專利名稱：一種能引發(fā)癌細胞凋亡的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能引發(fā)癌細胞凋亡的單克隆抗體，此單抗可以作為抗癌生物制劑用于科研和臨床。
目前，全世界抗癌藥物以化學(xué)合成或植物提取物為多。其療效均不能達到徹底根治癌癥的水平。放射性化學(xué)療法雖能達到對癌細胞一定的殺傷作用，但仍不能完全有效的控制癌細胞的轉(zhuǎn)移和擴散。在1990年代中期美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)TRAIL(腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)細胞凋亡配體)具有廣泛快速誘殺各種腫瘤細胞的作用，但對正常細胞不具有強殺傷性而引起世界各國科學(xué)家和藥廠的廣泛關(guān)注。TRAIL是一種蛋白質(zhì)，屬于與TNF相關(guān)的誘導(dǎo)細胞凋亡的配體，它可以引發(fā)許多不同類型癌癥細胞的凋亡。細胞膜上有4種TRAIL的受體，其中兩種受體具有細胞傳導(dǎo)死亡信號鏈。TRAIL作為抗癌生物制劑在美國已進入臨床實驗階段。
本發(fā)明涉及單克隆抗體是TRAIL的一個受體的抗體(DR5/R2抗體)。它具有與TRAIL類似的具有快速誘導(dǎo)多種癌癥細胞死亡的作用。本發(fā)明涉及單克隆抗體經(jīng)過與TRAIL的一個受體R2結(jié)合，引發(fā)細胞內(nèi)膜死亡功能區(qū)激活集結(jié)FADD，F(xiàn)ADD與caspase-8結(jié)合，從而完成信號傳遞導(dǎo)致細胞核溶，最終導(dǎo)致細胞不能進行正常細胞生長代謝而死亡。此抗體不但可以引發(fā)對TRAIL敏感的人癌細胞的凋亡，在與TRAIL同時使用時可以引發(fā)對TRAIL不敏感人癌細胞的調(diào)亡，而且此抗體不引發(fā)正常人組織細胞的凋亡(即對正常細胞沒有毒副作用)。本發(fā)明涉及單克隆抗體的新潁性在于其引發(fā)癌細胞的凋亡有專一性和特異性，且能從根本殺傷癌細胞。本發(fā)明的單克隆抗體到目前為止，在國內(nèi)沒有發(fā)明報導(dǎo)。而這些重要發(fā)現(xiàn)是發(fā)明人于2000年4月在美國首次公開報導(dǎo)，在此之前從未有人在美國和中國報導(dǎo)過。作為一種生物制劑，此單克隆抗體可以用于對TRAIL及其受體DR5的研究，其人源化的單克隆抗體可以在臨床上作為抗癌藥物，治療癌癥。并可與TRAIL共同使用，增強對TRAIL不敏感的病人的抗癌功效與應(yīng)用范圍。本發(fā)明的內(nèi)容及采用的技術(shù)方法單克隆抗體的制備10-100微克純化的含有人TRAIL死亡受體5(DR5)細胞外膜功能區(qū)和人IgG1恒定區(qū)(huTRAIL-R)的DR5-hIgG1溶合蛋白皮下注射，或腹腔內(nèi)注射到BALB/c小鼠內(nèi)。10-12天后再注射一次，至此小鼠每隔一周注射一次，定期抽血。用ELISA的方法檢測血清中所含的DR5-IgG1抗體含量，并檢測抗體的滴度。結(jié)果陽性的小鼠從靜脈再注射一次加強免疫。4-5天后取出小鼠脾臟。用此脾細胞與小鼠的骨髓瘤細胞NS1溶合產(chǎn)生雜交瘤，并在DMEM/HAT，DMEM/HT選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以阻止非溶合細胞脾細胞以及骨髓瘤細胞的生長。上清液用ELISA的方法檢測與DR5-hIgG1的結(jié)合功能，并用Western Blot的方法檢測與huTRAIL-R2Fc的反應(yīng)。能與huTRAIL-R2Fc結(jié)合但不與hIgG1結(jié)合的抗體的雜交瘤用腹膜內(nèi)注射法注射到同源BALB/c小鼠中去產(chǎn)生腹水。此腹水含有高濃度抗DR5/R2的單克隆抗體。另外雜交瘤細胞也可以用培養(yǎng)皿在體外人工培養(yǎng)。所得單克隆抗體可以用protein A(旦白質(zhì)A)，或TRAIL-R(TRAIL的受體)親和層析法純化。本發(fā)明的應(yīng)用本發(fā)明單克隆抗體可以應(yīng)用于1.抗癌藥物本發(fā)明人源化的單克隆抗體可以用于治療除腦以外的主要癌癥，如卵巢癌、肺癌、肝癌、直腸癌、子宮頸癌、皮膚癌、睪丸癌、甲狀腺癌、膀胱癌、胃癌、咽喉癌、胰腺癌、乳腺癌等。2.TRAIL的增效劑本發(fā)明人源化的單克隆抗體可以與TRAIL同時應(yīng)用于治療癌癥病人，可以增強與擴大TRAIL的療效與應(yīng)用范圍。3.臨床早期檢測組織細胞癌變DR5基因廣泛存在于人體組織細胞(除腦外)。但在正常細胞中，用本發(fā)明的單克隆抗體檢測不出DR5蛋白。一旦細胞癌變后，DR5蛋白則可以被檢測出。故DR5蛋白的表達與否可以作為一個臨床檢驗生物標(biāo)記用于檢測細胞是否有癌變。故臨床上可以用Dot Blot，Western Blot對從人體組織中提取的蛋白與本發(fā)明單克隆抗體進行雜交，或用免疫組化的方法用此單抗對人體組織切片進行DR5蛋白檢測。陽性結(jié)果，則表明人體組織已有癌變。4.科研本發(fā)明的單克隆抗體可以用于對人體細胞膜上的TRAIL死亡受體DR5的功能，通過其通道傳遞死亡信號的原理；以及TRAIL的引發(fā)癌細胞凋亡的原理和通道的研究。
權(quán)利要求
1.一種能引發(fā)癌細胞凋亡的單克隆抗體，是TRAIL的一個受體的抗體(DR5/R2抗體)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征是經(jīng)用人TRAIL與人細胞膜外死亡受體功能區(qū)融和蛋白免疫小鼠，后用其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞溶合產(chǎn)生雜交瘤。再經(jīng)篩選與功能測定選出所需雜交瘤。此雜交瘤可用體內(nèi)或體外的方法大量制備單克隆抗體，最后用親和法將單抗純化。它具有快速誘發(fā)多種癌細胞死亡的作用且對正常細胞無毒副作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融和蛋白含有人TRAIL死亡受體2(DR5/R2)細胞外膜功能區(qū)和人IgG1恒定區(qū)(huTRAIL-R)的DR5-hIgG1溶合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交瘤是用DR5-hIgG1溶合蛋白免疫后的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞NS1溶合產(chǎn)生的雜交瘤。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化的單克隆抗體以及其人源化后的人源化單克隆抗體和能與之結(jié)和的物質(zhì)，如抗原，受體，栽有任何標(biāo)記性物質(zhì)的本發(fā)明的單抗和人源化的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化的單克隆抗體及其人源化的單克隆抗體的作用范圍是但不限于科研，生物制藥，臨床診斷。
全文摘要
一種能引發(fā)癌細胞凋亡的單克隆抗體,它是經(jīng)用人TRAIL與人細胞膜外死亡受體功能區(qū)融和蛋白免疫小鼠,后用其脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞溶合產(chǎn)生雜交瘤。再經(jīng)篩選與功能測定選出所需雜交瘤。此雜交瘤可用體內(nèi)或體外的方法大量制備單克隆抗體,最后用親和法將單抗純化。此單抗可以用于研究TRAIL引發(fā)癌細胞凋亡的原理和通道及其死亡受體DR5的功能;可以用于臨床早期檢測組織細胞癌變;可以應(yīng)用于抗癌藥物。
文檔編號C07K16/18GK1388135SQ0113454
公開日2003年1月1日 申請日期2001年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月7日
發(fā)明者林琳, 孟路 申請人:林琳, 孟路