下)，引入選自以下的位置31-33(如31，32或33位)，37-39(如37，38或39位)，41-46(如41，42，43，45或46位)，142-144(如142，143或144位)，289-291(如289，290或291位)，314-316(如314，315或316位)，341-342(如341，342或343位)，391-393(如391，392或393位)，395-397(如395，396或397位)和401-403(如401，402或403位)。本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中是非多肽組分是具有賴氨酸作為連接基團(tuán)的分子本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，非多肽組分包含賴氨酸作為連接基團(tuán)，即，本發(fā)明偶聯(lián)物包含至少一個(gè)與多肽共價(jià)偶聯(lián)的非多肽組分，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa的氨基酸序列在于，其引入或去除了至少一個(gè)氨基酸殘基。
FVII/FVIIa包含17個(gè)賴氨酸殘基。三個(gè)賴氨酸殘基(K18，K62和K85)位于組織因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)賴氨酸殘基(K197和K341)位于活性位點(diǎn)區(qū)。
由于賴氨酸殘基在親代多肽中的相對(duì)高含量，認(rèn)為至少一個(gè)賴氨酸殘基應(yīng)該優(yōu)選被去除，特別是通過(guò)用非賴氨酸殘基取代賴氨酸殘基去除，以避免對(duì)非多肽組分的過(guò)度偶聯(lián)。
因此，一個(gè)實(shí)施方案中，偶聯(lián)物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示不同，差異在于，優(yōu)選通過(guò)取代去除了至少一個(gè)賴氨酸殘基，如1-15賴氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4賴氨酸殘基。例如，優(yōu)選通過(guò)取代去除的賴氨酸殘基選自K18，K32，K38，K62，K85，K109，K137，K143，K148，K157，K161，K197，K199，K316，K337，K341，K389或其組合。具體的，優(yōu)選去除賴氨酸殘基，該殘基是組織因子結(jié)合位點(diǎn)和/或活性位點(diǎn)區(qū)的組成部分，即，殘基K18，K62，K85，K197，K341或其組合物。這種賴氨酸殘基可以用任何其他氨基酸殘基取代，但優(yōu)選被R，Q，N或H，更優(yōu)選被R取代。
另一實(shí)施方案中，偶聯(lián)物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQID NO1所示的序列不同，區(qū)別在于引入了至少一個(gè)賴氨酸殘基，如1-15賴氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4賴氨酸殘基，優(yōu)選通過(guò)替代引入?？衫斫?，在親代分子預(yù)定位點(diǎn)引入至少一個(gè)賴氨酸殘基，與上述至少一個(gè)賴氨酸殘基的去除組合是優(yōu)選的。因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，偶聯(lián)物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示的序列不同，區(qū)別在于去除了至少一個(gè)賴氨酸殘基并且引入了至少一個(gè)賴氨酸殘基。
賴氨酸殘基可被引入的位置包括，但不限于上述蛋白酶解位點(diǎn)或其附近。因此，一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用賴氨酸殘基取代非賴氨酸殘基可選自I42K，Y44K，L288K，D289K，R290K，G291K，A292K，T293K，Q313K，S314K，R315K，V317K，L390K，M391K，R392K，S393K，E394K，P395K，R396K，P397K，G398K，V399K，L400K，L401K，R402K，A403K，P404K，F(xiàn)405K以或其組合，特別選自R290K，R315K，R392K，R396K，R402K或其組合。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，偶聯(lián)物的非多肽組分可以是任何分子，當(dāng)使用給定的偶聯(lián)方法以賴氨酸為連接基團(tuán)時(shí)，優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子。所述聚合物分子可以是“與聚合物分子偶聯(lián)”一節(jié)中提及的任何分子，但優(yōu)選選自線性或分支PEG或另一聚環(huán)氧烷。優(yōu)選的聚合物分子的實(shí)例是來(lái)自Shearwater Polymers，Inc.的SS-PEG、NPC-PEG、醛-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC；來(lái)自Enzon，Inc.的SC-PEG；US5880255所述的tresylated mPEG；或氧羰基-氧-N-二羧基酰亞胺-PEG(US5122614)。
一般來(lái)說(shuō)，與賴氨酸殘基偶聯(lián)時(shí)，非多肽組分的分子量約為5到約20kDa，例如從大約5到大約10kDa，如約5kDa或約10kDa。
應(yīng)該理解本部分所述的任何氨基酸改變，尤其是取代，可與任何氨基酸改變組合，優(yōu)選與本文中其他部分所述的特定取代的特定氨基酸改變，包括糖基化位點(diǎn)的引入和/或去除組合。本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是具有半胱氨酸作為連接基團(tuán)的分子本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，非多肽組分以半胱氨酸作為連接基團(tuán)，即本發(fā)明偶聯(lián)物包含至少一個(gè)與多肽共價(jià)偶聯(lián)的非多肽組分，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO1中野生型人FVII或FVIIa之處在于，至少引入或去除了一個(gè)半胱氨酸殘基。
FVII/FVIIa包含24個(gè)半胱氨酸殘基，二硫鍵在以下半胱氨酸殘基之間建立C17和C22，C50和C61，C55和C70，C72和C81，C91和C102，C98和C112，C114和C127，C135和C262，C159和C164，C178和C194，C310和C329，以及C340和C368之間。
另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQ IDNO1中的不同，差異在于引入至少一個(gè)賴氨酸殘基，如1-15個(gè)賴氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4個(gè)賴氨酸殘基，優(yōu)選通過(guò)取代引入。
可引入賴氨酸殘基的位置包括，但不限于上述蛋白酶解位點(diǎn)或其附近。
因此本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)取代引入的賴氨酸殘基選自I30C，K32C，D33C，A34C，T37C，K38C，W41C，Y44C，S45C，D46C，L141C，E142C，K143C，R144C，L288C，D289C，R290C，G291C，A292C，S314C，R315C，K316C，V317C，L390C，M391C，R392C，S393C，E394C，P395C，R396C，P397C，G398C，V399C，L401C，R402C，A403C，P404C或其組合，特別選自K32C，Y44C，K143C，R290C，R315C，K341C，R392C，R396C，R402C或其組合。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基被引入野生型hFVII中由具有至少25％的側(cè)鏈暴露于表面的那些蘇氨酸或絲氨酸殘基所占據(jù)的位置。例如，在FVII或FVIIa多肽的至少一個(gè)位點(diǎn)上，優(yōu)選通過(guò)取代引入半胱氨酸殘基，所述位點(diǎn)選自S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，S232，T233，T238，T239，T255，T267，T293，T307，S320，T324，S333，S336，T370和S393。更優(yōu)選hFVII中至少一個(gè)含S殘基的位點(diǎn)上引入半胱氨酸殘基，所述位點(diǎn)選自S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S232，S320，S333，S336和S393。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基被引入野生型hFVII中由具有至少50％側(cè)鏈暴露于表面的那些蘇氨酸或絲氨酸殘基所占據(jù)的位置。例如，在FVII或FVIIa多肽的至少一個(gè)位置上優(yōu)選通過(guò)取代引入一個(gè)半胱氨酸殘基，所述位置選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214，T238，T267和T293，更優(yōu)選所述位置選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，S111，S119，S147和S214。
進(jìn)一步的實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基被引入至少一個(gè)選自上述任一位置且并非活性位點(diǎn)區(qū)的位置。優(yōu)選該位置由T或S殘基占據(jù)。例如，F(xiàn)VII多肽包含引入到至少一個(gè)選自下組的位置上的半胱氨酸殘基S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，T255，T267，T307，S320，S333，S336，T370和S393(其超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露于表面)，所述位置特別選自S12，S23，S43，S45，S52，S53，S60，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S320，S333，S336和S393(由S殘基占據(jù))，更優(yōu)選選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214和T267(其超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于表面)，特別選自S23，S43，S52，S53，S60，S67，S111，S119，S147和S214(由S殘基占據(jù))。
另外的實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基被引入至少一個(gè)選自上述任一位置且并非組織因子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)的位置。優(yōu)選該位置由T或S殘基占據(jù)。例如，F(xiàn)VII多肽包含引入至少一個(gè)位置上的半胱氨酸殘基，所述的位置選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，S232，T233，T238，T239，T255，T267，T293，S320，T324，S333，S336，T370和S393(其超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露于表面)，特別選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S232，S233，S320，S333，S336和S393(由S殘基占據(jù))，更優(yōu)選選自S23，S52，S53，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214，T238，T267和T297(其超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于表面)，特別選自S23，S52，S53，S67，S111，S119，S147和S214(由S殘基占據(jù))。
另外的實(shí)施方案中，半胱氨酸殘基被引入至少一個(gè)選自上述任一位置且并非組織因子結(jié)合位點(diǎn)區(qū)或活性位點(diǎn)區(qū)的位置。優(yōu)選該位置由T或S殘基占據(jù)。例如，F(xiàn)VII多肽包含引入至少一個(gè)位置上的半胱氨酸殘基，所述位置選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，T83，S103，T106，T108，S111，S119，S126，T128，T130，S147，T185，S214，S222，T255，T267，S320，S333，S336，T370和S393(其超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露于表面)，特別選自S12，S23，S45，S52，S53，S67，S103，S111，S119，S126，S147，S214，S222，S320，S333，S336和S393(由S殘基占據(jù))，更優(yōu)選選自S23，S52，S53，S67，T106，T108，S111，S119，S147，S214和T267(其超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于表面)，特別選自S23，S52，S53，S67，S111，S119，S147和S214(由S殘基占據(jù))。
盡管根據(jù)本發(fā)明這方面，偶聯(lián)物的非多肽組分可以是任何分子，但當(dāng)使用給定的偶聯(lián)方法，以半胱氨酸作為連接基團(tuán)時(shí)，優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子。聚合物分子可以是以“與聚合物分子的偶聯(lián)”為標(biāo)題的章節(jié)中描述的任何分子，但優(yōu)選選自線性或分支的聚乙二醇或另一聚環(huán)氧烷。一個(gè)實(shí)施方案中聚合物分子是PEG，如VS-PEG。多肽和聚合物之間的偶聯(lián)可以任何合適的方式來(lái)完成，如以“與聚合物分子的偶聯(lián)”為標(biāo)題的章節(jié)中描述的，例如使用一步法或在所述章節(jié)中所涉及的多步法。當(dāng)FVII或FVIIa多肽僅包含一個(gè)可偶聯(lián)的半胱氨酸殘基時(shí)，優(yōu)選與具有約5kDa到約20kDa分子量(如從約10kDa到約20kDa，如分子量約為5kDa，約為10kDa，約為12kDa，約為15kDa，或約為20kDa)的非多肽組分偶聯(lián)，或者直接偶聯(lián)或者通過(guò)低分子量聚合物間接偶聯(lián)(按WO99/55377所公開(kāi)的方法)。當(dāng)偶聯(lián)物包含兩個(gè)或多個(gè)可偶聯(lián)的半胱氨酸殘基時(shí)，這些非多肽組分各自的分子量通常為約5到約10kDa，如約5kDa或約10kDa。
應(yīng)該理解本部分所述的任何氨基酸的改變，尤其是取代，可與任何其他部分所述的氨基酸改變組合，優(yōu)選本文中公開(kāi)特定氨基酸改變的其他部分所述的特定取代，包括糖基化位點(diǎn)的引入和/或去除。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是具有天冬氨酸或谷氨酸作為連接基團(tuán)的分子本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，非多肽組分以天冬氨酸或谷氨酸作為連接基團(tuán)，即本發(fā)明偶聯(lián)物包含至少一個(gè)與多肽共價(jià)偶聯(lián)的非多肽，所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa序列之處在于，引入或去除至少一個(gè)天冬氨酸殘基和/或至少一個(gè)谷氨酸殘基。
另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)VII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQ IDNO1所示不同，差異在于引入至少一個(gè)天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基，如1-15個(gè)天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4個(gè)天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基，優(yōu)選通過(guò)取代引入。
可引入天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的位置包括，但不限于上述蛋白酶解位點(diǎn)處，或其附近。
因此，本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選通過(guò)取代引入的天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基選自I30D/E，K32D/E，A34D/E，T37D/E，K38D/E，W41D/E，Y44D/E，S45D/E，D46C，L141D/E，E142D/E，K143D/E，R144D/E，L288D/E，R290D/E，G291D/E，A292D/E，Q313D/E，S314D/E，R315D/E，K316D/E，V317D/E，L390D/E，M391D/E，R392D/E，S393D/E，P395D/E，R396D/E，P397D/E，G398D/E，V399D/E，L401D/E，R402D/E，A403D/E，P404D/E或其組合，特別選自以下組或其組合K32D/E，Y44D/E，K143D/E，R290D/E，R315D/E，K341D/E，R392D/E，R396D/E，R402D/E。
除了上述取代，根據(jù)以上實(shí)施方案偶聯(lián)物的多肽可包含至少一個(gè)天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基的去除，優(yōu)選是通過(guò)取代。
由于賴氨酸殘基在親代多肽中的相對(duì)高含量，認(rèn)為優(yōu)選至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基應(yīng)該被去除，特別是通過(guò)取代，以避免非多肽組分的過(guò)度偶聯(lián)。
因此，一個(gè)實(shí)施方案中，偶聯(lián)物的FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示不同，差異在于去除至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基，如1-15個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基，特別是1-10，1-6或2-4個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基，優(yōu)選通過(guò)取代去除。例如，優(yōu)選通過(guò)取代去除的天冬氨酸或谷氨酸殘基選自D33，D46，D48，E77，E82，D86，D87，E94，E99，D104，E116，D123，E132，E142，E163，D196，E210，D212，E215，D217，D219，E220，D256，E265，E270，D289，E296，D309，D319，E325，D334，D338，D343，E385，E394或其組合。
應(yīng)理解，向親代分子預(yù)定位點(diǎn)引入的至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基，與至少一個(gè)上述天冬氨酸或谷氨酸殘基的去除組合是尤其優(yōu)選的。因此，本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，偶聯(lián)物FVII或FVIIa多肽部分的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示不同，區(qū)別在于至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基被去除(優(yōu)選通過(guò)替代)并且至少一個(gè)天冬氨酸或谷氨酸殘基被引入(優(yōu)選通過(guò)替代)。
根據(jù)本發(fā)明這一方面，具有天冬氨酸基團(tuán)或谷氨酸基團(tuán)作為其連接基團(tuán)的偶聯(lián)物非多肽組分，可以是具有這種特性的任何非多肽組分，優(yōu)選非多肽組分是聚合物分子或有機(jī)衍生試劑，特別是聚合物分子，并且偶聯(lián)物的制備如Sakane和Pardridge Pharmaceutical Research，Vol.14，No.8，1997，pp1085-1091。
應(yīng)該理解所述本部分所述的任何氨基酸改變，尤其是取代，可與任何其他部分所述的氨基酸改變組合，尤其本文中公開(kāi)氨基酸改變的其他部分的特定取代，包括糖基化位點(diǎn)的引入和/或去除。
本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是糖組分本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，插入和/或去除了糖組分的連接基團(tuán)，如糖基化位點(diǎn)，特別是體內(nèi)的糖基化位點(diǎn)。
優(yōu)選，本發(fā)明的偶聯(lián)物包含至少一個(gè)與多肽共價(jià)連接的糖組分，其中所述多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa序列區(qū)別在于，其中至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)被引入和/或至少一個(gè)天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)被去除。尤其，天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)的去除與非天然糖基化位點(diǎn)的引入，或非天然糖基化位點(diǎn)的去除組合。引入的糖基化位點(diǎn)可以是O-糖基化位點(diǎn)或N-糖基化位點(diǎn)。優(yōu)選糖基化位點(diǎn)是體內(nèi)O-糖基化位點(diǎn)或體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)，特別優(yōu)選體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)。
用于本文的術(shù)語(yǔ)“天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)”包括在N145，N322，S52和S60位置的糖基化位點(diǎn)。同樣的，術(shù)語(yǔ)“天然產(chǎn)生的體內(nèi)O-糖基化位點(diǎn)”包括S52和S60位置的糖基化位點(diǎn)，而術(shù)語(yǔ)“天然產(chǎn)生的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)”包括N145和N322位置的糖基化位點(diǎn)。
通常，F(xiàn)VII或FVIIa多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1中所示的序列區(qū)別在于，引入至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)(如至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn))，如1-15個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)(如1-15個(gè)非天然產(chǎn)生的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn))，特別是1-10，1-6，或2-4個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)(如1-10，1-6或2-4個(gè)非天然產(chǎn)生的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn))，優(yōu)選通過(guò)取代引入。
應(yīng)理解為了制備偶聯(lián)物(其中所述偶聯(lián)物多肽包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn))，所述多肽必須在能使糖(寡糖)組分連接至糖基化位點(diǎn)的宿主細(xì)胞中表達(dá)，或者在體外進(jìn)行糖基化。可糖基化的宿主細(xì)胞在以下“與糖組分的偶聯(lián)”一節(jié)中進(jìn)一步有實(shí)例。
這方面的實(shí)施方案中，體內(nèi)糖基化位點(diǎn)被引入親代FVII或FVIIa分子中由暴露于該分子表面的氨基酸殘基占據(jù)的位置，優(yōu)選是超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露于溶劑中的那些氨基酸殘基，特別是超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于溶劑中的那些(這些位置在文中方法章節(jié)內(nèi)確定)。然后引入N-糖基化位點(diǎn)，所用方式使得所述位點(diǎn)的N-殘基位于所述位置中。類似的，引入O-糖基化位點(diǎn)以便組成該位點(diǎn)的S或T殘基位于所述位置。所述位置包括K32S/T，I42S/T，Y44S/T，K143S/T，R290S/T，R315S/T，K341S/T，R392S/T，R396S/T，R402S/T或其組合。
N-糖基化時(shí)，可將體內(nèi)糖基化位點(diǎn)引入僅需要一個(gè)突變就可創(chuàng)造出所述位點(diǎn)的位置處(即，創(chuàng)建功能性糖基化位點(diǎn)所需的任何其它氨基酸殘基已存在于該分子內(nèi))。
換句話說(shuō)，本發(fā)明的偶聯(lián)物優(yōu)選是這樣一個(gè)偶聯(lián)物，其中多肽氨基酸序列與SEQ ID NO1的區(qū)別在于，至少一個(gè)天然產(chǎn)生的N-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，X是除絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)外的任何氨基酸。
類似的，本發(fā)明的偶聯(lián)物優(yōu)選是這樣一個(gè)偶聯(lián)物，其中多肽氨基酸序列與SEQ ID NO1的區(qū)別在于，至少一個(gè)SEQ ID NO1中天然產(chǎn)生的X-X′-S或X-X′-T序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，X是除N外的任何氨基酸。
創(chuàng)建體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的這類取代的特定實(shí)例包括選自以下組或其組合的取代F4S/T，P10N，Q21N，W41N，S43N，A51N，G58N，L65N，G59S/T，E82S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，G179N，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，i230N，P231N，P236N，G237N，V253N，E265N，T267N，E270N，R277N，L280N，G291N，P303S/T，L305N，Q312N，G318N，G331N，D334N，K337N，G342N，H348N，R353N，Y357N，I361N，V376N，R379N，M391N。優(yōu)選所述取代選自以下組F4S/T，P10N，Q21N，W41N，A51N，G58N，G59S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，V253N，E265N，T267N，E270N，L280N，G291N，P303S/T，G318N，G331N，D334N，K337N，R353N，Y357N，M391N或其組合。
替代的，體內(nèi)糖基化位點(diǎn)引入由賴氨酸殘基或精氨酸殘基所占據(jù)的位置，優(yōu)選由賴氨酸占據(jù)，特別是N-糖基化位點(diǎn)的N-殘基或O-糖基化位點(diǎn)的S或T殘基取代所述賴氨酸殘基。
換句話說(shuō)，本發(fā)明的偶聯(lián)物優(yōu)選是這樣一個(gè)偶聯(lián)物，其中多肽的氨基酸序列與SEQ ID NO1的區(qū)別在于，至少一個(gè)SEQ ID NO1中天然產(chǎn)生的K-X′-X序列或R-X′-X序列，優(yōu)選K-X′-X序列，被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸(P)之外的任何氨基酸，X是除絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)外的任何氨基酸。
創(chuàng)造體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的取代的實(shí)例包括選自以下組的取代K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，K62N+Q64S/T，K85N+D87S/T，K137N+P139S/T，K143N+N145S/T，K148N+Q149S/T，K161N+E163S/T，K197N+K199S/T，K199N+W201S/T，K316N+G318S/T，K337N，K341N+D343S/T，K389N+M391S/T或其組合。
上述糖基化方面的一個(gè)實(shí)施方案中，糖基化位點(diǎn)，尤其是N-糖基化位點(diǎn)，可被引入上述蛋白酶解位點(diǎn)處，或其附近(參見(jiàn)“本發(fā)明的偶聯(lián)物”章節(jié))。
因此，創(chuàng)造體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的取代的特定實(shí)例包括選自以下組的取代 K32N+A34S/T，F(xiàn)31N+D33S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，R36N+K38S/T，L39N+W41S/T，F(xiàn)40N+I42S/T，W41N，I42N+Y44S/T，S43N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，R290N+A292S/T，D289N+G291S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，Q313N+R315S/T，Q312N，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，K341N+D343S/T，S339N+K341S/T，G342N，D343N+G345S/T，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L400N+R402S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T或其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。優(yōu)選，所述取代選自以下組K32N+A34S/T，K8N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R290N+A292S/T，R315N+V317S/T，K341N+D343S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T或其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。更優(yōu)選，所述取代選自K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R290N+A292T，R315N+V317T，341N+D343T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T或其組合，特別是K143N+N145T+R315N+V317T。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選體內(nèi)糖基化位點(diǎn)被引入這樣一個(gè)位置，其既不形成組織因子結(jié)合部分，也不形成活性位點(diǎn)區(qū)部分和此處定義的活性位點(diǎn)結(jié)合槽的脊?？上胂筮@種糖基化變體主要屬于之前本文定義的活性偶聯(lián)物。
因此，創(chuàng)造體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的取代的特定實(shí)例包括選自以下組的取代K32N+A34S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，W41N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T或其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。優(yōu)選，所述取代選自以下組K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R315N+V317S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T及其組合，如K143N+N145S/T+R315N+V317S/T。更優(yōu)選，所述取代選自K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R315N+V317T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T或其組合，特別是K143N+N145T+R315N+V317T。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選體內(nèi)糖基化位點(diǎn)被引入這樣一個(gè)位置，其不形成組織因子結(jié)合部分，但其形成活性位點(diǎn)區(qū)的一部分和此處定義的活性位點(diǎn)結(jié)合槽的脊?？上胂筮@種糖基化變體主要屬于之前本文定義的無(wú)活性偶聯(lián)物。
所以，創(chuàng)建這種體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)的取代的特定實(shí)例包括選自以下的取代I153N+G155S/T，Q167N+L169S/T，V168N+L170S/T，L169N+L171S/T，L170N+V172S/T，L171N+N173S/T，A175S/T，A175N+L177S/T，L177N+G179S/T，G179N，G180N+L182S/T，T181N+I183S/T，V188N，V189N+A191S/T，S190N+A192S/T，A191N+H193S/T，H193N+F195S/T，F(xiàn)195N+K197S/T，D196N+I198S/T，K197N+K199S/T，I198N+N200S/T，K199N+W201S/T，W201N+N203S/T，R202S/T，I205S/T，V228N+I230S/T，I229N+P231S/T，I230N，P231N，S232N+Y234S/T，T233N+V235S/T，Y234N+P236S/T，V235N+G237S/T，P236N，G237N，T238N+N240S/T，T239N+H241S/T，H241N+I43S/T，D242S/T，I243N+L245S/T，A244N+L246S/T，L245N+R247S/T，L246N+L246S/T，V281N+G283S/T，S282N+W284S/T，G283N+G285S/T，W284N+Q286S/T，G285N+L287S/T，Q286N+L288S/T，D289N+G291S/T，R290N+A292S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，P321N+I323S/T，T324N+Y326S/T，E325N+M327S/T，Y326N+F327S/T，F(xiàn)328N+A330S/T，S339N+K341S/T，K341N+D343S/T，G342N+S344S/T，D343N+G345S/T，S344N+G346S/T，G345N+P347S/T，P347N+A349S/T，H348N，L358N+G360S/T，T359N+I361S/T，G360N+V362S/T，I361N，V362N+W364S/T，S363N+G365S/T，W364N+Q366S/T，G365N+G367S/T，T370N+G372S/T，V376N，Y377N+R379S/T，T378N+V380S/T，R379N，V380N+Q382S/T，Q382N+I384S/T，Y383N+E385S/T，W386N+Q388S/T，L387N+K389S/T，L400N+R402S/T及其組合。優(yōu)選選自以下的取代 D289N+G291S/T，R290N+A292S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，S339N+K341S/T，K341N+D343S/T，G342N+S344S/T，D343N+G345S/T，及其組合，更優(yōu)選選自以下的取代 D289N+G291T，R290N+A292T，G291N，A292N+A294T，T293N+L295T，S339N+K341T，K341N+D343T，G342N+S344T，D343N+G345T，及其組合。
除了糖組分外，根據(jù)本發(fā)明這方面在本章節(jié)中說(shuō)明的偶聯(lián)物可含有另外的非多肽組分，特別是聚合物分子，如本發(fā)明所述，其偶聯(lián)到偶聯(lián)物多肽部分的一個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)上。
應(yīng)理解本章節(jié)中特定的任何氨基酸改變，尤其是取代，可與本文其他部分中說(shuō)明的特定氨基酸改變(尤其是取代)組合。
例如，本章節(jié)中公開(kāi)的任何糖基化變體(所述變體具有至少一個(gè)被引入和/或去除的糖基化位點(diǎn)，如包含R315N+V317T和/或K143N+N145T的取代)，可進(jìn)一步與一個(gè)聚合物分子，如PEG，或任何其他的非多肽組分偶聯(lián)。為此，可通過(guò)使用FVII或FVIIa中現(xiàn)有的連接基團(tuán)，或被引入和/或去除連接基團(tuán)，尤其使得可用于偶聯(lián)的連接基團(tuán)總數(shù)為1-6，特別是3-4或1，2，3，4，5，或6個(gè)而獲得偶聯(lián)物。
優(yōu)選，在本發(fā)明偶聯(lián)物中(其中FVII或FVIIa多肽包含兩個(gè)糖基化位點(diǎn))，非多肽組分的數(shù)量和分子量是經(jīng)過(guò)選擇的以使添加非多肽組分后的總分子量在5-25kDa的范圍內(nèi)，如在10-25kDa范圍內(nèi)，特別是約5kDa，12kDa，15kDa或20kDa。
無(wú)活性偶聯(lián)物本發(fā)明偶聯(lián)物可通過(guò)去除至少一個(gè)氨基酸殘基造成失活，所述氨基酸占據(jù)的位置選自SEQ ID NO1的R152，I153，S344，D242和H193。這種去除可通過(guò)取代或缺失一個(gè)或多個(gè)上述氨基酸殘基實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選，這種去除是通過(guò)取代實(shí)現(xiàn)，尤其通過(guò)保守取代實(shí)現(xiàn)。相應(yīng)的，本文中所用無(wú)活性FVII或FVIIa多肽可包含一個(gè)或多個(gè)下述取代R152X，I153X，S344X，D242X或H193X，其中X是任何氨基酸殘基，優(yōu)選是導(dǎo)致保守性取代的氨基酸殘基。例如，無(wú)活性的FVII或FVIIa多肽包含R152X突變，其中X是除了賴氨酸以外的任何氨基酸殘基(由于賴氨酸形成部分蛋白酶解位點(diǎn)的一部分)。特異性取代的其他實(shí)例包括I153A/V/L；S344T/A/G/Y；D242E/A和/或H193R/A。
替代的，活性FVII或FVIIa可能因I153α氨基酸基團(tuán)的氨甲?；?，或通過(guò)將所述多肽與絲氨酸蛋白酶抑制劑復(fù)合而使其失活。合適的絲氨酸抑制蛋白，例如選自有機(jī)磷化合物，sulfanylfluoride，鹵甲基酮肽，優(yōu)選丹磺酸-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酸-谷氨酸-谷氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮，或苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮，或azapeptide。
偶聯(lián)物也可通過(guò)在選定的位置引入至少一個(gè)糖基化位點(diǎn)導(dǎo)致失活，以使后續(xù)的糖基化使偶聯(lián)物失活。
如上“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是糖組分”章節(jié)的最后部分中所述，優(yōu)選糖基化位點(diǎn)被引入這樣一個(gè)位點(diǎn)，其不形成組織因子的一部分但形成活性位點(diǎn)區(qū)的一部分和本文定義的活性位點(diǎn)結(jié)合槽的脊。優(yōu)選取代的特定例子在“本發(fā)明的偶聯(lián)物，其中非多肽組分是糖組分”章節(jié)中給出。
本發(fā)明偶聯(lián)物的非多肽組分如上所述，本發(fā)明偶聯(lián)物的非多肽組分優(yōu)選選自聚合物分子、親脂性化合物、糖組分(通過(guò)體內(nèi)糖基化的方式)和有機(jī)衍化劑。所有這些物質(zhì)都可為偶聯(lián)物的多肽部分提供所需性質(zhì)，特別是增加功能性體內(nèi)半壽期和/或增加血漿半壽期。偶聯(lián)物的多肽部分可以僅與一種類型的非多肽組分偶聯(lián)，但也可以與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯(lián)，例如，與聚合物分子和糖組分偶聯(lián)，與親脂性基團(tuán)和糖組分偶聯(lián)，與有機(jī)衍化劑和糖組分偶聯(lián)，與親脂性基團(tuán)和聚合物分子偶聯(lián)等。與兩種或多種不同類型的非多肽組分偶聯(lián)可同時(shí)或按順序進(jìn)行。
制備本發(fā)明偶聯(lián)物的方法在下列章節(jié)“與親脂性化合物的偶聯(lián)”，“與聚合物分子的偶聯(lián)”，“與糖組分的偶聯(lián)”和“與有機(jī)衍化劑的偶聯(lián)”中描述與各指定類型非多肽的偶聯(lián)。一般，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物通過(guò)在有利于所述多肽表達(dá)條件下培養(yǎng)合適的宿主細(xì)胞，獲取所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一個(gè)N-或O-糖基化位點(diǎn)，所述宿主細(xì)胞是可進(jìn)行體內(nèi)糖基化的真核細(xì)胞，和/或b)所述多肽可體外偶聯(lián)非多肽組分。
應(yīng)理解，對(duì)偶聯(lián)的設(shè)計(jì)應(yīng)使所得分子在所連接的非多肽組分的數(shù)量，這類分子的大小和形式(如線性或分支)，以及在所述多肽上的連接位點(diǎn)各方面最佳。使用的非多肽組分的分子量可，如基于希望達(dá)到的效果進(jìn)行選擇。例如，如果偶聯(lián)的主要目的是獲得具有高分子量的偶聯(lián)物(如降低腎清除率)，通常要偶聯(lián)盡量少的高分子量非多肽組分，以獲得期望的分子量。如果希望獲得高度的掩蓋，可使用足量的低分子量非多肽組分(如分子量從約300Da到約5kDa，如分子量從300Da到2kDa)，以有效掩蓋所有或大多數(shù)的蛋白酶解位點(diǎn)，或所述多肽中其他易被破壞的位點(diǎn)。
與親脂性化合物的偶聯(lián)多肽和親脂性化合物可以直接或通過(guò)使用接頭彼此偶聯(lián)。親脂性化合物可以是天然的化合物如飽和或不飽和脂肪酸、脂肪酸二酮、萜烯、前列腺素、維生素、類胡蘿卜素或甾體激素，或者合成的化合物如碳酸、醇、胺和具有一個(gè)或多個(gè)烷基-、芳基-、鏈烯基-的磺酸或其它多元不飽和化合物。可按本領(lǐng)域已知的方法，如按Bodanszky在Peptide Synthesis，John Wiley，New York，1976和WO96/12505所述的方法來(lái)進(jìn)行多肽和親脂性化合物之間的偶聯(lián)(任選通過(guò)接頭來(lái)連接)。
與聚合物分子偶聯(lián)，包括聚合物分子與多肽N末端的偶聯(lián)與多肽偶聯(lián)的聚合物分子可以是任何合適的聚合物分子，如天然或合成的均聚物或雜聚物，通常所述分子的分子量范圍約為300-100000Da，如約500-20000Da，更優(yōu)選約為500-15000Da，甚至更優(yōu)選的范圍約為2-15kDa，如范圍約為3-10kDa。當(dāng)此處所用術(shù)語(yǔ)“約”涉及某一分子量時(shí)，“約”就表示大約的平均分子量，且反映這樣一個(gè)事實(shí)，即在一定的聚合物制品中通常有一定的分子量分布。
均聚物的實(shí)例包括聚醇(即，聚-OH)、聚胺(即，聚-NH2)和聚羧酸(即，聚-COOH)。雜聚物是包含不同的偶聯(lián)基團(tuán)，如羥基基團(tuán)和氨基基團(tuán)的聚合物。
合適的聚合物分子的實(shí)例包括選自以下的聚合物分子聚環(huán)氧烷(PAO)，包括聚亞烷基二醇(PAG)，如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)，分支的PEG，聚乙烯醇(PVA)，聚碳酸酯，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙烯共馬來(lái)酸酐，聚苯乙烯共馬來(lái)酸酐，葡聚糖包括羧甲基葡聚糖或任何其它適于減小免疫原性和/或增加功能性體內(nèi)半壽期和/或血清半壽期的生物聚合物。聚合物分子的另一實(shí)例是人白蛋白或另一豐富的血漿蛋白。一般來(lái)說(shuō)，聚亞烷基二醇衍生的聚合物是生物相容的、無(wú)毒的、無(wú)抗原性的、無(wú)免疫原性的，具有各種水溶性特性并易于從活的生物中分泌。
PEG是優(yōu)選的聚合物分子，因?yàn)槠渑c，例如多糖如葡聚糖相比僅僅具有極少量的能夠交聯(lián)的反應(yīng)基團(tuán)。特別感興趣的是單功能PEG，如單甲氧基聚乙二醇(mPEG)，因?yàn)槠渑悸?lián)的化學(xué)相對(duì)簡(jiǎn)單(僅僅一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)可用于與多糖上的連接基團(tuán)偶聯(lián))。因此，交聯(lián)的危險(xiǎn)被消除，所得多肽偶聯(lián)物更均一并且聚合物分子與多肽的反應(yīng)更易于控制。
為了使聚合物分子與多肽共價(jià)結(jié)合，聚合物分子的羥基末端基團(tuán)必須為活化形式，即具有反應(yīng)性功能基團(tuán)(其實(shí)例包括伯胺基團(tuán)、酰肼(HZ)、巰基、琥珀酸酯(SUC)、琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基羧甲基化物(SCM)、苯并三唑碳酸酯(BTC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、醛、硝基苯基碳酸酯(NPC)和tresylate(TRES))。適當(dāng)激活的聚合物分子有商品例如可得自ShearwaterPolymer，Inc.，Huntsville，AL，USA或得自PolyMASC Pharmaceuticals plc，UK。
或者，聚合物分子可通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法，例如，如WO90/13540中所述激活。本發(fā)明中所使用的激活的線性或分支的聚合物分子的特定實(shí)例描述于Shearwater Po1ymers，Inc.1997和2000 Catalogs(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycoland Derivatives，引入本文供參考)。
激活的PEG聚合物的特定實(shí)例包括下列線性PEGsNHS-PEG(例如SPA-PEG，SSPA-PEG，SBA-PEG，SS-PEG，SSA-PEG，SC-PEG，SG-PEG和SCM-PEG)，和NOR-PEG，BTC-PEG，EPOX-PEG，NCO-PEG，NPC-PEG，CDI-PEG，ALD-PEG，TRES-PEG，VS-PEG，IODO-PEG和MAL-PEG和支鏈PEG如PEG2-NHS和US5,932,462和US5,643,575中所公開(kāi)的那些，將兩參考引入本文供參考。此外，引入本文供參考的下列出版物中公開(kāi)了有用的聚合物分子和/或PEG化化學(xué)過(guò)程 US5,824,778，US5,476,653，WO97/32607，EP229,108，EP402,378，US4,902,502，US5,281,698，US5,122,614，US5,219,564，WO92/16555，WO94/04193，WO94/14758，WO94/17039，WO94/18247，WO94/28024，WO95/00162，WO95/11924，WO95/13090，WO95/33490，WO96/00080，WO97/18832，WO98/41562，WO98/48837，WO99/32134，WO99/32139，WO99/32140，WO96/40791，WO98/32466，WO95/06058，EP439 508，WO97/03106，WO96/21469，WO95/13312，EP921 131，US5,736,625，WO98/05363，EP809 996，US5,629,384，WO96/41813，WO96/07670，US5,473,034，US5,516,673，EP605 963，US5,382,657，EP510 356，EP400 472，EP183 503和EP154 316。
多肽和激活的聚合物分子的偶聯(lián)可通過(guò)使用任何常規(guī)方法，例如，按下列參考文獻(xiàn)所述(所述參考文獻(xiàn)中也描述了激活聚合物分子的適宜方法)進(jìn)行R.F.Taylor，(1991)，″Protein immobilisation.Fundamental and applications″，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，″Chemistry of Protein Conjugationand Crosslinking″，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson et al.，(1993)，″Immobilized Affinity Ligand Techniques″，Academic Press，N.Y.)。技術(shù)人員會(huì)知道根據(jù)所述多肽的連接基團(tuán)(以上已給出實(shí)例)以及聚合物的功能基(例如，是氨基、羥基、羧基、醛，sulfydryl，琥珀酰亞胺，馬來(lái)酰亞胺，vinysulfone或鹵代醋酸鹽)來(lái)使用激活方法和/或偶聯(lián)化學(xué)。PEG化可以與多肽上的所有可利用的基團(tuán)(即，暴露于多肽表面的連接基團(tuán))直接進(jìn)行偶聯(lián)或可以與一個(gè)或多個(gè)特定的連接基團(tuán)如，N-末端氨基直接偶聯(lián)(如US5985265描述的)。而且，偶聯(lián)可以在一步中完成或以多步方式(如，WO99/55377中所述的)來(lái)完成。
應(yīng)理解PEG化作用需設(shè)計(jì)為使所得分子在結(jié)合的PEG分子數(shù)目、這些分子的大小和形式(如，是線性的還是分支的)，以及在多肽分子中結(jié)合這些分子的位置各方面最佳。例如，可以根據(jù)需要達(dá)到的效果來(lái)選擇所使用的聚合物的分子量。例如，如果偶聯(lián)的主要目的是產(chǎn)生具有高分子量的偶聯(lián)物(如，減小腎的清除)，通常理想的是偶聯(lián)盡可能少的高分子量聚合物分子以獲得所需分子量。當(dāng)需要高度掩蓋時(shí)，可通過(guò)使用足夠數(shù)量的低分子量聚合物(如，分子量約為300Da-5kDa)來(lái)獲得，這樣可有效地掩蓋多肽中所有的或大部分的蛋白酶解位點(diǎn)或所述多肽的易受破壞的位點(diǎn)。例如，可使用2-8，如3-6個(gè)這樣的聚合物。
僅與蛋白質(zhì)上一個(gè)連接基團(tuán)偶聯(lián)(如N-末端氨基基團(tuán))時(shí)，有利的是線性或分支的聚合物具有高分子量，優(yōu)選約10-25kDa，如約15-25kDa，例如約20kDa。
一般來(lái)說(shuō)，聚合物的偶聯(lián)條件是使所有可利用的聚合物連接基團(tuán)與聚合物分子反應(yīng)。這可以通過(guò)使所述聚合物相對(duì)于所述多肽適當(dāng)摩爾過(guò)量來(lái)實(shí)現(xiàn)。通常，激活的聚合物分子與多肽的摩爾比為1000-1，如約200-1，或約100-1。為獲得最佳反應(yīng)有些情況下所述摩爾比也可能略低，如約50-1，10-1或5-1。
本發(fā)明也打算通過(guò)接頭來(lái)將聚合物分子與多肽偶聯(lián)。合適的接頭是技術(shù)人員公知的。優(yōu)選的實(shí)例是氰尿酰氯(Abuchowski等，(1977)，J.Biol.Chem.，252，3578-3581；US4179337；Shafer等人(1986)，J.Polym.Sci.Polym.Chem.Ed.，24，375-378)。
偶聯(lián)后，按本領(lǐng)域已知的方法如通過(guò)將伯胺加入到反應(yīng)混合物中來(lái)封閉殘留的活化聚合物分子，并通過(guò)合適的方法除去所產(chǎn)生的失活的聚合物分子。
應(yīng)理解基于各種條件(如多肽的氨基酸序列，使用的活性PEG化合物的性質(zhì)以及特定的PEG化條件，包括PEG與多肽的摩爾比)，可能獲得不同程度的PEG化，較高程度的PEG化通常來(lái)自PEG與多肽的較高摩爾比。然而，來(lái)源于任何給定PEG化過(guò)程的PEG化多肽，通常包含PEG化程度略有不同的多肽偶聯(lián)物的隨機(jī)分布。
本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明多肽偶聯(lián)物包含一個(gè)與SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIaN末端A1共價(jià)連接的聚合物分子，其中所述聚合物分子是與所述多肽連接的唯一聚合物分子。優(yōu)選這種多肽偶聯(lián)物包含與該多肽N末端連接的單一PEG分子，并且沒(méi)有其他PEG分子。特別優(yōu)選分子量至少約5kDa，尤其約10-25kDa，如約15-25kDa，例如約20kDa的線性或分支的PEG分子。根據(jù)這一實(shí)施方案的多肽偶聯(lián)物可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)糖組分，所述糖組分連接于所述多肽N-連接的或O-連接的糖基化位點(diǎn)，或通過(guò)體外糖基化連接。
本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明多肽偶聯(lián)物包含聚合物分子，所述聚合物分子與SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa N末端A1和N末端I153共價(jià)連接，所述聚合物分子是與所述多肽連接的唯一聚合物分子。優(yōu)選這種多肽偶聯(lián)物包含與該多肽N末端連接的單一PEG分子，并且沒(méi)有其他PEG分子。特別優(yōu)選分子量至少約5kDa，尤其約10-25kDa，如15-25kDa，例如約20kDa是優(yōu)選的。根據(jù)這一實(shí)施方案的多肽偶聯(lián)物可進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)糖組分，所述糖組分連接于所述多肽N-連接的或O-連接的糖基化位點(diǎn)，或通過(guò)體外糖基化連接。
將聚合物(如PEG分子)選擇性地偶聯(lián)到多肽N-末端的方法中，US5985265中公開(kāi)的方法是優(yōu)選的。所述方法包括還原性烷基化(多肽N-末端氨基基團(tuán)與含醛基的多肽，如醛基化-PEG，在存在還原劑，如NaCNBH3，的條件下反應(yīng)，)。所述方法利用多肽中可用于衍生的不同伯氨基團(tuán)(賴氨酸和N-末端相對(duì)比)的不同反應(yīng)性，獲得所述多肽的多種可選的衍生物，其N-末端羧基基團(tuán)包含聚合物分子，如醛化PEG。所述反應(yīng)在一個(gè)pH值下進(jìn)行，所述pH值準(zhǔn)許利用賴氨酸殘基的ε-氨基基團(tuán)與多肽N-末端殘基α氨基基團(tuán)的pKa差異。為了獲得這種不同反應(yīng)性，所述反應(yīng)通常在弱酸條件下進(jìn)行。合適的pH值范圍包括pH4.5-7，如pH4.5-6，如pH5-6，特別是約pH5。
其他特定實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物包含一個(gè)PEG分子，所述PEG分子連接在多肽中可進(jìn)行PEG化的每個(gè)賴氨酸殘基上，尤其是線性的或分支的PEG分子，如分子量約1-15kDa，典型的約2-12kDa，如約3-10kDa，如約5kDa或6kDa。
其他實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽偶聯(lián)物包含PEG分子，所述PEG分子連接在多肽中可進(jìn)行PEG化的每個(gè)賴氨酸殘基上，同時(shí)還連接在多肽N-末端的氨基酸殘基上。
碳水化合物組分(如葡聚糖)與所述多肽氨基酸殘基在體外的共價(jià)偶聯(lián)也可使用WO87/05330和Aplin等人的CRC Crit Rev.Biochem.，pp.259-306，1981中描述的方法。碳水化合物組分或PEG與蛋白質(zhì)結(jié)合型和肽結(jié)合型Gln-殘基的體外偶聯(lián)也可以通過(guò)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶(TGases)來(lái)進(jìn)行。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶以一種所謂的交聯(lián)反應(yīng)的方式催化供體氨基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到蛋白-和肽-結(jié)合的Gln殘基上。供體氨基基團(tuán)可以是蛋白-或肽-結(jié)合的，如賴氨酸殘基中的ε氨基基團(tuán)，或也可以是小或大的有機(jī)分子的一部分。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的交聯(lián)中作為氨基供體的小的有機(jī)分子如腐胺(1，4二氨基丁烷)。在谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的交聯(lián)中作為氨基供體的大的有機(jī)分子如含氨基-PEG(Sato等，1996，Biochemistry 35，13072-13080)。
通常谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶是高度特異的酶，并非所有暴露于蛋白表面的Gln殘基都可用于谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的含氨基物質(zhì)的交聯(lián)。相反只有少數(shù)Gln殘基是谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的天然底物，但對(duì)于控制Gln殘基作為適合的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶底物的確切參數(shù)仍不可知。因此，為了使蛋白對(duì)谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶催化的交聯(lián)反應(yīng)敏感，經(jīng)常的前提是在方便的位置增加一段氨基酸序列，所述氨基酸序列已知可很好地用做谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的底物。已知幾種氨基酸序列可為谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的底物，或包含谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶的底物，如P物質(zhì)，elafin，纖維蛋白原，纖連蛋白，α2-纖溶酶抑制劑，α-酪蛋白，和β-酪蛋白。
與糖組分的偶聯(lián)為了完成FVII分子(包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn))的體內(nèi)糖基化，編碼多肽的核苷酸序列必須被插入到糖基化的真核表達(dá)宿主中。表達(dá)宿主細(xì)胞可選自真菌(絲狀真菌或酵母)、昆蟲(chóng)、或動(dòng)物細(xì)胞，或選自轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞或HEK細(xì)胞，如HEK293細(xì)胞，或昆蟲(chóng)細(xì)胞，如SF9細(xì)胞，或者酵母細(xì)胞如釀酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)或畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)或任何下文進(jìn)一步描述的宿主細(xì)胞。
與有機(jī)衍生劑的偶聯(lián)所述多肽的共價(jià)修飾可通過(guò)多肽的一個(gè)或多個(gè)連接基團(tuán)與有機(jī)衍生劑反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。合適的衍生劑和方法在本領(lǐng)域中是公知的。例如，半胱氨?；鶜埢３Ｅc(-鹵代乙酸酯(和相應(yīng)的胺)，如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)產(chǎn)生羧甲基或羧基酰胺基甲基衍生物。半胱氨?；鶜埢部膳c溴三氟丙酮、(-溴-(-(4-咪唑基)丙酸、氯乙?；姿狨?、N-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、對(duì)氯汞基苯甲酸鹽、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2- -1，3-二唑反應(yīng)進(jìn)行衍生。組氨酰基殘基通過(guò)與二乙基焦碳酸酯在pH5.5-7.0下反應(yīng)進(jìn)行衍生，因?yàn)樵撛噭┹^特異于組氨?；鶄?cè)鏈。對(duì)溴苯甲酰甲基溴化物可用于衍生；該反應(yīng)優(yōu)選在0.1M卡可酸鈉中于pH6.0下進(jìn)行反應(yīng)。賴氨?；桶被┒藲埢膳c琥珀酸酐或其它羧酸酐反應(yīng)。用這些試劑衍生具有使賴氨?；鶜埢碾姾赡孓D(zhuǎn)的作用。衍生含(-氨基的殘基的其它合適的試劑包括亞氨基酯如methyl picolinimidate、磷酸吡多醛、吡多醛、氯代氫硼化物、三硝基苯磺酸、鄰甲基異脲、2，4-戊二酮和轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸鹽的反應(yīng)。精氨?；鶜埢ㄟ^(guò)與一種或多種常規(guī)試劑的反應(yīng)來(lái)修飾，所述試劑包括苯基乙二醛、2，3-丁二酮、1，2-環(huán)己二酮和茚三酮。精氨酸殘基的衍生要求反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，因?yàn)殡夜δ芑哂懈叩膒Ka。
此外，這些試劑可與賴氨酸以及精氨酸胍基反應(yīng)。羧基側(cè)基(天冬氨酰基或谷氨?；?通過(guò)與碳二亞胺(R-N＝C＝N-R′)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行選擇性地修飾，其中R和R′是不同的烷基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳二亞胺或1-乙基-3-(4-氮翁-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。而且，天冬氨酰基和谷氨?；ㄟ^(guò)與銨離子反應(yīng)轉(zhuǎn)化為天冬酰酰胺基和谷氨酰酰胺基。
功能性位點(diǎn)的封閉已經(jīng)報(bào)道聚合物的過(guò)度偶聯(lián)可導(dǎo)致與聚合物偶聯(lián)的多肽活性喪失。該問(wèn)題可通過(guò)如去除位于功能性位點(diǎn)的連接基團(tuán)，或在偶聯(lián)前可逆性封閉功能性位點(diǎn)使功能位點(diǎn)在偶聯(lián)時(shí)被覆蓋而消除。后一種策略構(gòu)成本發(fā)明進(jìn)一步的技術(shù)方案(前一種策略在上文中進(jìn)行了舉例說(shuō)明，如通過(guò)去除鄰近功能性位點(diǎn)的賴氨酸殘基)。更具體來(lái)說(shuō)，按照第二種策略，多肽和非多肽組分之間的偶聯(lián)是在多肽功能性位點(diǎn)用能夠結(jié)合多肽功能性位點(diǎn)的輔助分子(如可結(jié)合所述多肽功能位點(diǎn)的組織因子或絲氨酸蛋白酶抑制劑)封閉的條件下進(jìn)行的。
優(yōu)選地，輔助分子能特異性識(shí)別多肽功能性位點(diǎn)，如受體，特別是組織因子，或者是全長(zhǎng)的，或者是適當(dāng)截短形式的組織因子，或是兩個(gè)分子，其中一個(gè)是組織因子，另一個(gè)是一種肽或肽的抑制劑，其可結(jié)合到催化三聯(lián)體上(優(yōu)選定義為催化三聯(lián)體附近10區(qū)域的氨基酸殘基)，從而保護(hù)該區(qū)域。
另外，輔助分子可以是抗體，特別是識(shí)別FVII多肽的單克隆抗體。特別是，輔助分子可以是中和性單克隆抗體。
可使多肽在偶聯(lián)之前與輔助分子相互作用。這確保多肽的功能性位點(diǎn)被掩蓋或保護(hù)并因此而不能被非多肽組分如聚合物衍生。從輔助分子洗脫后，非多肽組分和多肽之間的偶聯(lián)物可用至少部分保留的功能性位點(diǎn)來(lái)恢復(fù)。
具有被封閉的功能性位點(diǎn)的多肽與聚合物、親脂性化合物、糖組分、有機(jī)衍生劑或任何其它化合物的隨后偶聯(lián)以常規(guī)方式進(jìn)行，如按上文“與……偶聯(lián)”的章節(jié)中所述的方法進(jìn)行。
不考慮用于掩蓋偶聯(lián)物中多肽功能性位點(diǎn)的輔助分子的性質(zhì)，理想的是輔助分子不含或僅僅含有少量的與分子中指定非多肽組分結(jié)合的基團(tuán)，其中與這些基團(tuán)的偶聯(lián)將阻止偶聯(lián)的多肽從輔助分子上解吸。因此，可與多肽非掩蓋部分中存在的連接基團(tuán)選擇性偶聯(lián)并且輔助分子可反復(fù)用于重復(fù)偶聯(lián)。例如，如果非多肽組分是聚合物分子如PEG這種具有賴氨酸(氨基或N-末端氨基酸殘基作為連接基團(tuán)的分子時(shí)，理想的是輔助分子基本上不含可偶聯(lián)的(氨基，優(yōu)選不含任何(氨基。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，輔助分子是能夠與多肽功能性位點(diǎn)結(jié)合的蛋白質(zhì)或肽，該蛋白質(zhì)或肽不含任何與指定非多肽組分可偶聯(lián)的連接基團(tuán)。
在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，輔助分子首先與固相如柱填充材料，如Sephadex或瓊脂糖珠，或表面，如反應(yīng)容器共價(jià)連接。然后，將多肽裝于載有輔助分子的柱材料上并按本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行偶聯(lián)，如按上文“與……偶聯(lián)”的章節(jié)中所述的方法進(jìn)行。該方法允許多肽偶聯(lián)物通過(guò)洗脫從輔助分子上分離。多肽偶聯(lián)物在不導(dǎo)致多肽偶聯(lián)物實(shí)質(zhì)性降解的理化條件下通過(guò)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行洗脫。含有多肽偶聯(lián)物的流動(dòng)相從固相上分離而輔助分子仍然共價(jià)連接。分離可以其它方式來(lái)完成例如，輔助分子可用第二種可通過(guò)特異性結(jié)合劑(如，鏈霉抗生物素)來(lái)識(shí)別的分子(如生物素)來(lái)衍生。特異性結(jié)合劑可以與固相連接并因此允許通過(guò)流經(jīng)第二輔助分子-固相柱，并隨后洗脫輔助分子-第二分子復(fù)合體，而非多肽偶聯(lián)物，可使多肽偶聯(lián)物與輔助分子-第二分子復(fù)合體分離。多肽偶聯(lián)物以任何合適的方式從輔助分子上釋放。可通過(guò)提供的條件完成脫保護(hù)，其中輔助分子從其結(jié)合的FVII的功能性位點(diǎn)上分離。例如，與聚合物偶聯(lián)的抗體和抗獨(dú)特型抗體之間的復(fù)合物可通過(guò)將pH調(diào)節(jié)到酸性或堿性pH來(lái)分離。更優(yōu)選使用識(shí)別FVII的Ca2+特異構(gòu)象的構(gòu)象特異性抗體，最后在溫和條件下用EDTA洗脫。
絲氨酸蛋白酶抑制劑的連接絲氨酸蛋白酶抑制劑的連接可根據(jù)WO96/12800中所述方法進(jìn)行。
標(biāo)記多肽的偶聯(lián)在另外的實(shí)施方案中，多肽作為融合蛋白(與標(biāo)記物的，即通常由1-30，如1-20個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的氨基酸序列或肽段)來(lái)表達(dá)。除了允許快速和容易地進(jìn)行純化，標(biāo)記物是完成標(biāo)記多肽和非多肽組分之間偶聯(lián)的便利工具。特別是，標(biāo)記物可用于在微滴定板或其它載體如順磁珠上完成偶聯(lián)，這樣標(biāo)記的多肽可通過(guò)標(biāo)記物來(lái)固定。在微滴定板上與標(biāo)記的多肽偶聯(lián)的優(yōu)點(diǎn)是，標(biāo)記的多肽可從培養(yǎng)肉湯直接固定到微滴定板上(原則上不經(jīng)任何純化)并進(jìn)行偶聯(lián)。因此，可減少操作步驟的總數(shù)(從表達(dá)到偶聯(lián))。而且，標(biāo)記物可起間隔臂分子的作用以確保使固定的多肽更易于偶聯(lián)。使用標(biāo)記多肽進(jìn)行的偶聯(lián)可以是與本文中公開(kāi)的任何非多肽組分的偶聯(lián)，如與聚合物分子如PEG的偶聯(lián)。
對(duì)使用的特定標(biāo)記物的識(shí)別不是關(guān)鍵，只要該標(biāo)記物能夠與多肽一起表達(dá)并且能夠固定在適宜的表面或載體物質(zhì)上即可。許多適宜的標(biāo)記物可通過(guò)商業(yè)渠道獲得，例如，可購(gòu)于Unizyme Laboratories，Denmark。例如，所述標(biāo)記物可以是任一下列序列His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-His-His-His-HisMet-Lys-His-His-Ala-His-His-Gln-His-HisMet-Lys-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln-His-Gln或任一下列序列EQKLI SEEDL(描述于Mol.Cell.Biol.53610-16，1985的C-端標(biāo)記物)DYKDDDDK(C-或N-端標(biāo)記物)YPYDVPDYA抗上述標(biāo)記物的抗體通?？赏ㄟ^(guò)商業(yè)渠道獲得，例如購(gòu)于ADI，AvesLab和Research Diagnostics。
隨后從多肽上切割標(biāo)記物可通過(guò)市售酶進(jìn)行。
制備本發(fā)明多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物多肽的方法本發(fā)明的多肽或本發(fā)明偶聯(lián)物的多肽部分(任選為糖基化形式)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法來(lái)制備。這些方法包括構(gòu)建編碼該多肽的核苷酸序列并在合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主中表達(dá)該序列。優(yōu)選宿主細(xì)胞是γ-羧基化的宿主細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。然而，可通過(guò)化學(xué)合成方法或化學(xué)合成方法的組合或者化學(xué)合成方法和重組DNA技術(shù)的組合來(lái)產(chǎn)生本發(fā)明的多肽，但效率很低。
編碼本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物多肽部分的核苷酸序列可通過(guò)分離或合成編碼具有SEQ ID NO1所示氨基酸序列的親代FVII，如hFVII的核苷酸序列來(lái)構(gòu)建，然后改變所述核苷酸序列以引入(即插入或取代)或消除(即去除或取代)相關(guān)氨基酸殘基。
核苷酸序列可通過(guò)公知方法經(jīng)定點(diǎn)誘變方便地進(jìn)行修飾?；蛘?，核苷酸序列可通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制備，例如通過(guò)使用寡核苷酸合成儀，其中基于所需多肽的氨基酸序列來(lái)設(shè)計(jì)寡核苷酸，并且優(yōu)選選擇有利于在生產(chǎn)重組多肽的宿主細(xì)胞中表達(dá)的那些密碼子。例如，可以合成多個(gè)編碼所需多肽各部分的小分子寡核苷酸，然后通過(guò)PCR、連接反應(yīng)或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)(Barany，PNAS 88189-193，1991)將所述寡核苷酸裝配起來(lái)。各個(gè)寡核苷酸通常含有5′或3′突出端用于互補(bǔ)裝配。
另外的核苷酸序列修飾方法可用于產(chǎn)生多肽變體以便高流量篩選的，例如US5093257中公開(kāi)的有關(guān)同源交換的方法，以及有關(guān)基因改組的方法，即兩個(gè)或多個(gè)同源核苷酸序列間的重組，導(dǎo)致產(chǎn)生與起始核苷酸序列相比有許多核苷酸改變的新的核苷酸序列。基因改組(也被稱為DNA改組)涉及一次或多次核苷酸序列的隨機(jī)片段化和重新裝配的循環(huán)，隨之通過(guò)篩選選擇編碼具有所期望特性的多肽的核苷酸序列。為了使基于同源性的核酸改組能夠發(fā)生，所述核苷酸序列的相關(guān)部分優(yōu)選至少有50％的同一性，如至少60％的同一性，更優(yōu)選至少70％的同一性，如至少80％的同一性。重組可在體外或體內(nèi)進(jìn)行。
以下文獻(xiàn)中顯示了適當(dāng)?shù)捏w外基因改組方法Stemmer等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA；vol.91，pp.10747-10751；Stemmer(1994)，Naturem vol.370，pp.389-391；Smith(1994)，Nature vol.370，pp.324-325；Zhao等，Nat.Biotechnol.1998.Mar；16(3)258-61；Zhao H.和Amold，F(xiàn)B，Nucleic AcidsResearch，1997，Vol.25.No.6 pp.1307-1308；Shao等，Nucleic Acids Research1998，Jan 15；26(2)pp.681-83；以及WO95/17413。
WO97/07205中公開(kāi)了一種合適的體內(nèi)改組方法。其他通過(guò)體外或體內(nèi)重組進(jìn)行核酸誘變的技術(shù)在，如WO97/20078和US5837458中公開(kāi)。特別的改組技術(shù)包括“基因族改組(Family shuffling)”，“合成改組”“計(jì)算機(jī)化(insliico)改組”。
基因族改組是使來(lái)自不同種屬的一族同源基因進(jìn)行一次或多次的改組和后續(xù)篩選或選擇的循環(huán)?；蜃甯慕M技術(shù)在一些文獻(xiàn)中有說(shuō)明，如Crameri等，(1998)，Nature，vol.391，pp.288-291；Christians等，(1999)，NatureBiotechnology，vol.17，pp.259-264；Chang等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，pp.793-797；以及Ness等(1999)，Nature Biotechnology，vol.17，893-896。
合成改組涉及提供重疊的合成寡核苷酸文庫(kù)，該文庫(kù)基于，如目的同源基因之間的序列比對(duì)。對(duì)這種合成的寡核苷酸進(jìn)行重組，篩選得到的重組核酸序列，如需要可進(jìn)行進(jìn)一步的改組循環(huán)。WO00/42561中有關(guān)于合成改組的說(shuō)明。
計(jì)算機(jī)化(In silico)改組指一種DNA改組過(guò)程，由計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行或模擬，因此部分或完全無(wú)須對(duì)核酸進(jìn)行物理操作。WO00/42560中有關(guān)于計(jì)算機(jī)化(in silico)改組的說(shuō)明。
一旦裝配(通過(guò)合成、定點(diǎn)誘變或另一方法)后，編碼多肽的核苷酸序列立即被插入重組載體中，并與FVII在目標(biāo)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中表達(dá)必需的調(diào)控序列可操作地連接。
當(dāng)然，應(yīng)理解不是所有載體和表達(dá)調(diào)控序列都能同樣良好地表達(dá)本文所述多肽變體的核苷酸序列。不是所有宿主都能使相同的表達(dá)系統(tǒng)發(fā)揮同樣優(yōu)良的功能。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員不用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)就可以對(duì)這些載體、表達(dá)調(diào)控序列和宿主作出選擇。例如，在選擇載體時(shí)必須考慮宿主，因?yàn)檩d體必須在其中復(fù)制或能夠整合到染色體中。也應(yīng)考慮載體拷貝數(shù)、控制拷貝數(shù)的能力以及載體編碼的任何其它蛋白質(zhì)如抗生素標(biāo)記物的表達(dá)。在選擇表達(dá)調(diào)控序列時(shí)，也應(yīng)考慮各種因素。這些因素包括如序列的相對(duì)長(zhǎng)度、其可控制性以及與編碼多肽的核苷酸序列的相容性，特別要考慮潛在的二級(jí)結(jié)構(gòu)。選擇宿主時(shí)應(yīng)考慮其與所選載體的相容性、核苷酸序列編碼的產(chǎn)物的毒性、宿主的分泌特性和宿主正確折疊多肽的能力、宿主的發(fā)酵和培養(yǎng)要求和核苷酸序列編碼產(chǎn)物純化的難易。
重組載體可以是自主復(fù)制的載體，即載體作為染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如質(zhì)粒。另外，引入宿主細(xì)胞時(shí)，載體可整合到宿主細(xì)胞基因組中并且與其整合的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選是表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可與核苷酸序列轉(zhuǎn)錄所需的另外的片斷可操作地連接。載體通常由質(zhì)?；虿《綝NA衍生。用于在本文所述宿主細(xì)胞中表達(dá)的各種合適的表達(dá)載體是可商購(gòu)的或有文獻(xiàn)描述的。可用于真核宿主的表達(dá)載體包括如含有來(lái)自SV40、牛乳頭瘤病毒、腺病毒和巨細(xì)胞病毒的表達(dá)調(diào)控序列的載體。具體的載體如pCDNA3.1(+)\Hyg(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和pCI-neo(Stratagene，LaJola，CA，USA)?？捎糜诮湍讣?xì)胞的表達(dá)載體包括2(質(zhì)粒及其衍生物，POT1載體(US4,931,373)，pJSO37載體(描述于Okkels，Ann.New York Acad.Sci.782，202-207，1996)和pPICZ A，B或C(Invitrogen)?？捎糜诶ハx(chóng)細(xì)胞的表達(dá)載體包括pVL941，pBG311(Cate等，″Isolation of Bovine and Human Genes forMullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In AnimalCells″，Cell，45，pp.685-98(1986)，pBluebac 4.5和pMelbac(都來(lái)自Invitrogen)?？捎糜诩?xì)菌宿主的表達(dá)載體包括已知的細(xì)菌質(zhì)粒，如來(lái)自大腸桿菌的質(zhì)粒包括pBR322，pET3a和pET12a(都來(lái)自Novagen Inc.，WI，USA)，較寬宿主范圍的質(zhì)粒，如RP4，噬菌體DNA，例如λ噬菌體的各種衍生物，例如NM989，和其它DNA噬菌體，如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體。
本發(fā)明中使用的其它載體包括允許編碼多肽的核苷酸序列擴(kuò)增多個(gè)拷貝的那些載體。這種可擴(kuò)增的載體是本領(lǐng)域公知的。例如，它們包括能夠通過(guò)DHFR擴(kuò)增的載體(例如參見(jiàn)Kaufman，U.S.Pat.No.4,470,461，Kaufmanand Sharp，″Construction Of A Modular Dihydrofolate Reductase cDNA GeneAnalysis Of Signals Utilized For Efficient Expression″，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))和可通過(guò)谷氨酰胺合成酶(″GS″)擴(kuò)增的載體(例如參見(jiàn)US5,122,464和EP338,841)。
重組載體可進(jìn)一步包含能夠使所述載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。此序列的一個(gè)例子(宿主細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí))是SV40的復(fù)制起始點(diǎn)。當(dāng)宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞時(shí)，能夠使載體復(fù)制的合適序列是酵母質(zhì)粒2(復(fù)制基因REP1-3和復(fù)制起始點(diǎn)。
載體也可含有可選擇的標(biāo)記，如基因，其產(chǎn)物補(bǔ)充宿主細(xì)胞的缺陷，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母TPI的基因(P.R.Russell，Gene40，1985，pp.125-130)，或者賦予對(duì)藥物如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性的基因。對(duì)于釀酒酵母來(lái)說(shuō)，可選擇的標(biāo)志包括ura3和Leu2。對(duì)于絲狀真菌來(lái)說(shuō)，可選擇的標(biāo)記包括amdS、pyrG、arcB、niaD和sC。
術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”在本文中包括對(duì)本發(fā)明多肽表達(dá)必需的或有利的所有成分。每個(gè)調(diào)控序列對(duì)編碼多肽的核苷酸序列來(lái)說(shuō)可以是天然的或外來(lái)的。這些調(diào)控序列包括但不限于前導(dǎo)區(qū)、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或上游活化序列、信號(hào)肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。調(diào)控序列至少包括啟動(dòng)子。
本發(fā)明可以使用各種各樣的表達(dá)調(diào)控序列。這些可使用的表達(dá)調(diào)控序列包括與前述表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)基因相連的表達(dá)調(diào)控序列以及已知調(diào)控原核或真核細(xì)胞或其病毒的基因表達(dá)的任何序列及其各種組合。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的合適調(diào)控序列的實(shí)例包括SV40和腺病毒的早期或晚期啟動(dòng)子，如腺病毒2的主要晚期啟動(dòng)子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒立即早期基因啟動(dòng)子(CMV)、人延伸因子1((EF-1()啟動(dòng)子、果蠅最小熱休克蛋白70啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子、人遍在蛋白C(UbC)啟動(dòng)子、人生長(zhǎng)激素終止子、SV40或腺病毒Elb區(qū)聚腺苷酸化信號(hào)和Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol 1987 Aug 20；196(4)947-50)。
為了改進(jìn)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)，可以將合成的內(nèi)含子插入編碼所述多肽的核苷酸序列的5′非翻譯區(qū)。合成內(nèi)含子的實(shí)例是來(lái)自質(zhì)粒pCI-Neo的合成內(nèi)含子(購(gòu)自Promega Corporation，WI，USA)。
昆蟲(chóng)細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的合適調(diào)控序列的實(shí)例包括多角體蛋白啟動(dòng)子、P10啟動(dòng)子、苜蓿銀紋夜蛾(Autographa califomica)多角體病毒堿性蛋白啟動(dòng)子、桿狀病毒立即早期基因1啟動(dòng)子和桿狀病毒39K延遲早期基因啟動(dòng)子和SV40聚腺苷酸化序列。在酵母宿主細(xì)胞中使用的合適調(diào)控序列的實(shí)例包括酵母(交配系統(tǒng)的啟動(dòng)子、酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(TPI)啟動(dòng)子、來(lái)自酵母糖酵解基因或乙醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子、ADH2-4c啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型GAL啟動(dòng)子。在絲狀真菌宿主細(xì)胞中使用的合適調(diào)控序列的實(shí)例包括ADH3啟動(dòng)子和終止子、由編碼米曲霉TAKA淀粉酶丙糖磷酸異構(gòu)酶或堿性蛋白酶、黑曲霉(淀粉酶、黑曲霉或構(gòu)巢曲霉(A.Nidulans)葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶或脂肪酶的基因衍生的啟動(dòng)子、TPI1終止子和ADH3終止子。在細(xì)菌宿主細(xì)胞中使用的合適調(diào)控序列的實(shí)例包括lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)的啟動(dòng)子和(噬菌體的主要啟動(dòng)子區(qū)域。
信號(hào)肽的存在或不存在如取決于用于多肽生產(chǎn)的表達(dá)宿主細(xì)胞、被表達(dá)的蛋白質(zhì)(是細(xì)胞內(nèi)的還是細(xì)胞外的蛋白質(zhì))和是不是需要分泌。為了在絲狀真菌中使用，信號(hào)肽可以由編碼曲霉屬菌株的淀粉酶或葡萄糖淀粉酶的基因、編碼米赫根毛霉脂肪酶或蛋白酶或Humicola lanuginosa脂肪酶的基因方便衍生。信號(hào)肽優(yōu)選由編碼米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性(-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定淀粉酶或黑曲霉葡萄糖淀粉酶的基因衍生。為了在昆蟲(chóng)細(xì)胞中使用，信號(hào)肽可以由昆蟲(chóng)基因方便地衍生(參見(jiàn)WO90/05783)，如鱗翅目Manduca sexta脂動(dòng)激素前體(US5023328)、蜜蜂蜂毒素(Invitrogen)、蛻皮甾類UDP葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase)(egt)(Murphy等，ProteinExpression and Purification 4，349-357(1993))或人胰脂酶(hpl)(Methods inEnzymology 284，pp.262-272，1997)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用的優(yōu)選信號(hào)肽是hFVII的或鼠Ig(輕鏈信號(hào)肽(Coloma，M(1992)J.Imm.Methods 15289-104)。為了在酵母細(xì)胞中使用，發(fā)現(xiàn)合適的信號(hào)肽是釀酒酵母(-因子信號(hào)肽(參見(jiàn)US4870008)、改性的羧肽酶信號(hào)肽(參見(jiàn)L.A.Valls等人，Cell 48，1987，pp.887-897)、酵母BAR1信號(hào)肽(參見(jiàn)WO87/02670)、酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信號(hào)肽(參見(jiàn)M.Egel-Mitani等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)以及合成的前導(dǎo)序列TA57(WO98/32867)。大腸桿菌的合適信號(hào)肽是信號(hào)肽ompA(EP581821)。
本發(fā)明編碼FVII多肽的核苷酸序列，無(wú)論通過(guò)定點(diǎn)誘變、合成、PCR或其他何種方法制備，可選擇地包括編碼信號(hào)肽的核苷酸序列。如多肽需要從表達(dá)的細(xì)胞中分泌則需要信號(hào)肽。這種信號(hào)肽，如果存在，應(yīng)該是能被表達(dá)所述多肽的細(xì)胞識(shí)別的。信號(hào)肽可與所述多肽同源(如，通常與hFVII相連)或異源(如其起源異于hFVII)，或者可以與宿主細(xì)胞同源或異源，即通常所述信號(hào)肽是該宿主細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)肽或者通常其不是該宿主細(xì)胞表達(dá)的信號(hào)肽。相應(yīng)的，所述信號(hào)肽可以是原核的，如來(lái)源于細(xì)菌如大腸桿菌，或者是真核的，如來(lái)源于哺乳動(dòng)物或昆蟲(chóng)或酵母細(xì)胞。
可以使用任何合適的宿主產(chǎn)生本發(fā)明偶聯(lián)物的多肽，包括細(xì)菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物或其它合適的動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞系以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。細(xì)菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌如芽孢桿菌屬，如短芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌、假單孢菌屬或鏈霉菌屬或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌菌株。載體可引入細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如可通過(guò)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見(jiàn)如Chang and Cohen，1979，Molecular General Genetics 168111-115)，使用感受態(tài)細(xì)胞(參見(jiàn)如Young and Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81823-829，或Dubnau and Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56209-221)、電穿孔(參見(jiàn)如Shigekawa and Dower，1988，Biotechniques6742-751)或偶聯(lián)(參見(jiàn)如Koehler and Thorne，1987，Journal of Bacteriology1695771-5278)來(lái)進(jìn)行。合適的絲狀真菌宿主細(xì)胞的實(shí)例包括曲霉屬菌株，如米曲霉、黑曲霉或構(gòu)巢曲霉，鐮刀菌屬或木霉菌屬。真菌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化過(guò)程涉及原生質(zhì)體形成、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和細(xì)胞壁通過(guò)本身已知的方式再生。在EP238023和US5679543中描述了轉(zhuǎn)化曲霉屬宿主細(xì)胞的合適方法。在Malardier等人1989，Gene 78147-156和WO96/00787中描述了轉(zhuǎn)化鐮刀菌屬的合適方法。合適的酵母宿主細(xì)胞的實(shí)例包括糖酵母屬的菌株，如釀酒酵母屬、裂殖酵母屬、克魯維酵母屬、畢赤酵母屬，如巴斯德畢赤酵母或P.Methanolica、漢遜酵母屬，如多形漢遜酵母或Yarrowia。酵母可使用Becker和Guarente，In Abelson，J.N.And Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Geneticsand Molecular Biology，Methods in Enzymology Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito等人，1983，Journal of Bacteriology 153163；和Hinnen等人1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA751920；以及由Clontech Laboratories，Inc，Palo Alto，CA，USA(YeastmakerTM酵母轉(zhuǎn)化系統(tǒng)試劑盒的產(chǎn)品手冊(cè))中所述的方法來(lái)轉(zhuǎn)化。合適昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞的實(shí)例包括鱗翅目細(xì)胞系，如草地夜蛾(Sf9或Sf21)或粉紋夜蛾細(xì)胞(High Five)(US5077214)?？梢园碔nvitrogen所述方法轉(zhuǎn)化昆蟲(chóng)細(xì)胞并在其中產(chǎn)生異源多肽。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系(如，CHO-K1；ATCC CCL-61)、綠猴細(xì)胞系(COS)(如，COS1(ATCC CRL-1650)、COS7(ATCC CRL-1651))；小鼠細(xì)胞(如，NS/O)、倉(cāng)鼠幼鼠腎臟(BHK)細(xì)胞系(如，ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)和人細(xì)胞(如，HEK293(ATCC CRL-1573))，以及組織培養(yǎng)中的植物細(xì)胞。另外合適的細(xì)胞系在本領(lǐng)域中是已知的并可購(gòu)自公共的保藏中心如美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，Maryland。而且，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)可按US5047335所述方法進(jìn)行改性來(lái)表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶，如，1，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶，以便改進(jìn)FVII或FVIIa多肽的糖基化。
為了增加分泌，使本發(fā)明多肽與內(nèi)切蛋白酶，尤其是PACE(配對(duì)的堿性氨基酸轉(zhuǎn)化酶)(如US5986079中所述)，如Kex2內(nèi)切蛋白酶(如WO00/28065中所述)一起合成是有利的。
將外源性DNA引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、病毒載體和由LifeTechnologies Ltd，Paisley，UK所述的使用Lipofectamin2000的轉(zhuǎn)染方法。這些方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如在Ausbel等人(eds.)，1996，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，USA中所述的。按建立的方法進(jìn)行哺乳動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)，例如在Animal Cell Biotechnology，Methods and Protocols，Nigel Jenkins編，1999，Human Press Inc，Totowa，NewJersey，USA and Harrison MA and Rae IF，General Techniques of Cell Culture，Cambridge University Press 1997中公開(kāi)的。
在本發(fā)明生產(chǎn)方法中，用本領(lǐng)域已知的方法在適于生產(chǎn)多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，細(xì)胞可以在實(shí)驗(yàn)室中通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、成批、補(bǔ)料分批或固體狀態(tài)發(fā)酵)或在合適培養(yǎng)基和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行工業(yè)發(fā)酵。培養(yǎng)在含有碳和氮源和無(wú)機(jī)鹽的合適營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行。合適的培養(yǎng)基可商購(gòu)或可以按公開(kāi)的組成來(lái)制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中所述的)。如果多肽分泌在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，多肽可從培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不被分泌，可從細(xì)胞裂解物中回收。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)回收所得多肽。例如，可通過(guò)常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收多肽。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的各種方法包括但不限于層析(如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(如，制備性等電聚焦)、溶解度差異(如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見(jiàn)，如Protein Purification，J.-C.Jansonand Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)來(lái)純化多肽。
在文獻(xiàn)中公開(kāi)了純化單鏈FVII并且將其活化為雙鏈FVIIa的多種方法(Broze和Majerus，1980，J.Biol.Chem.2551242-47，Hedner和Kisiel，1983，J.Clin.Invest.711836-41等)。一種可用于純化單鏈FVII的方法是如US5700914所述在純化過(guò)程中引入鋅離子。
一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述多肽作為單鏈FVII被純化，并進(jìn)一步被PEG化。PEG化的FVII單鏈多肽活化是通過(guò)使用固定化酶(如因子IIa，IXa，Xa和XIIa)，或通過(guò)使用陽(yáng)離子交換基質(zhì)或其類似物自活化。
首先純化單鏈形式的FVII，然后進(jìn)行PEG化(如果需要)，最后通過(guò)上述方法之一或如Pedersen等(1989，Biochemistry 289331-36)所述的自活化進(jìn)行活化是有利的。在活化前進(jìn)行PEG化的優(yōu)點(diǎn)在于避免了對(duì)R152-I153的剪切所形成的新的氨基末端的PEG化。新的氨基末端的PEG化可使所述分子失活，因?yàn)镈242和I153氨基末端之間形成的氫鍵是活性所必需的。
本發(fā)明的藥物組合物及其用途另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及組合物，特別涉及一種藥物組合物，其包含本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物(包括上述無(wú)活性的偶聯(lián)物)和可藥用載體或賦形劑。
本發(fā)明的偶聯(lián)物、多肽或藥物組合物可用做藥物。
優(yōu)選，所述多肽或所述(活性)偶聯(lián)物可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物中FVIIa/TF相關(guān)疾病或紊亂的藥物。例如所述多肽或所述(活性)偶聯(lián)物可用于生產(chǎn)治療或預(yù)防疾病的藥物，其中加快凝血對(duì)于所述疾病是有利的，如治療患有血管損傷時(shí)凝血不足疾病的患者。尤其，所述多肽或所述(活性)偶聯(lián)物可用做生產(chǎn)治療以下疾病的藥物，血友病、具有FVIII和FIX抑制劑的血友病，血小板減少的患者，血小板病的患者，如格蘭茲曼氏血小板機(jī)能不全血小板釋放缺陷和貯存庫(kù)缺陷，患von Willebrand疾病的患者，患有肝臟疾病的患者，或有嚴(yán)重出血問(wèn)題的健康者，如因外傷或大手術(shù)產(chǎn)生了針對(duì)FVIIa的抑制劑，出血紊亂，如血友病及其他通常與嚴(yán)重組織損傷有關(guān)的疾病。
類似的，本發(fā)明的無(wú)活性偶聯(lián)物，可用做生產(chǎn)治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物FVIIa/TF相關(guān)疾病或紊亂的藥物。例如，本發(fā)明的無(wú)活性偶聯(lián)物可用做生產(chǎn)治療或預(yù)防疾病的藥物，其中降低凝血對(duì)于所述疾病是有利的，如預(yù)防或治療處于高度凝血狀態(tài)的患者，如膿毒癥、深度靜脈血栓的患者，易患心肌梗塞或血栓性中風(fēng)、肺梗塞的患者，急性冠狀動(dòng)脈綜合癥(acute coronarysyndromes)(心肌梗塞和不穩(wěn)定的心絞痛)的患者，冠狀動(dòng)脈性心臟病(coronarycardiac)患者，預(yù)防接受血管成型手術(shù)患者的心臟疾病和restonosis，以及患外周血管疾病的患者。本發(fā)明的無(wú)活性偶聯(lián)物也可用于生產(chǎn)治療呼吸疾病、腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的藥物。
另一方面，所述多肽，所述(活性)偶聯(lián)物或包含本發(fā)明活性偶聯(lián)物的所述藥物組合物可用于治療患FVIIa/TF相關(guān)疾病或紊亂(如一種或多種以上所述疾病或紊亂)的哺乳動(dòng)物的方法中，包括給予需要治療的哺乳動(dòng)物以有效劑量的這種多肽，偶聯(lián)物或組合物。
類似的，所述無(wú)活性偶聯(lián)物或包含本發(fā)明無(wú)活性偶聯(lián)物的所述藥物組合物可用于治療患有FVIIa/TF相關(guān)疾病或紊亂(如一種或多種以上所述疾病或紊亂)的哺乳動(dòng)物的方法中，包括給予需要治療的哺乳動(dòng)物以有效劑量的這種無(wú)活性偶聯(lián)物或組合物。
以治療有效劑量給予本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物，所述劑量大約與用rFVII如NovoSeven治療所采用的劑量相同或更高。本文中“治療有效劑量”是指對(duì)所治疾病狀態(tài)足以產(chǎn)生預(yù)期效果的劑量。給藥的準(zhǔn)確劑量取決于具體情況，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)公知的方法加以確定。一般來(lái)說(shuō)，所述劑量應(yīng)當(dāng)能夠防止或減小被治療疾病或癥狀的嚴(yán)重性或擴(kuò)散。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是本發(fā)明多肽、偶聯(lián)物或組合物的有效量取決于疾病、劑量、給藥時(shí)間表、多肽或偶聯(lián)物或組合物是單獨(dú)給藥還是與其它治療劑聯(lián)合給藥、組合物的血清半壽期和患者的總體健康狀況。優(yōu)選，本發(fā)明的多肽、偶聯(lián)物或組合物以有效劑量給予，尤其以足以使凝血紊亂正常化的劑量給予。
本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物優(yōu)選以組合物形式給藥，其中包括可藥用載體或賦形劑。“可藥用”意指在給藥的患者中不引起任何不利作用的載體或賦形劑。這些可藥用載體和賦形劑在本領(lǐng)域中是公知的(參見(jiàn)，如Remington′sPharmaceutical Sciences，18th edition，A.R.Gennaro，Ed.，Mack PublishingCompany(1990)；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins，S.Frokjaer和L.Hovgaard，Eds.，Taylor & Francis(2000)；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，3rd edition，A.Kibbe，Ed.，Pharmaceutical Press(2000))。
本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可通過(guò)公知方法配制成藥物組合物。在E.W.Martin(Mark Publ公司，16版，1980)Remington′s Pharmaceutical Sciences描述了合適的制劑。
本發(fā)明的多肽或偶聯(lián)物可以原形使用和/或以其鹽的形式使用。合適的鹽包括但不限于與堿金屬或堿土金屬如鈉、鉀、鈣和鎂形成的鹽，以及如鋅鹽。這些鹽或復(fù)合物可作為晶體和/或無(wú)定形結(jié)構(gòu)存在。
本發(fā)明的藥物組合物可單獨(dú)給予也可以與其他治療制劑聯(lián)合給予。這些制劑可以作為同一藥物組合物中的一個(gè)組成部分給予，或者與本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物同時(shí)或依照一定的治療時(shí)間表分別給予。此外，本發(fā)明的多肽、偶聯(lián)物或藥物組合物可用做其他治療的佐劑。
本發(fā)明中“患者”包括人和其他哺乳動(dòng)物。因此所述方法醫(yī)用獸用均可。本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的藥物組合物可以多種形式配置，如以液體，凝膠，凍干粉或壓制的固體形式。優(yōu)選的形式根據(jù)治療的特別需要而異，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
尤其，本發(fā)明多肽或偶聯(lián)物的藥物組合物以凍干粉或穩(wěn)定溶液形式配制。所述多肽或偶聯(lián)物可通過(guò)多種公知方法凍干粉化。多肽或偶聯(lián)物可通過(guò)將蛋白酶解位點(diǎn)去除或掩蓋，制備成穩(wěn)定的溶液形式。獲得穩(wěn)定溶液的優(yōu)點(diǎn)在于更便于患者使用，而且在緊急情況時(shí)，作用更快，這可能可以救生。優(yōu)選的形式根據(jù)治療的特定需要而異，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。
本發(fā)明制劑可以多種方式給藥，包括但不限于，口服、皮下、靜脈內(nèi)、小腦內(nèi)、鼻內(nèi)、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、眼內(nèi)或以任何其它適宜的方式。制劑可連續(xù)灌注給予，盡管大藥丸注射(bolusinjection)是可接受的，但需利用本領(lǐng)域公知技術(shù)，如泵或植入。一些情況下所述制劑可以溶液或噴霧直接給予。
非胃腸道給藥劑(Parentals)藥物組合物的優(yōu)選實(shí)例是設(shè)計(jì)成非腸道給藥的溶液。盡管在很多情況下，藥物溶液制劑可以以適用于立即使用的液體形式提供，但所述非腸道制劑也可以以冷凍或凍干形式提供。在前者情況下，所述組合物在使用前必須解凍。后一劑型通常用于增強(qiáng)組合物中所包含的活性組分在各種貯存條件下的穩(wěn)定性，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，凍干制劑通常比其液體相應(yīng)物更穩(wěn)定。所述凍干制劑在使用前通過(guò)加入一種或多種適宜的可藥用稀釋劑如滅菌注射用水或滅菌生理鹽水溶液重新配制。
在非胃腸道給藥的情況下，制成凍干制劑或水溶液備用，如通過(guò)將具有所需純度的多肽與一種或多種本領(lǐng)域常用的可藥用載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(統(tǒng)稱為“賦形劑”)適當(dāng)混合來(lái)制備，賦形劑如緩沖劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑或去污劑、抗氧化劑和/或其它各種添加劑。
緩沖劑有助于將pH保持在接近生理?xiàng)l件的范圍中。它們通常以大約2mM-50mM的濃度范圍存在。本發(fā)明使用的合適緩沖劑包括有機(jī)和無(wú)機(jī)酸及其鹽如檸檬酸鹽緩沖劑(如，檸檬酸一鈉-檸檬酸二鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸三鈉混合物、檸檬酸-檸檬酸一鈉混合物等)、琥珀酸鹽緩沖劑(如，琥珀酸-琥珀酸一鈉混合物、琥珀酸-氫氧化鈉混合物、琥珀酸-琥珀酸二鈉混合物等)、酒石酸鹽緩沖劑(如，酒石酸-酒石酸鈉混合物、酒石酸-酒石酸鉀混合物、酒石酸-氫氧化鈉混合物等)、富馬酸鹽緩沖劑(如，富馬酸-富馬酸一鈉混合物、富馬酸-富馬酸二鈉混合物、富馬酸一鈉-富馬酸二鈉混合物等)、葡萄糖酸鹽(gluconate)緩沖劑(如，葡萄糖酸-葡萄糖酸鈉混合物、葡萄糖酸-氫氧化鈉混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸鉀混合物等)、草酸鹽緩沖劑(如，草酸-草酸鈉混合物、草酸-氫氧化鈉混合物、草酸-草酸鉀混合物等)、乳酸鹽緩沖劑(如，乳酸-乳酸鈉混合物、乳酸-氫氧化鈉混合物、乳酸-乳酸鉀混合物等)和乙酸鹽緩沖劑(如，乙酸-乙酸鈉混合物、乙酸-氫氧化鈉混合物等)。其它可能的緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑、組氨酸緩沖劑和三甲胺鹽如Tris。
穩(wěn)定劑涉及一大類賦形劑，其功能范圍從膨脹劑到溶解治療劑的或有助于防止變性或與容器壁粘合的添加劑。通常的穩(wěn)定劑可以是多羥糖醇(上文列舉的)；氨基酸如精氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、丙氨酸、omithine、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、蘇氨酸等，有機(jī)糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、水蘇糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括環(huán)醇如環(huán)己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫還原劑，如脲，谷胱甘肽、硫辛酸、巰基乙酸鈉、硫代甘油、(-單硫代甘油和硫代硫酸鈉；低分子量多肽(即＜10個(gè)殘基)；蛋白質(zhì)如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；單糖如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖如乳糖、麥芽糖和蔗糖；三糖如棉子糖，和多糖如葡聚糖?；诨钚缘鞍踪|(zhì)重量計(jì)算，穩(wěn)定劑通常的存在范圍為0.1-10000重量份。
加入防腐劑來(lái)阻滯微生物生長(zhǎng)，加入的量通常約為0.2％-1％(w/v)。本發(fā)明使用的合適防腐劑包括酚、苯甲醇、間甲酚、羥苯甲酸(paraben)甲酯、羥苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨、苯亞甲基 鹵化物(如苯亞甲基 氯化物、溴化物或碘化物)、氯化己烷雙胺、羥苯甲酸烷基酯如甲酯或丙酯、兒茶酚、間苯二酚、環(huán)己醇和3-戊醇。
可以加入等滲劑來(lái)確保液體組合物的等滲性，等滲劑包括多羥糖醇，優(yōu)選三羥或更高級(jí)糖醇，如甘油、赤蘚醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露糖醇。多羥基醇的量可為0.1％-25％重量比，通常為1％-5％，以其它組分的相對(duì)量計(jì)算。
可以存在非離子表面活性劑或清潔劑(也稱作“濕潤(rùn)劑”)以有助于溶解治療劑以及保護(hù)治療性多肽以避免攪拌誘導(dǎo)的聚集，其也允許配方劑暴露于剪切表面壓力而不導(dǎo)致多肽變性。合適的非離子表面活性劑包括聚山梨酸酯(polysorbate)(20，80等)、polyoxamer(184，188等)、Pluronic(多元醇、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單醚(吐溫20、吐溫80等)。
其它各種賦形劑包括膨脹劑或填充劑(如淀粉)、螯合劑(如EDTA)、抗氧化劑(如抗壞血酸、蛋氨酸、維生素E)和共溶劑。
活性組分也可以被包裹在制備的微囊中，例如通過(guò)coascervation技術(shù)或通過(guò)界面聚合制備，例如羥甲基纖維素、明膠或聚(甲基甲丙烯酸酯)微囊，包裹在膠體狀藥物釋放體系(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米膠囊)中或包裹在大乳劑中。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(同上)中公開(kāi)了這些技術(shù)。
體內(nèi)給藥所使用的非胃腸道制劑必須是滅菌的。該過(guò)程容易完成，例如，通過(guò)無(wú)菌濾膜來(lái)過(guò)濾。
持續(xù)釋放制劑持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有多肽或偶聯(lián)物的固體疏水聚合物半滲透材料、具有合適形式如膜或微囊的材料。持續(xù)釋放材料的例子包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基甲丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如ProLease(技術(shù)或Lupron Depot((由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球)和聚-D-(-)-3-羥基丁酸。聚合物如乙烯乙酸乙酯和乳酸-乙醇酸能夠長(zhǎng)時(shí)間釋放分子如長(zhǎng)達(dá)或超過(guò)100天，某些水凝膠在較短時(shí)間內(nèi)釋放蛋白質(zhì)。包囊中的多肽長(zhǎng)時(shí)間保留在體內(nèi)時(shí)，它們因在37℃潮濕的環(huán)境中暴露而變性或聚集，導(dǎo)致生物活性喪失并且可能改變免疫原性。合理的穩(wěn)定策略可根據(jù)所涉及的機(jī)理設(shè)計(jì)。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚集機(jī)理是通過(guò)硫代二硫化物相互交換形成分子內(nèi)S-S鍵，那么可通過(guò)修飾巰基、凍干酸性溶液、控制濕度、使周適宜的引入劑和開(kāi)發(fā)特異性聚合物型組合物來(lái)達(dá)到穩(wěn)定。
在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，這些實(shí)施例并無(wú)限定。
序列SEQ ID NO1顯示hFVII蛋白(包括γ-羧基化殘基)SEQ ID NO2顯示編碼hFVII蛋白的cDNA序列SEQ ID NO3顯示hFVII蛋白(無(wú)γ-羧基化殘基)SEQ ID NO4顯示FVII蛋白在哺乳動(dòng)物中表達(dá)的表達(dá)盒SEQ ID NO5顯示CBProFpr174引物SEQ ID NO6顯示CBProFpr175引物SEQ ID NO7顯示CBProFpr216引物SEQ ID NO8顯示CBProFpr229引物SEQ ID NO9顯示CBProFpr221引物SEQ ID NO10顯示CBProFpr228引物SEQ ID NO11顯示CBProFpr226引物材料和方法用于確定所要改變的氨基酸的方法可接近的表面區(qū)域(ASA)使用計(jì)算機(jī)程序組(B.Lee和F.M.Richards，J.Mol.Biol.55379-400(1971))版本2(Copyright(c)1983 Yale University)計(jì)算結(jié)構(gòu)中各個(gè)原子的可接近的表面區(qū)域(ASA)。該方法通常使用1.4大小的探針并將可接近的表面區(qū)域(ASA)定義為探針中心形成的面積。于該計(jì)算前，從坐標(biāo)中去除所有水分子和所有氫原子，以及其它不與該蛋白質(zhì)直接相連的原子。
側(cè)鏈的分級(jí)(fractional)ASA側(cè)鏈原子的分級(jí)ASA通過(guò)側(cè)鏈中原子的ASA總和除以延長(zhǎng)的ALA-x-ALA三肽中殘余類型側(cè)鏈原子的ASA代表值來(lái)計(jì)算。參見(jiàn)Hubbard，Campbell & Thornton(1991)J.Mol.Biol.220，507-530。在該例中，CA原子被看作甘氨酸殘基側(cè)鏈的一部分但不被看作其它殘基的一部分。下表表示側(cè)鏈的100％ASA標(biāo)準(zhǔn)
在該結(jié)構(gòu)上未發(fā)現(xiàn)的殘基鑒定為具有100％的暴露，因其被認(rèn)為位于彈性區(qū)域。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35處的γ-羧基谷氨酸均被確定為100％暴露。
確定原子之間的距離利用分子繪圖軟件，如Insight II(v.98.0 MSI INC，可方便地確定原子之間的距離。
催化位點(diǎn)區(qū)催化位點(diǎn)區(qū)定義為任何這樣的殘基，所述殘基具有至少一個(gè)原子在催化三聯(lián)體(殘基H193，D242，S344)內(nèi)任何原子的10距離內(nèi)。
確定組織因子結(jié)合位點(diǎn)受體結(jié)合位點(diǎn)被定義為包含所有這類殘基，所述殘基在受體結(jié)合時(shí)，其可接近的表面區(qū)域改變。這通過(guò)至少兩個(gè)ASA計(jì)算來(lái)確定；一個(gè)基于配基/受體復(fù)合物中分離的配基，另一個(gè)基于完整的配基/受體復(fù)合物。
檢測(cè)FVII和FVIIa性質(zhì)的方法檢測(cè)功能性體內(nèi)半壽期的方法體內(nèi)生物半壽期的檢測(cè)可通過(guò)上述文獻(xiàn)中說(shuō)明的多種方法進(jìn)行。FDA參考號(hào)96-0597中說(shuō)明了檢測(cè)rFVIIa或其變體的體內(nèi)半壽期的方法。簡(jiǎn)要地，在給予所述偶聯(lián)物，多肽或組合物之前和之后24小時(shí)內(nèi)抽取血漿，檢測(cè)該血漿內(nèi)FVII凝血活性。檢測(cè)出穩(wěn)定狀態(tài)下分布體積的中值，并確定中值清除率。
對(duì)蛋白酶解敏感性降低的檢測(cè)制備組合物，所述組合物包含偶聯(lián)物(100-750μg/ml，優(yōu)選600μg/ml)，1.5mg Ca2+/ml(以氯化鈣形式)，甘露醇(30mg/ml)，polysorbate 80(0.1mg/ml)，氯化鈉(3mg/ml)，和甘氨酰-甘氨酸緩沖液(1.3mg/ml，pH5.5)。
制備含有野生型rFVIIa的類似組合物。
以“檢測(cè)凝血活性的方法”或“檢測(cè)低水平催化活性的方法”或“檢測(cè)催化活性的方法”章節(jié)中所述方法，確定起始凝血活性，或起始酰胺分解活性。
然后將組合物在37℃溫育直到含有野生型rFVIIa的組合物喪失其起始凝血或酰胺化活性的至少25％，優(yōu)選至少50％。
然后檢測(cè)包含本發(fā)明偶聯(lián)物的組合物的凝血或酰胺分解活性。
以百分比表示本發(fā)明偶聯(lián)物與野生型rFVIIa相比，對(duì)蛋白酶解的敏感性的降低。
對(duì)蛋白酶解降低的敏感性的其他檢測(cè)方法蛋白酶解可通過(guò)US5580560的實(shí)施例5中說(shuō)明的方法檢測(cè)，其中所述蛋白水解是自我蛋白酶解。
此外，降低的蛋白酶解可利用放射性標(biāo)記樣品在體內(nèi)模型中進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)取血樣，并對(duì)這些血樣進(jìn)行SDS-PAGE和放射自顯影來(lái)對(duì)比野生型和偶聯(lián)物的蛋白酶解作用。
無(wú)論使用何種分析確定蛋白酶解，“降低的蛋白酶解”是指與非偶聯(lián)的野生型FVIIa相比在裂解程度上的明顯降低，這是通過(guò)對(duì)考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠的凝膠掃描、HPLC測(cè)定，或利用下述顯色試驗(yàn)通過(guò)相對(duì)于野生型的保守的催化活性確定。
對(duì)rFVII及其偶聯(lián)物的分子量的確定偶聯(lián)的或非偶聯(lián)的rFVII或其偶聯(lián)物的分子量是通過(guò)SDS-PAGE、凝膠過(guò)濾、Western印跡、基質(zhì)輔助的激光解吸(matrix assisted laser deserption)、質(zhì)譜分析或平衡離心，如根據(jù)Laemmli，UK(Nature Vol 227(1970)，pp.680-85)的SDS-PAGE，進(jìn)行確定。
檢測(cè)低水平催化活性的方法用COASETFVII(Chromogenix，Art.No 82 19 00)確定FVII/FVIIa稀釋樣品和發(fā)酵液/經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的培養(yǎng)液中的酰胺分解活性。根據(jù)生產(chǎn)商的使用說(shuō)明測(cè)定酰胺分解活性。簡(jiǎn)要的，F(xiàn)X以過(guò)量存在，并在37℃被FVIIa轉(zhuǎn)變?yōu)镕Xa。所獲得的FXa水解顯色底物S2765(N-α-Cbo-D-Arg-Gly-Arg-pNA)，釋放顯色分子對(duì)-硝基-苯胺(para-nitro-anillin)(pNA)，吸收波長(zhǎng)為405nm的光。加入乙酸終止反應(yīng)。通過(guò)與FVIIa(試驗(yàn)緩沖液中125 pg/ml-1ng/ml)的標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較，確定樣品中FVII/FVIIa的量。
檢測(cè)催化活性的方法偶聯(lián)物裂解小肽底物的能力可通過(guò)使用顯色底物S-2288(D-Ile-Pro-Arg-對(duì)-硝基苯胺)檢測(cè)。重組FVIIa稀釋于含0.1％BSA的0.1M Tris，0.1M NaCl，5mM CaCl2，pH8.3中。加入S-2288至1mM起動(dòng)反應(yīng)，37℃溫育30分鐘后檢測(cè)405nm的吸光度。
檢測(cè)凝血活性的方法使用WO92/15686所述的標(biāo)準(zhǔn)一步(one-stage)凝血分析檢測(cè)FVIIa的活性。簡(jiǎn)言之，待測(cè)樣品在50mM Tris(pH7.5)，0.1％BSA中稀釋，取該溶液100μl與100μl FVII缺陷型血漿和200μl含10mM Ca++的促凝血酶原激酶C溫育。檢測(cè)凝血時(shí)間并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線使用檸檬酸化的正常人血漿的系列稀釋液制備。
檢測(cè)抗凝血活性的方法無(wú)活性FVII或FVIIa偶聯(lián)物的抗凝血活性可通過(guò)上述一步凝血分析(檢測(cè)凝血活性的方法)檢測(cè)，其中無(wú)活性偶聯(lián)物與野生型FVII競(jìng)爭(zhēng)有限數(shù)量的relipidated組織因子。分析基本按照WO92/15686，實(shí)施例III中所述方法進(jìn)行，該文本在此引用作為參考。記錄無(wú)活性偶聯(lián)物延長(zhǎng)野生型FVII凝血時(shí)間的能力，將其作為抗凝血活性的一個(gè)指標(biāo)。
實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例使用Banner等(J Mol Biol，1996；2852089)確定的與可溶性組織因子形成復(fù)合體的hFVIIa的X射線結(jié)構(gòu)。注意，參照文獻(xiàn)中的殘基序號(hào)并不與該序列一致。此處所用序號(hào)與SEQ ID NO1一致。位置6，7，14，16，19，20，25，26，29和35處的γ-羧基谷氨酸在此均命名為GLU(三字母的簡(jiǎn)寫(xiě))或E(單字母簡(jiǎn)寫(xiě))。所述結(jié)構(gòu)中不存在143-152位的殘基。
表面暴露對(duì)FVII片段單獨(dú)進(jìn)行的分級(jí)ASA計(jì)算，結(jié)合上述方法中對(duì)非標(biāo)準(zhǔn)和/或丟失殘基的可接近性的定義，確定以下殘基有超過(guò)25％的側(cè)鏈暴露于其表面A1，N2，A3，F(xiàn)4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，S12，L13，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，F(xiàn)24，E25，E26，R28，E29，F(xiàn)31，K32，D33，A34，E35，R36，K38，L39，W41，I42，S43，S45，G47，D48，Q49，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，D63，Q64，L65，Q66，S67，I69，F(xiàn)71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，T83，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，E99，S103，D104，H105，T106，G107，T108，K109，S111，R113，E116，G117，S119，L120，L121，A122，D123，G124，V125，S126，T128，P129，T130，V131，E132，I140，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，V158，P160，K161，E163，L171，N173，G174，A175，N184，T185，I186，H193，K197，K199，N200，R202，N203，I205，S214，E215，H216，D217，G218，D219，S222，R％224，S232，T233，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H249，Q250，P251，V253，T255，D256，E265，R266，T267，E270，R271，F(xiàn)275，V276，R277，F(xiàn)278，L280，L287，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，E296，N301，M306，T307，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，V317，G318，D319，S320，P321，N322，T324，E325，Y326，Y332，S333，D334，S336，K337，K341，G342，H351，R353，G354，Q366，G367，T370，V371，G372，R379，E385，Q388，K389，R392，S393，E394，P395，R396，P397，G398，V399，L400，L401，R402，P404和P406。
以下的殘基有超過(guò)50％的側(cè)鏈暴露于表面A1，A3，F(xiàn)4，L5，E6，E7，L8，R9，P10，E14，E16，K18，E19，E20，Q21，S23，E25，E26，E29，K32，A34，E35，R36，K38，L39，I42，S43，G47，D48，A51，S52，S53，Q56，G58，S60，K62，L65，Q66，S67，I69，F(xiàn)71，L73，P74，A75，E77，G78，R79，E82，H84，K85，D86，D87，Q88，L89，I90，V92，N93，E94，G97，T106，G107，T108，K109，S111，E116，S119，L121，A122，D123，G124，V131，E132，L141，E142，K143，R144，N145，A146，S147，K148，P149，Q150，G151，R152，G155，K157，P160，N173，G174，A175，K197，K199，N200，R202，S214，E215，H216，G218，R224，V235，P236，G237，T238，H249，Q250，V253，D256，T267，F(xiàn)275，R277，F(xiàn)278，L288，D289，R290，G291，A292，T293，L295，N301，M306，Q308，D309，L311，Q312，Q313，R315，K316，G318，D319，N322，E325，D334，K341，G354，G367，V371，E385，K389，R392，E394，R396，P397，G398，R402，P404和P406。
組織因子結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)ASA計(jì)算，人FVII中的以下殘基在復(fù)合物中改變其ASA。這些殘基被定義為組成受體結(jié)合位點(diǎn)的殘基 L13，K18，F(xiàn)31，E35，R36，L39，F(xiàn)40，I42，S43，S60，K62，D63，Q64，L65，I69，C70，F(xiàn)71，C72，L73，P74，F(xiàn)76，E77，G78，R79，E82，K85，Q88，I90，V92，N93，E94，R271，A274，F(xiàn)275，V276，R277，F(xiàn)278，R304，L305，M306，T307，Q308，D309，Q312，Q313，E325和R379。
活性位點(diǎn)區(qū)活性位點(diǎn)區(qū)是具有至少一個(gè)與催化三聯(lián)體(殘基H193，D242，S344)中任何原子的間距在10范圍內(nèi)的原子的任何殘基 I153，Q167，V168，L169，L170，L171，Q176，L177，C178，G179，G180，T181，V188，V189，S190，A191，A192，H193，C194，F(xiàn)195，D196，K197，I198，W201，V228，I229，I230，P231，S232，T233，Y234，V235，P236，G237，T238，T239，N240，H241，D242，I243，A244，L245，L246，V281，S282，G283，W284，G285，Q286，T293，T324，E325，Y326，M327，F(xiàn)328，D338，S339，C340，K341，G342，D343，S344， G345，G346，P347，H348，L358，T359，G360，I361，V362，S363，W364，G365，C368，V376，Y377，T378，R379，V380，Q382，Y383，W386，L387，L400和F405。
活性位點(diǎn)結(jié)合槽的脊活性位點(diǎn)結(jié)合槽的脊通過(guò)對(duì)FVIIa結(jié)構(gòu)1FAK.pdb的目測(cè)觀察定義為N173，A175，K199，N200，N203，D289，R290，G291，A292，P321和T370。
實(shí)施例2設(shè)計(jì)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)人凝血因子VII的表達(dá)盒合成SEQ ID NO2所示DNA序列(包含編碼具有天然短信號(hào)肽的人凝血因子VII全長(zhǎng)cDNA的短型(Hagen等，1986.PNAS 832412))，以促進(jìn)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高表達(dá)。首先根據(jù)Kozak共有序列(Kozak，M.J Mol Biol1987 Aug 20；196(4)947-50)修飾ATG起始密碼子的周圍序列，以使ATG起始密碼子上游共有序列完全匹配。然后，對(duì)天然人凝血因子cDNA的開(kāi)放式閱讀框進(jìn)行修飾，使所使用的密碼子為高表達(dá)的人基因中常用的密碼子。隨后，在開(kāi)放閱讀框末端插入兩個(gè)翻譯終止密碼子，以便翻譯有效終止。用70聚體DNA寡核苷酸裝配完全合成且優(yōu)化表達(dá)的FVII基因，最后用分別插入5′和3′末端BamHI和HindIII位點(diǎn)的末端引物，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增，得到以下序列(SEQ ID NO4)ggatcccgccaccatggtcagccaggccctccgcctcctgtgcctgctcctggggctgcagggctgcctggctgccgtcttcgtcacccaggaggaagcccatggcgtcctgcatcgccggcgccgggccaatgcctttctggaagagctccgccctggctccctggaacgcgaatgcaaagaggaacagtgcagctttgaggaagcccgggagattttcaaagacgctgagcggaccaaactgttttggattagctatagcgatggcgatcagtgcgcctccagcccttgccagaacgggggctcctgcaaagaccagctgcagagctatatctgcttctgcctgcctgcctttgaggggcgcaattgcgaaacccataaggatgaccagctgatttgcgtcaacgaaaacgggggctgcgagcagtactgcagcgatcacacgggcacgaagcggagctgccgctgccacgaaggctatagcctcctggctgacggggtgtcctgcacgcccacggtggaatacccttgcgggaagattcccattctagaaaagcggaacgctagcaaaccccagggccggatcgtcggcgggaaggtctgccctaagggggagtgcccctggcaggtcctgctcctggtcaacggggcccagctgtgcggcgggaccctcatcaataccatttgggtcgtgtccgccgctcactgcttcgataagattaagaattggcggaacctcatcgctgtgctcggcgaacacgatctgtccgagcatgacggggacgaacagtcccgccgggtggctcaggtcatcattccctccacctatgtgcctggcacgaccaatcacgatatcgctctgctccgcctccaccagcccgtcgtgctcaccgatcacgtcgtgcctctgtgcctgcctgagcggacctttagcgaacgcacgctggctttcgtccgctttagcctcgtgtccggctggggccagctgctcgaccggggcgctaccgctctcgagctgatggtgctcaacgtcccccggctgatgacccaggactgcctgcagcagtcccgcaaagtgggggactcccccaatatcacggagtatatgttttgcgctggctatagcgatggctccaaggatagctgcaagggggactccggcgggccccatgccacgcactatcgcgggacctggtacctcaccgggatcgtcagctggggccagggctgcgccacggtggggcactttggcgtctacacgcgcgtcagccagtacattgagtggctgcagaagctcatgcggagcgaaccccggcccggggtgctcctgcgggcccctttcccttgataaaagctt通過(guò)從pCINeo(Promega)克隆內(nèi)含子來(lái)制備用于對(duì)所得PCR產(chǎn)物的進(jìn)行克隆載體，該P(yáng)CR產(chǎn)物包含天然人凝血因子VII的表達(dá)盒。pCI-Neo的合成內(nèi)含子用上述標(biāo)準(zhǔn)PCR條件擴(kuò)增，引物如下
CBProFpr1745′-AGCTGGCTAGCCACIGGGCAGGTAAGTATCA-3′CBProFpr1755′-TGGCGGGATCCTTAAGAGCTGTAATTGAACT-3′產(chǎn)生一個(gè)322bp PCR片段。該片段用NheI和BamHI剪切，之后克隆到pCDNA3.1/HygR(來(lái)自Invitrogen)，產(chǎn)生PF#34。
克隆PF#34上BamHI和HindIII位點(diǎn)之間的天然人凝血因子VII的表達(dá)盒，得到質(zhì)粒PF#226。
實(shí)施例3構(gòu)建編碼人凝血因子VII的變體形式的表達(dá)盒，該變體具有一個(gè)另外的體內(nèi)糖基化位點(diǎn)用序列突出端延伸(SOE)PCR產(chǎn)生具有已取代的密碼子的人凝血因子變體開(kāi)放閱讀框的構(gòu)建體。在SOE-PCR中，F(xiàn)VII開(kāi)放閱讀框的N-末端部分和C-末端部分都在各自初級(jí)PCR中首先得到擴(kuò)增。
例如，為了將R315和V317密碼子改變?yōu)镹315和T317密碼子，在初級(jí)PCR中使用以下配對(duì)引物CBProFpr2165′-CTTAAGGATCCCGCCACCATGGTCAGCCAG-3′CBProFpr2295′-GGAGTCCCCGGTTTTGTTGGACTGCTGC-3′，以及CBProFpr2215′-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3′CBProFpr2285′-GCAGCAGTCCAACAAAACCGGGGACTCC-3′然后組合初級(jí)PCR產(chǎn)物，加入末端引物(CBProFpr216和CBProFpr221)，產(chǎn)生編碼期望的R315N+V317T FVII變體的二級(jí)全長(zhǎng)產(chǎn)物。該二級(jí)PCR產(chǎn)物用BamHI和HindIII剪切，再克隆到載體PF#34的BamHI和HindIII位點(diǎn)之間，產(chǎn)生PF#249。
此外，當(dāng)引入的突變與表達(dá)質(zhì)粒內(nèi)的唯一限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)足夠靠近時(shí)，可以構(gòu)建變體基因，所述構(gòu)建方法包含一個(gè)單一PCR步驟和后續(xù)的克隆。例如，在一個(gè)單一PCR反應(yīng)中使用以下PCR引物引入取代K143N+N145TCBProFpr2265′-CATTCTAGAAAACCGGACCGCTAGCAAACC-3′CBProFpr2215′-ACTTAAGCTTTTATCAAGGGA-3′然后通過(guò)使用限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)XbaI和HindIII克隆克隆所得PCR產(chǎn)物。
使用以上策略，可制備下述糖基化偶聯(lián)物，其酰胺分解活性的檢測(cè)如檢測(cè)低水平催化活性章節(jié)中所述。此外，對(duì)一些偶聯(lián)物進(jìn)行檢測(cè)凝血活性章節(jié)所述的一步凝血分析。所得結(jié)果編輯于下表中。
+可檢測(cè)的活性；-不可檢測(cè)的活性；nd未測(cè)定實(shí)施例4引入另外的近側(cè)(位于N-末端)糖基化位點(diǎn)以改進(jìn)糖基化位點(diǎn)的用途為了預(yù)防野生型人FVII的自身裂解，通過(guò)如上所述產(chǎn)生R315N和V317T取代，在位置315處引入一個(gè)糖基化位點(diǎn)，得到PF#249。
用Lipofactamine 2000轉(zhuǎn)染CHO K1細(xì)胞，獲得低水平的瞬時(shí)表達(dá)。利用酰胺分解試驗(yàn)，COASETFVII，分析24小時(shí)的瞬時(shí)上清，表明該變體是有活性的。在用400μg/ml潮霉素B選擇后，獲得穩(wěn)定克隆群。這些克隆以約0.2μg/ml的濃度表達(dá)R315N+V317T變體，在該濃度下可進(jìn)行蛋白印記分析，以確定引入的糖基化位點(diǎn)的利用程度。用蛋白印跡分析從穩(wěn)定克隆群的24小時(shí)上清，結(jié)果顯示在位置315處引入的糖基化位點(diǎn)被部分利用，約一半的完全加工后的分泌蛋白被糖基化。然而，如果145處的天然糖基化位點(diǎn)通過(guò)產(chǎn)生K143N+N145T取代轉(zhuǎn)移到143處，則蛋白印記顯示315位引入的糖基化位點(diǎn)被完全糖基化。
實(shí)施例5在HEK293細(xì)胞中表達(dá)FVII在T-25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)接種20％的匯合細(xì)胞系HEK293(ATCC#CRL-1573)，所用培養(yǎng)基為DMEM，高葡萄糖10％熱滅活的FCS(Gibco/BRL Cat#10091)，5μg/ml植醌，使細(xì)胞生長(zhǎng)直到匯合。匯合的單層細(xì)胞用1，2，5，10和20μg上述質(zhì)粒p226，以Lipofectamine 2000為轉(zhuǎn)染試劑(Life technologies)按照生產(chǎn)商的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)對(duì)培養(yǎng)液取樣。24小時(shí)瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)中FVII的濃度平均為0.15μg/ml。
隨后，給予細(xì)胞包含100μg/ml潮霉素B的選擇培養(yǎng)基。每3或4天更新一次培養(yǎng)基，經(jīng)3周選擇后，在用1μg質(zhì)粒DNA和2μg質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)瓶中，潮霉素抗性細(xì)胞已生長(zhǎng)至匯合。收集五個(gè)培養(yǎng)瓶中每個(gè)瓶的細(xì)胞并匯總。獲得表達(dá)天然人凝血因子VII的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子群，將其按照標(biāo)準(zhǔn)方法在液氮中冷凍。
實(shí)施例6制備穩(wěn)定表達(dá)FVII的HEK293細(xì)胞將一小瓶HEK293 PF#226轉(zhuǎn)染子解凍，并將細(xì)胞接種于含15ml DMEM高葡萄糖，10％FCS，植醌(5μg/ml)，100 U/l青霉素，100μg/l鏈霉素(其用于之后的所有實(shí)驗(yàn))的75cm2組織培養(yǎng)瓶中，生長(zhǎng)24小時(shí)。收集細(xì)胞，將其稀釋并以1/2細(xì)胞/孔的密度鋪96孔微滴定平板。12天后，約20-100個(gè)細(xì)胞的集落出現(xiàn)于孔中，將僅包含一個(gè)集落的那些孔進(jìn)行標(biāo)記。再生長(zhǎng)2天后，在所有孔中添加100μl培養(yǎng)基。兩天后，改換所有僅含一個(gè)集落的孔中的培養(yǎng)基。第一批集落3天后轉(zhuǎn)移到25cm2組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，根據(jù)匯合程度，在接下來(lái)的11天將集落轉(zhuǎn)移到到25cm2組織培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。當(dāng)在T-25組織培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)到匯合時(shí)，更換培養(yǎng)基，使克隆持續(xù)24小時(shí)將FVII分泌到生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后收集上清，用COASET FVII酰胺分解試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)因子VII的存在。發(fā)現(xiàn)有一個(gè)克隆，C18，表達(dá)29μg/ml的FVII。
實(shí)施例7FVII糖基化變體的表達(dá)，所述變體無(wú)酰胺分解活性，可抑制FVIIa的功能用于表達(dá)活性位點(diǎn)脊突變體R290N+A292T和G291N的表達(dá)質(zhì)粒，可基本按實(shí)施例3中所述方法構(gòu)建。
用酰胺分解試驗(yàn)COASETFVII(參見(jiàn)上述)，評(píng)估兩種FVII糖基化變體(R290N+A292T和G291N)抑制rFVIIa活性的能力。用Lipofectamin 2000將編碼R290N+A292T的質(zhì)粒PF#250和編碼G291N的質(zhì)粒PF#294轉(zhuǎn)染至接近匯合的經(jīng)血清培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞在37℃ 5％的CO2下溫育3小時(shí)，然后將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清培養(yǎng)基(DMEM，ITS-A，Ex-Cyte，植醌，P/S)。轉(zhuǎn)染的40小時(shí)后，收集培養(yǎng)液并離心使其澄清，以備分析。
用rFVIIa0.0125ng，0.025ng，0.05ng，0.075ng和0.1ng，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將兩種無(wú)活性糖基化變體R290N+A292T和G291N中的任一種的50μl未稀釋、2倍稀釋、5倍稀釋、10倍稀釋和50倍稀釋的培養(yǎng)液或模擬轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)液中加入0.025ng rFVIIa。在COASET FVII試驗(yàn)中，0.025ng的FVIIa相當(dāng)于OD405＝0.35(第一輪)及OD405＝0.26(第二輪)的信號(hào)。
將得到的結(jié)果編輯在下表中糖基化偶聯(lián)物稀釋倍數(shù) OD405標(biāo)準(zhǔn)0.35 0.26摹擬物 50 0.38 0.1925 0.31 0.1610 0.21 0.1550.22 0.1410.08 0.07R290N+A292T50 0.23 -25 0.12 -10 0.07 -50.04 -10.04 -G291N 50 - 0.1625 - 0.0810 - 0.065- 0.051- 0.04上述數(shù)據(jù)顯示糖基化偶聯(lián)物G291N和R290N+A292T抑制rFVIIa的功能。
實(shí)施例8FVII的純化和之后的活化野生型因子VII和其偶聯(lián)物的純化在4℃進(jìn)行。從表達(dá)所述偶聯(lián)物(或野生型FVII)的細(xì)胞中獲得的上清經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾(0.22μm)，在冷的超純(milli Q)水中稀釋兩倍。加入EDTA至5mM，將pH調(diào)整到8.6，導(dǎo)電率低于10mS/cm。將樣品裝載至已于4℃用10mM pH8.6的Tris平衡的Q-Sepharose快速流動(dòng)樹(shù)脂(Pharmacia)。在上樣后，用10mM Tris(pH8.6)，150mM NaCl洗滌層析柱，直到280nm的光吸收達(dá)到基線值。然后在10mM Tris(pH8.6)，100mMNaCl中平衡該層析柱。結(jié)合型偶聯(lián)物(或野生型FVII)用10mM Tris(pH8.6)，100mM NaCl，5mM CaCl2洗脫。匯集富含偶聯(lián)物(或野生型FVII)的級(jí)分，透析或使用Vivaspin濃縮裝置(Vivascience)進(jìn)行濃縮。
偶聯(lián)物(或野生型FVII)的自我活化通過(guò)在10mM Tris(pH7.8-8.6)，100mM NaCl，5mM CaCl2中濃縮并溫育所洗脫的蛋白獲得。
另外，在37℃下，10mM Tris(pH7.4-8.0)，100mM NaCl，5mM CaCl2中，與CNBr-活化的Sepharose偶聯(lián)的因子X(jué)a可活化所述偶聯(lián)物(或野生型FVII)。
將偶聯(lián)物(或野生型FVIIa)通過(guò)緩沖液交換轉(zhuǎn)移到含10mM CaCl2，50mM NaCl，3％甘露醇，0.05％Tween80，pH5.6緩沖的溶液中，過(guò)濾除菌并-80℃儲(chǔ)存。
實(shí)施例9FVII的N-末端PEG化在pH5.5的含10mM檸檬酸鈉，20mM氯化鈣，100mM氯化鈉的pH5.5緩沖液中，用M-PEG-CHO(M-ALD-5000，來(lái)自Shearwater)將因子FVII與分子量約5kDa的甲氧基聚乙二醇(mPEG)偶聯(lián)。M-PEG-CHO以過(guò)量50-100倍的摩爾濃度存在，所述蛋白濃度為0.2-0.5mg/ml。反應(yīng)以300-1500μl量分批進(jìn)行，每次在室溫下攪動(dòng)1小時(shí)，添加過(guò)量500-1000倍的NaBH3CN，繼續(xù)過(guò)夜溫育，室溫?cái)噭?dòng)。
PEG化的FVII經(jīng)緩沖液交換轉(zhuǎn)移到緩沖液A(10mM Tris，pH7.6)，并在4℃將其上樣至已在緩沖液A中平衡過(guò)的mono Q柱(Pharmacia)上。用從0-100％B的梯度(10mM Tris，(pH7.6)，500mM NaCl)以40倍柱體積洗脫結(jié)合型蛋白。
實(shí)施例10大鼠中藥物動(dòng)力學(xué)研究野生型FVII和本發(fā)明偶聯(lián)物均在1.3mg/ml甘氨酰-甘氨酸緩沖液(pH5.5，含1.5mg/ml CaCl2，30mg/ml甘露醇，0.1mg/ml polysorbat 80和3mg/ml NaCl)中配制。為了確定體內(nèi)半壽期，各制劑以一次性靜脈內(nèi)快速(bolus)注射給予S-D(Sprague-Dawley)大鼠。注射在約10秒鐘內(nèi)緩慢給予，以降低因高Ca++濃度造成的潛在的心衰危險(xiǎn)。從9只麻醉處死的大鼠中以適當(dāng)?shù)拈g隔，如注射后1分鐘，15分鐘，30分鐘，45分鐘和1小時(shí)，采集血樣。將所述血樣收集在含腺嘌呤(Sigma#C4431)及50μl檸檬酸-磷酸-葡萄糖溶液的lml試管中以避免凝血。采樣后立即將樣品儲(chǔ)存于約0℃直到離心，然后收集檸檬酸化血漿上清用于分析。樣品通過(guò)檢測(cè)凝血活性的方法章節(jié)中所述一步凝血試驗(yàn)進(jìn)行分析，然后計(jì)算半壽期。
序列表<110>馬克西根公司(Maxygen ApS)<120>凝血因子VII或VIIa樣分子<130>0212WO100<140><141><160>11<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>406<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220><221>M0D_RES<222>(6)..(35)<223>Xaa＝γ-羧基谷氨酸或谷氨酸<400>1Ala Asn Ala Phe Leu Xaa Xaa Leu Arg Pro Gly Ser Leu Xaa Arg Xaa1 5 10 15Cys Lys Xaa Xaa Gln Cys Ser Phe Xaa Xaa Ala Arg Xaa Ile Phe Lys20 25 30Asp Ala Xaa Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln50 55 60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65 70 75 80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly85 90 95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys100 105 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr115 120 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg130 135 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145 150 155 160Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln165 170 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala180 185 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu195 200 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg210 215 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn225 230 235 240His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp245 250 255His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr260 265 270Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu275 280 285Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg290 295 300Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser305 310 315 320Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser325 330 335Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr340 345 350Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys355 360 365Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile370 375 380Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu385 390 395 400Leu Arg Ala Pro Phe Pro405<210>2<211>1338<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(115)..(1335)<400>2atggtcagcc aggccctccg cctcctgtgc ctgctcctgg ggctgcaggg ctgcctggct 60gccgtcttcg tcacccagga ggaagcccat ggcgtcctgc atcgccggcg ccgg gcc117Ala1aat gcc ttt ctg gaa gag ctc cgc cct ggc tcc ctg gaa cgc gaa tgc165Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys5 10 15aaa gag gaa cag tgc agc ttt gag gaa gcc cgg gag att ttc aaa gac213Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp20 25 30gct gag cgg acc aaa ctg ttt tgg att agc tat agc gat ggc gat cag261Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln35 40 45tgc gcc tcc agc cct tgc cag aac ggg ggc tcc tgc aaa gac cag ctg309Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu50 55 60 65cag agc tat atc tgc ttc tgc ctg cct gcc ttt gag ggg cgc aat tgc357Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys70 75 80gaa acc cat aag gat 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Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys20 25 30Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp35 40 45Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln50 55 60Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn65 70 75 80Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly85 90 95Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys100 105 110Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr115 120 125Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg130 135 140Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro145 150 155 160Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln165 170 175Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala180 185 190His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu195 200 205Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg210 215 220Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr Val Pro 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960tagcctcgtg tccggctggg gccagctgct cgaccggggc gctaccgctc tcgagctgat 1020ggtgctcaac gtcccccggc tgatgaccca ggactgcctg cagcagtccc gcaaagtggg 1080ggactccccc aatatcacgg agtatatgtt ttgcgctggc tatagcgatg gctccaagga 1140tagctgcaag ggggactccg gcgggcccca tgccacgcac tatcgcggga cctggtacct 1200caccgggatc gtcagctggg gccagggctg cgccacggtg gggcactttg gcgtctacac 1260gcgcgtcagc cagtacattg agtggctgca gaagctcatg cggagcgaac cccggcccgg 1320ggtgctcctg cgggcccctt tcccttgata aaagctt 1357<210>5<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr174<400>5agctggctag ccactgggca ggtaagtatc a31<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr175<400>6tggcgggatc cttaagagct gtaattgaac t31<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr216<400>7cttaaggatc ccgccaccat ggtcagccag 30<210>8<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr229<400>8ggagtccccg gttttgttgg actgctgc28<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr221<400>9acttaagcttt tatcaaggg a 21<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr228<400>10gcagcagtcc aacaaaaccg gggactcc28<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物CBProFpr226<400>11cattctagaa aaccggaccg ctagcaaacc 30
權(quán)利要求
1.一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物包含至少一個(gè)與多肽共價(jià)連接的非多肽組分，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO1所示野生型FVII或FVIIa的氨基酸序列在于，其引入或去除了至少一個(gè)包含所述非多肽組分的連接基團(tuán)的氨基酸殘基。
2.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述連接基團(tuán)選自賴氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。
3.權(quán)利要求2的偶聯(lián)物，其中所述連接基團(tuán)是賴氨酸。
4.權(quán)利要求3的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO1在于，其去除了至少一個(gè)賴氨酸殘基。
5.權(quán)利要求4的偶聯(lián)物，其中所述賴氨酸殘基通過(guò)取代被去除。
6.權(quán)利要求4或5的偶聯(lián)物，其中所述被去除的賴氨酸殘基選自K18，K32，K38，K62，K85，K109，K137，K143，K148，K157，K161，K197，K199，K316，K337，K341，K389或其組合。
7.權(quán)利要求6的偶聯(lián)物，其中所述賴氨酸殘基選自K18，K62，K85，K197，K341或其組合。
8.權(quán)利要求5-7中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述賴氨酸殘基被選自下組的氨基酸殘基所取代R，Q，N或H。
9.權(quán)利要求8的偶聯(lián)物，其中所述賴氨酸殘基被R所取代。
10.權(quán)利要求3-9中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ ID NO1在于，其引入了至少一個(gè)賴氨酸殘基。
11.權(quán)利要求10的偶聯(lián)物，其中所述賴氨酸殘基通過(guò)取代被引入。
12.權(quán)利要求11的偶聯(lián)物，其中所述取代選自I42K，Y44K，L288K，D289K，R290K，G291K，A292K，T293K，Q313K，S314K，R315K，V317K，L390K，M391K，R392K，S393K，E394K，P395K，R396K，P397K，G398K，V399K，L400K，L401K，R402K，A403K，P404K，F(xiàn)405K或其組合。
13.權(quán)利要求12的偶聯(lián)物，其中所述取代選自R290K，R315K，R392K，R396K，R402K或其組合。
14.權(quán)利要求3-13中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中去除了至少一個(gè)賴氨酸殘基，并且引入了至少一個(gè)賴氨酸殘基。
15.權(quán)利要求2的偶聯(lián)物，其中所述連接基團(tuán)是半胱氨酸。
16.權(quán)利要求15的偶聯(lián)物，其中所述半胱氨酸殘基通過(guò)取代被引入。
17.權(quán)利要求16的偶聯(lián)物，其中所述取代選自I30C，K32C，D33C，A34C，T37C，K38C，W41C，Y44C，S45C，D46C，L141C，E142C，K143C，R144C，L288C，D289C，R290C，G291C，A292C，S314C，R315C，K316C，V317C，L390C，M391C，R392C，S393C，E394C，P395C，R396C，P397C，G398C，V399C，L401C，R402C，A403C，P404C或其組合。
18.權(quán)利要求17的偶聯(lián)物，其中所述取代選自K32C，Y44C，K143C，R290C，R315C，K341C，R392C，R396C，R402C或其組合。
19.權(quán)利要求2的偶聯(lián)物，其中所述連接基團(tuán)是天冬氨酸和/或谷氨酸。
20.權(quán)利要求19的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO1在于，其引入了至少一個(gè)天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基。
21.權(quán)利要求20的偶聯(lián)物，其中所述天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基通過(guò)取代被引入。
22.權(quán)利要求21的偶聯(lián)物，其中所述取代選自I30D/E，K32D/E，A34D/E，T37D/E，K38D/E，W41D/E，Y44D/E，S45D/E，D46C，L141D/E，E142D/E，K143D/E，R144D/E，L288D/E，R290D/E，G291D/E，A292D/E，Q313D/E，S314D/E，R315D/E，K316D/E，V317D/E，L390D/E，M391D/E，R392D/E，S393D/E，P395D/E，R396D/E，P397D/E，G398D/E，V399D/E，L401D/E，R402D/E，A403D/E，P404D/E或其組合。
23.權(quán)利要求22的偶聯(lián)物，其中所述取代選自K32D/E，Y44D/E，K143D/E，R290D/E，R315D/E，K341D/E，R392D/E，R396D/E，R402D/E或其組合。
24.權(quán)利要求19的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO1在于，其去除了至少一個(gè)天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基。
25.權(quán)利要求24的偶聯(lián)物，其中所述天冬氨酸殘基和/或谷氨酸殘基通過(guò)取代被去除。
26.權(quán)利要求25的偶聯(lián)物，其中所述取代選自D33，D46，D48，E77，E82，D86，D87，E94，E99，D104，E116，D123，E132，E142，E163，D196，E210，D212，E215，D217，D219，E220，D256，E265，E270，D289，E296，D309，D319，E325，D334，D338，D343，E385，E394或其組合。
27.權(quán)利要求19-26中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中引入了至少一個(gè)天冬氨酸和/或谷氨酸殘基，并且去除了至少一個(gè)天冬氨酸和/或谷氨酸殘基。
28.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述非多肽組分是聚合物分子。
29.權(quán)利要求28的偶聯(lián)物，其中所述聚合物分子選自天然的或合成的均聚物或雜聚物。
30.權(quán)利要求29的偶聯(lián)物，其中所述聚合物分子是合成的均聚物或雜聚物，其選自線性的和分支的聚乙二醇，聚乙烯醇(PVA)，聚羧酸和聚(乙烯吡咯烷酮)。
31.權(quán)利要求30的偶聯(lián)物，所述聚合物是線性的或分支的聚乙二醇。
32.權(quán)利要求31的偶聯(lián)物，其中所述聚乙二醇的分子量約為300-100000Da。
33.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述多肽與SEQ ID NO1所示氨基酸序列有1-15個(gè)氨基酸殘基的差異。
34.權(quán)利要求1的偶聯(lián)物，其中所述非多肽組分是糖組分，并且其中所述連接基團(tuán)是糖組分的連接基團(tuán)。
35.權(quán)利要求34的偶聯(lián)物，其中所述連接基團(tuán)是糖基化位點(diǎn)。
36.權(quán)利要求35的偶聯(lián)物，其中引入了至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)。
37.權(quán)利要求35的偶聯(lián)物，其中去除了至少一個(gè)天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)。
38.權(quán)利要求36-37中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中引入了至少一個(gè)非天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)，并且去除了至少一個(gè)天然產(chǎn)生的糖基化位點(diǎn)。
39.權(quán)利要求36的偶聯(lián)物，其中所述引入的糖基化位點(diǎn)是體內(nèi)糖基化位點(diǎn)。
40.權(quán)利要求39的偶聯(lián)物，其中所述糖基化位點(diǎn)是體內(nèi)的O-糖基化位點(diǎn)。
41.權(quán)利要求39的偶聯(lián)物，其中所述糖基化位點(diǎn)是體內(nèi)的N-糖基化位點(diǎn)。
42.權(quán)利要求41的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO1在于，至少一個(gè)天然產(chǎn)生的N-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何氨基酸，X是除絲氨酸和蘇氨酸外的任何氨基酸。
43.權(quán)利要求41的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO1在于，SEQ ID NO1中存在的至少一個(gè)天然產(chǎn)生的X-X′-S或X-X′-T序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何氨基酸，X是除天冬酰胺外的任何氨基酸。
44.權(quán)利要求42或43的偶聯(lián)物，其中所述取代選自F4S/T，P10N，Q21N，W41N，S43N，A51N，G58N，L65N，G59S/T，E82S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，G179N，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，I230N，P231N，P236N，G237N，V253N，E265N，T267N，E270N，R277N，L280N，G291N，P303S/T，L305N，Q312N，G318N，G331N，D334N，K337N，G342N，H348N，R353N，Y357N，I361N，V376N，R379N，M391N或其組合。
45.權(quán)利要求44的偶聯(lián)物，其中所述取代選自F4S/T，P10N，Q21N，W41N，A51N，G58N，G59S/T，N95S/T，G97S/T，Y101N，D104N，T106N，K109N，G117N，G124N，S126N，T128N，A175S/T，I186S/T，V188N，R202S/T，I205S/T，D212N，E220N，V253N，E265N，T267N，E270N，L280N，G291N，P303S/T，G318N，G331N，D334N，K337N，R353N，Y357N，M391N或其組合。
46.權(quán)利要求41的偶聯(lián)物，其中所述多肽的氨基酸序列不同于SEQ IDNO1在于，SEQ ID NO1中存在的至少一個(gè)天然產(chǎn)生的K-X′-X或R-X′-X序列被N-X′-S或N-X′-T序列所取代，其中X′是除脯氨酸外的任何氨基酸，X是除絲氨酸和蘇氨酸外的任何氨基酸。
47.權(quán)利要求46的偶聯(lián)物，其中所述取代選自K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，K62N+Q64S/T，K85N+D87S/T，K137N+P139S/T，K143N+N145S/T，K148N+Q149S/T，K161N+E163S/T，K197N+K199S/T，K199N+W201S/T，K316N+G318S/T，K337N，K341N+D343S/T，K389N+M391S/T或其組合。
48.權(quán)利要求41的偶聯(lián)物，其中所述非天然產(chǎn)生的體內(nèi)N-糖基化位點(diǎn)是通過(guò)取代引入的，取代的位置選自28-48，139-147，286-294，311-319，338-345，388-406。
49.權(quán)利要求48的偶聯(lián)物，其中所述取代選自K32N+A34ST，F(xiàn)31N+D33S/T，I30N+K32S/T，A34N+R36S/T，K38N+F40S/T，T37N+L39S/T，R36N+K38S/T，L39N+W41S/T，F(xiàn)40N+I42S/T，W41N，I42N+Y44S/T，S43N，Y44N+D46S/T，S45N+G47S/T，D46N+D48S/T，G47N+Q49S/T，K143N+N145S/T，E142N+R144S/T，L141N+K143S/T，I140N+E142S/T，R144N+A146S/T，A146N+K148S/T，S147N+P149S/T，R290N+A292S/T，D289N+G291S/T，L288N+R290S/T，L287N+D289S/T，G291N，A292N+A294S/T，T293N+L295S/T，R315N+V317S/T，S314N+K316S/T，Q313N+R315S/T，Q312N，K316N+G318S/T，V317N+D319S/T，G318N，K341N+D343S/T，S339N+K341S/T，G342N，D343N+G345S/T，R392N+E394S/T，M391N，L390N+R392S/T，K389N+M391S/T，S393N+P395S/T，E394N+R396S/T，P395N+P397S/T，R396N+G398S/T，P397N+V399S/T，G398N+L400S/T，V399N+L401S/T，L400N+R402S/T，L401N+A403S/T，R402N+P404S/T，A403N+F405S/T，P404N+P406S/T，K143N+N145S/T+R315N+V317S/T或其組合。
50.權(quán)利要求49的偶聯(lián)物，其中所述取代選自K32N+A34S/T，K38N+F40S/T，Y44N+D46S/T，K143N+N145S/T，R290N+A292S/T，R315N+V317S/T，K341N+D343S/T，R392N+E394S/T，R396N+G398S/T，R402N+P404S/T，K143N+N145S/T+R315N+V317S/T或其組合。
51.權(quán)利要求50的偶聯(lián)物，其中所述取代選自K32N+A34T，K38N+F40T，Y44N+D46T，K143N+N145T，R290N+A292T，R315N+V317T，K341N+D343T，R392N+E394T，R396N+G398T，R402N+P404T，K143N+N145T+R315N+V317T或其組合。
52.權(quán)利要求34-51中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述多肽與SEQ ID NO1所示氨基酸序列有1-15個(gè)氨基酸殘基的差異。
53.權(quán)利要求39-52中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中引入了兩個(gè)或多個(gè)體內(nèi)糖基化位點(diǎn)。
54.權(quán)利要求34-53中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物進(jìn)一步包含至少一個(gè)與所述多肽的氨基酸殘基共價(jià)連接的非多肽組分，其中所述非多肽組分與糖組分不同。
55.權(quán)利要求54的偶聯(lián)物，其中所述非多肽組分是權(quán)利要求29-32中任一項(xiàng)定義的聚合物分子。
56.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物的分子量至少為67kDa。
57.上述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的偶聯(lián)物，其中所述偶聯(lián)物已失活。
58.一種多肽，其具有權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)定義的氨基酸序列。
59.一種核苷酸序列，其編碼權(quán)利要求58的多肽。
60.一種表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求59的核苷酸序列。
61.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求59的核苷酸序列或權(quán)利要求60的表達(dá)載體。
62.權(quán)利要求61的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是可進(jìn)行體內(nèi)糖基化的γ-羧基化細(xì)胞。
63.一種制備權(quán)利要求1-57中任一項(xiàng)定義的偶聯(lián)物的方法，該方法包括在有益于所述多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求61或62所定義的宿主細(xì)胞，并回收所述多肽，其中a)所述多肽包含至少一個(gè)N-或O-糖基化位點(diǎn)，并且所述宿主細(xì)胞是可進(jìn)行體內(nèi)糖基化的真核宿主細(xì)胞，和/或b)使所述多肽在體外與一個(gè)非多肽組分偶聯(lián)。
64.一種組合物，其包含權(quán)利要求1-57中任一項(xiàng)所定義的偶聯(lián)物和一種可藥用的載體或賦形劑。
65.權(quán)利要求1-57中任一項(xiàng)所定義的偶聯(lián)物，所述偶聯(lián)物用做藥物。
66.權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)所定義的偶聯(lián)物在制備用于治療哺乳動(dòng)物FVIIa/TF相關(guān)疾病的藥物中的用途。
67.權(quán)利要求66的用途，其中FVIIa/TF相關(guān)疾病選自需要加強(qiáng)凝血的疾病。
68.權(quán)利要求57所定義的失活的偶聯(lián)物在制備用于治療哺乳動(dòng)物FVIIa/TF相關(guān)疾病的藥物中的用途。
69.權(quán)利要求68的用途，其中FVIIa/TF相關(guān)疾病選自需要減弱凝血的疾病。
70.一種治療具有FVIIa/TF相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物的方法，包括以有效劑量給予有需求的哺乳動(dòng)物以權(quán)利要求1-56中任一項(xiàng)所定義的偶聯(lián)物。
71.權(quán)利要求70的方法，其中所述疾病選自需要加強(qiáng)凝血的疾病。
72.一種治療具有FVIIa/TF相關(guān)疾病的哺乳動(dòng)物的方法，包括以有效劑量給予有需求的哺乳動(dòng)物以權(quán)利要求57所定義的偶聯(lián)物。
73.權(quán)利要求72的方法，其中所述疾病選自需要減弱凝血的疾病。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的凝血因子VII(FVII)或凝血因子VIIa(FVIIa)的多肽偶聯(lián)物，其制備及在其治療方面的用途，特別是對(duì)多種凝血相關(guān)疾病治療的用途。這些新的多肽偶聯(lián)物包含至少一個(gè)共價(jià)偶聯(lián)于多肽上的非多肽組分，其中該多肽的氨基酸序列與野生型FVII或FVIIa不同在于其引入或去除了至少一個(gè)包含所述非多肽組分連接基團(tuán)的氨基酸殘基。本發(fā)明的偶聯(lián)物與商品化的rFVIIa相比有一種或多種改進(jìn)的特性，包括功能性體內(nèi)半壽期延長(zhǎng)和/或血漿半壽期延長(zhǎng)，和/或生物利用率增加和/或?qū)Φ鞍酌附獾拿舾行越档汀?br> 文檔編號(hào)C07K14/745GK1400910SQ01804864
公開(kāi)日2003年3月5日 申請(qǐng)日期2001年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年2月11日
發(fā)明者金·V·安德森, 安德斯·H·佩德森, 克勞斯·博尼斯 申請(qǐng)人:馬克西根公司, 馬克西根控股公司