本發(fā)明屬于利用微生物處理礦產(chǎn)資源技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種將磷礦石中磷轉(zhuǎn)化成可溶磷的生物浸出方法。
背景技術(shù)：
磷是重要的化工原料，也是農(nóng)作物生長的必要元素，工業(yè)用磷必須大量從磷礦中提取，雖然我國的磷礦資源比較豐富，已探明的資源儲量132.4億t，但平均品位只有16.95％(以P2O5計(jì))，而目前工業(yè)上制取磷酸要求磷礦石含P2O5≥28％。所以如何充分利用低品位磷礦資源，已成為一項(xiàng)具有可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略意義的任務(wù)。
隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，在濕法生物冶金工業(yè)中，采用細(xì)菌浸出低品位金屬硫化礦物得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)于微生物浸磷礦已有很多文章報(bào)道,就浸磷微生物來說，可分為化能自養(yǎng)和異養(yǎng)菌兩種類型，異養(yǎng)型如根瘤菌、假單胞菌等,可以利用葡萄糖等有機(jī)物生長，產(chǎn)生有機(jī)酸分解磷礦，Ghosh和Banik報(bào)道用黑曲霉浸出磷酸鹽巖，在最佳條件下可以達(dá)到45％-50％的浸出率。自養(yǎng)型細(xì)菌則不需要外加有機(jī)碳源，它們可以利用空氣中的CO2作為生長所需的碳源，所以在目前的生物浸礦領(lǐng)域大量采用，這其中尤其以嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(簡稱At.f菌)和嗜酸氧化硫硫桿菌(簡稱At.t菌)最為常見。然而，上述方法具有下列缺陷:(1)浸出周期長達(dá)一月甚至數(shù)月,成本高，接種量普遍在10％至20％，需要額外加入磷化合物作為培養(yǎng)基，礦石粒度細(xì)，礦漿濃度很低，資源利用率低；(2)異養(yǎng)菌代謝所產(chǎn)生的有機(jī)酸酸性不強(qiáng)，分解磷礦速度緩慢，而且需要添加有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)作為生長所需的碳源，工業(yè)應(yīng)用受限；(3)一些解磷能力強(qiáng)的真菌存在原料生產(chǎn)成本高，菌株容易失活的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種成本低、有效磷浸出率高的難溶性磷酸鹽生物浸出方法。
本發(fā)明提供的一種難溶性磷酸鹽的生物浸出方法，包括下述步驟：
難溶磷酸鹽原料粉碎過2mm篩備用；
菌株篩選：將芽孢桿菌菌株通過溶磷圈培養(yǎng)基和液體搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行定性和定量測定，篩選出具有溶磷能力強(qiáng)的高效菌株；
菌種培養(yǎng)：在100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中接入2-8ml篩選出的高效菌株，在25-35℃、100-150r/min的條件下培養(yǎng)3-5d作為菌種；
水溶性磷浸出：在清水中加入10％蔗糖作為營養(yǎng)源，再加入1-7％的難溶磷酸鹽原料，接入培養(yǎng)的菌種2-8％，在25-35℃、120-160r/min培養(yǎng)7-10d，然后分離固體殘?jiān)团囵B(yǎng)液，直至分離出的培養(yǎng)液中水溶性磷含量≥100mg/L即可。
優(yōu)選地，所述芽孢桿菌菌株為硅酸鹽細(xì)菌、磷細(xì)菌中的至少一種。
優(yōu)選地，所述溶磷圈培養(yǎng)基包括下述重量份的原料：葡萄糖5-15g，硫酸銨0.2-1g，氯化鉀0.2-0.5g，難溶性磷酸鹽5-15g，瓊脂16-18g，溶磷圈培養(yǎng)溫度為30-37℃，時(shí)間為5-8天。
優(yōu)選地，所述液體搖瓶培養(yǎng)基包括下述重量份的原料：葡萄糖5-15g，硫酸銨0.2-1g，難溶性磷酸鹽25-35g/L，搖瓶培養(yǎng)溫度為25-35℃，時(shí)間為5-8天。
優(yōu)選地，所述水溶性磷浸出步驟中，固體殘?jiān)芍貜?fù)浸出利用，直至連續(xù)兩次浸出液中水溶性磷含量相差低于10％為止。
本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有下述技術(shù)效果：
1、本發(fā)明選用的菌種不僅具有高效的溶磷功能，可提高磷礦石的磷轉(zhuǎn)化率，使中低品位磷礦中的有益元素得到有效利用，同時(shí)還可盤活土壤，減少競爭病原微生物的位點(diǎn)和營養(yǎng)物質(zhì)降低植物病害發(fā)生，增加了土壤有益微生物含量， 可提高植物對磷元素的利用率。
2、本發(fā)明步驟中，菌種培養(yǎng)液和浸礦培養(yǎng)液都不需要用酸調(diào)節(jié)pH，浸出液pH與土壤pH相近，可直接可用，且浸出過程使在低溫環(huán)境下進(jìn)行，有效保證了菌株的成活率。
3、本發(fā)明采用的難溶性磷原料可重復(fù)利用，可節(jié)約原料，提高資源的利用率。
4、本發(fā)明成本遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)浸出方法，如2％的接種量，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有的10％～20％的量，降低了大量昂貴藥劑配置培養(yǎng)液的成本，且該浸礦體系中不用額外加入磷化合物，另外，較大的顆粒度(2mm)，有利于磨樣成本的降低。
5、本發(fā)明采用較高的礦漿濃度提高了處理效率，不排放任何的廢液、廢渣和有毒有害氣體，從而實(shí)現(xiàn)清潔生產(chǎn)，有利于環(huán)境保護(hù)。
具體實(shí)施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
本發(fā)明提供的難溶性磷酸鹽的生物浸出方法，包括下述步驟：
S1難溶磷酸鹽原料粉碎過2mm篩備用，難溶磷酸鹽原料包括各種含磷礦物和土壤，其總磷含量約15-25％；
S2菌株篩選：將芽孢桿菌菌株通過溶磷圈和液體搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行定性和定量測定，篩選出具有溶磷能力強(qiáng)的高效菌株；
本步驟S2中，所述芽孢桿菌菌株為硅酸鹽細(xì)菌、磷細(xì)菌中的至少一種。
所選用的菌種中，硅酸鹽細(xì)菌由于其生長代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸類物質(zhì)，能夠?qū)⑼寥乐泻浀拈L石、云母、磷灰石、磷礦粉等礦物的難溶性鉀及磷溶解出來為作物和菌體本身利用，同時(shí)，細(xì)菌可在土壤中繁殖，改善植物的營養(yǎng)條件，抑制其它病原菌的生長，這些都對作物生長、產(chǎn)量提高及品質(zhì)改善有良好作用， 所述硅酸鹽細(xì)菌可選用膠凍樣芽孢桿菌和土壤芽孢桿菌，優(yōu)選膠凍樣芽孢桿菌，其可產(chǎn)生有機(jī)酸、莢膜多糖等代謝產(chǎn)物，破壞硅鋁酸鹽的晶格結(jié)構(gòu)、難溶性磷化合物等，分解釋放出可溶的磷鉀元素及鈣、硫、鎂、鐵、鋅、鉬、錳等中微量元素，施用于土壤后可增進(jìn)土壤肥力，為作物提供可吸收利用的營養(yǎng)元素，同時(shí)可促進(jìn)作物營養(yǎng)吸收和生長代謝，誘導(dǎo)作物增強(qiáng)抗性，增強(qiáng)抗寒、抗旱、抗病和抗逆能力，改善產(chǎn)品品質(zhì)。而且還可在作物根部形成有益菌群，有效抑制土壤有害和致病微生物的繁殖，從而減少部分農(nóng)藥的使用，減輕農(nóng)藥污染。磷細(xì)菌是溶解磷酸化合物能力較強(qiáng)的細(xì)菌，同時(shí)還可使土壤中不能被植物利用的磷化物轉(zhuǎn)變成可被利用的可溶性磷化物，可選用巨大芽孢桿菌或無色桿菌、假單胞菌等，優(yōu)選巨大芽孢桿菌，其能夠?qū)⒘姿猁}原料中固化的磷轉(zhuǎn)化成植物吸收利用的磷，施用于土壤后還可有效提高土壤中磷的吸收率，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，減輕病害，降低農(nóng)藥殘留。可以理解地，上述菌種可用同菌屬具有相同功能的菌株替代。
本步驟S2中，溶磷圈培養(yǎng)基按下述重量份配置：葡萄糖5-15g，硫酸銨0.2-1g，氯化鉀0.2-0.5g，難溶性磷酸鹽5-15g，瓊脂16-18g，水1L。溶磷圈培養(yǎng)溫度為30-37℃，時(shí)間為5-8天。
液體搖瓶培養(yǎng)基按下述重量份配置：葡萄糖5-15g，硫酸銨0.2-1g，難溶性磷酸鹽25-35g/L，水1L。搖瓶培養(yǎng)溫度為25-35℃，時(shí)間為5-8天。
上述原料中，瓊脂為常用的細(xì)菌培養(yǎng)基基體；葡萄糖在生物學(xué)領(lǐng)域具有重要地位，是活細(xì)胞的能量來源和新陳代謝中間產(chǎn)物，即生物的主要供能物質(zhì)，一般用作生物培養(yǎng)基，同時(shí)也是金屬的還原劑。所述硫酸銨具有優(yōu)良的物理性質(zhì)和化學(xué)穩(wěn)定性，可采用離子交換形式把礦土中的稀土元素交換出來，同時(shí)硫酸銨也是很好的生物性肥料，在土壤中的反應(yīng)呈酸性，適用于一般土壤和作物，能使枝葉生長旺盛，提高果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量，增強(qiáng)作物對災(zāi)害的抵抗能力，還可以中和土壤酸性，補(bǔ)充鈣素和增強(qiáng)土壤的緩沖能力。氯化鉀是常用的電解質(zhì)平衡調(diào)節(jié)劑，是制造鉀鹽的基本原料，施用于農(nóng)田時(shí)，能平衡土壤水分。
本步驟以瓊脂、葡萄糖為培養(yǎng)基基體，佐以硫酸銨或/和氯化鉀，可在代謝過程中與磷酸鹽中的磷、鉀元素及鈣、鎂、鐵等離子交換而使上述有益元素釋放出來。
S3菌種培養(yǎng)：在100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接入2-8ml由步驟S2篩選出的高效菌株，在25-35℃、100-150r/min的條件下培養(yǎng)3-5d作為菌種。
本步驟S3中，以營養(yǎng)肉湯作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有細(xì)菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)物質(zhì)，有利于各細(xì)菌的生長，同時(shí)佐以芽孢桿菌菌株，這些有益菌不僅具有高效的溶磷功能，而且這些桿菌本身就具有盤活土壤功能，施用于土壤中增加了土壤有益微生物的含量，抑制其它病原菌的生長，降低植物病害發(fā)生，還可分解釋放出可溶的磷鉀元素及中微量元素，提高植物對磷元素的利用率。
S4水溶性磷浸出：在清水中加入10％蔗糖作為營養(yǎng)源，再加入1-7％的難溶磷酸鹽原料，轉(zhuǎn)入步驟S3培養(yǎng)的菌種2-8％，在25-35℃、120-160r/min培養(yǎng)7-10d，然后分離固體殘?jiān)团囵B(yǎng)液，直至分離出的培養(yǎng)液中水溶性磷含量≥100mg/L即可。
本步驟S4的固體殘?jiān)梢灾貜?fù)使用，直至連續(xù)兩次浸出液中水溶性磷含量相差低于10％為止。分離出的培養(yǎng)液中水溶性磷可以直接澆灌作物，也可以通過濃縮后生產(chǎn)微生物磷肥。
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳述。
實(shí)施例一：
S1、選取中低品位磷礦石(總磷含量約18％)，磨粉，過2mm篩備用；
S2、菌株篩選：
S21、制備溶磷圈培養(yǎng)基：稱取葡萄糖10g、硫酸銨0.5g、氯化鉀0.3g、難溶性磷酸鹽10g、瓊脂17g加入水1L，混合，在溫度為30℃左右的條件下培養(yǎng)7天；
S22、制備液體搖瓶培養(yǎng)基：稱取葡萄糖10g、硫酸銨0.5g、難溶性磷酸鹽30g/L加入水1L，搖瓶培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，培養(yǎng)時(shí)間7天。
S23、將膠凍樣芽孢桿菌菌株加入上述培養(yǎng)基溶磷圈和液體搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行定性和定量測定，篩選出具有溶磷能力強(qiáng)的高效菌株。
本步驟中，溶磷圈定性試驗(yàn)具體為：
(1)菌懸液制備：
將上述所選的菌株接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，接種后培養(yǎng)24h，然后將細(xì)菌刮入100mL無菌水中，與漩渦混合器中混合30s，制備成菌懸液，菌數(shù)約為108cfu/mL。
(2)分別吸取上述細(xì)菌懸液20uL接種于溶磷圈培養(yǎng)基培養(yǎng)皿中心，設(shè)3次重復(fù)，共24個平板。置28℃倒置培養(yǎng)7天，每天觀察溶磷圈與菌落的直徑。溶磷圈直徑(D)和菌落生長直徑(d)的比值(D/d)是表征磷鉀菌相對溶磷能力的一個指標(biāo)。
液體搖瓶培養(yǎng)定量試驗(yàn)具體為：
(1)缺磷土壤培養(yǎng)基：蔗糖10g，硫酸銨1.0g，去離子水1L，pH7.2-7.4。
(2)在250ml三角瓶中裝入50ml-100ml已滅菌的缺磷土壤培養(yǎng)基，每瓶裝土壤3.0g，分別接種1-2mL上述菌懸液，30℃160r/min，培養(yǎng)7d。培養(yǎng)液8000r/min，4℃離心10min，取上清液測定有效磷和pH值。設(shè)不接菌對照，重復(fù)3次。此次復(fù)篩選擇的菌株為初篩D/d值較大的2-3個菌株。
S3、菌種培養(yǎng)：
在100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接入4ml由步驟S2篩選出的高效膠凍樣芽孢桿菌菌株，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩，轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)4d作為菌種；
S4、用清水為水源，加入10％蔗糖為營養(yǎng)源，加入3％的S1步驟難溶磷酸鹽原料，接入步驟S3培養(yǎng)的菌種2％，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩，轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)8d，將固體殘?jiān)团囵B(yǎng)液分離。固體殘?jiān)貜?fù)使用2次，使連續(xù)兩次浸出液中水溶性磷含量相差低于10％。
將上述分離出來的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，測得水溶性磷的浸出率為101.5mg/L。
實(shí)施例二：
S1、選取中低品位磷礦石(總磷含量約22％)，磨粉，過2mm篩備用；
S2、菌株篩選：
S21、制備溶磷圈培養(yǎng)基：稱取葡萄糖15g、硫酸銨0.8g、氯化鉀0.5g、難溶性磷酸鹽15g、瓊脂18g加入水1L，混合，在溫度為35℃左右的條件下培養(yǎng)8天；
S22、制備液體搖瓶培養(yǎng)基：稱取葡萄糖15g、硫酸銨0.8g、難溶性磷酸鹽35g/L加入水1L，搖瓶培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，培養(yǎng)時(shí)間8天。
S23、將巨大芽孢桿菌菌株加入上述培養(yǎng)基溶磷圈和液體搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行定性和定量測定，篩選出具有溶磷能力強(qiáng)的高效菌株。
本步驟中溶磷圈定性和液體搖瓶培養(yǎng)基定量測定與實(shí)施例一相同。
S3、菌種培養(yǎng)：
在100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接入6ml由步驟S2篩選出的高效巨大芽孢桿菌菌株，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩，轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)5d作為菌種；
S4、用清水為水源，加入10％蔗糖為營養(yǎng)源，加入5％的S1步驟難溶磷酸鹽原料，接入步驟S3培養(yǎng)的菌種5％，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩，轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)10d，將固體殘?jiān)团囵B(yǎng)液分離。固體殘?jiān)貜?fù)使用3次，使連續(xù)兩次浸出液中水溶性磷含量相差低于10％。
將上述分離出來的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，測得水溶性磷的浸出率為113.63mg/L。
實(shí)施例三：
S1、選取中低品位磷礦石(總磷含量約24％)，磨粉，過2mm篩備用；
S2、菌株篩選：
S21、制備溶磷圈培養(yǎng)基：稱取葡萄糖5g、硫酸銨0.3g、氯化鉀0.3g、難溶性磷酸鹽8g、瓊脂16g加入水1L，混合，在溫度為32℃左右的條件下培養(yǎng)6天；
S22、制備液體搖瓶培養(yǎng)基：稱取葡萄糖5g、硫酸銨0.3g、難溶性磷酸鹽 25g/L加入水1L，搖瓶培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速100r/min，培養(yǎng)時(shí)間6天。
S23、將巨大芽孢桿菌菌株加入上述培養(yǎng)基溶磷圈和液體搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行定性和定量測定，篩選出具有溶磷能力強(qiáng)的高效菌株。
本步驟中溶磷圈定性和液體搖瓶培養(yǎng)基定量測定與實(shí)施例一相同。
S3、菌種培養(yǎng)：
在100ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接入2ml由步驟S2篩選出的高效巨大芽孢桿菌菌株，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩，轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)3d作為菌種；
S4、用清水為水源，加入10％蔗糖為營養(yǎng)源，加入7％的S1步驟難溶磷酸鹽原料，接入步驟S3培養(yǎng)的菌種4％，置于30℃的恒溫振蕩器中振蕩，轉(zhuǎn)速160r/min，培養(yǎng)7d，將固體殘?jiān)团囵B(yǎng)液分離。固體殘?jiān)貜?fù)使用3次，使連續(xù)兩次浸出液中水溶性磷含量相差低于10％。
將上述分離出來的培養(yǎng)液進(jìn)行檢測，測得水溶性磷的浸出率為121.05mg/L。
綜上所述，本發(fā)明上述實(shí)施例僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例之部分，并不能以此局限本發(fā)明，在不脫離本發(fā)明精髓的條件下，本領(lǐng)域技術(shù)人員所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，都屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。