專利名稱：一種來自西太平洋熱液區(qū)菌Sulfobacillus acidophilus的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高溫菌，來自西太平洋熱液區(qū)Sulfobacillus acidophilus。
背景技術(shù)：
據(jù)估計(jì)地球上約有3000多萬種物種，目前己知僅有150萬種。而海洋 占地球面積的七成，總水量的97%,它擁有地球上物種的80%以上。許多海洋 微生物常處于高壓、高鹽、髙溫或低溫環(huán)境等特別環(huán)境，具有不同大陸上微生物 的特性，由于繁多類型的海洋微生物所處獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，造就了適應(yīng)特殊環(huán)境 的特殊基因或基因組，有著各種各樣的功能基因。生物冶金技術(shù)，又稱生物浸出技術(shù)，通常指礦石的細(xì)菌氧化或生物氧化，由 自然界存在的微生物進(jìn)行。這些微生物被稱作適溫細(xì)菌，大約有0.5-2.0微米 長、0. 5微米寬，只能在顯微鏡下看到，靠無機(jī)物生存，對生命無害。這些細(xì) 菌靠黃鐵礦、砷黃鐵礦和其他金屬硫化物如黃銅礦和銅鈾云母為生。適溫細(xì)菌和 其他細(xì)菌通常生活在因硫氧化而產(chǎn)生的酸性環(huán)境中，如溫泉、火山附近地區(qū)和富 含硫的地區(qū)。由澳大利亞一家公司培養(yǎng)的適溫細(xì)菌最早是在西澳的一礦山中發(fā)現(xiàn) 的，在含硫的酸性環(huán)境中，在髙溫條件下對可溶性金屬有很好的聚積作用。適溫細(xì)菌和其他"靠吃礦石為生"的細(xì)菌如何氧化酸性金屬的機(jī)理不得而知?；瘜W(xué)和 生物作用將酸性金屬氧化變成可溶性的硫酸鹽，不可溶解的貴金屬留在殘留物中，鐵、 砷和其他賤金屬，如銅、鎳和鋅進(jìn)入溶液。溶液可與殘留物分離，在溶液中和之前，采 取傳統(tǒng)的加工方式，如溶劑萃取，來回收賤金屬，如銅。殘留物中可能存在的資金屬， 經(jīng)細(xì)菌氧化后，通過氡化物提取。發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明從西太平洋熱液區(qū)獲取的，細(xì)菌名(拉丁語名Sulfobacillusacidophilus) 其主要表型特征革蘭氏陽性、桿狀、能夠自養(yǎng)、異養(yǎng)、混和營養(yǎng)型、耐高溫(最高能夠耐受 到7(TC)、嗜酸、高活動性、具有浸礦能力。 與Acidithiobacillus ferrooxidans相比長處是耐受的溫度更高。 與Leptospirillus ferrooxidans相比長處是耐受溫度高，同時能夠異養(yǎng)和自養(yǎng)兩種 營養(yǎng)型。同時能夠利用硫?yàn)槟芰縼碓础Ｄ軌蚶昧蚧V物浸礦。 大小長桿狀(0.3"0.8Xl-4um)


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圖l此菌電鏡照片。 圖2為生長曲線。圖3為浸礦活性。
具體實(shí)施方式
: 培養(yǎng)基成分MgS04 x 7 H200.5g(NH4)2S040.4K2HP040.2gKC10.1gDistilled water1000.0ml使用112804.調(diào)節(jié)pH為2。異養(yǎng)添加酵母提取物終濃度0.25 g/l.。 Fe含量10.0 mg/1 of FeS04 x 7 H20 自養(yǎng)Fe含量13.9 g/1 of FeS04 x 7 H20 (用112804調(diào)節(jié)其pH= 1.7) 固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中加入1%的瓊脂。 以上培養(yǎng)基使用前均需要髙溫蒸汽121C滅菌15-20分鐘。分離及篩選取熱液區(qū)樣品涂布平板，于45'C培養(yǎng)，得到單菌落，然后挑單菌落再次于新平 板上劃線培養(yǎng)，得到單菌落，再劃線，直到得到純培養(yǎng)的菌株。鑒定通過該菌株的表型特征以及其16SrDNA序列鑒定。16SrDNA序列測序的方法 16SrDNA序列提交號bankit851655,登陸號EF088287。在Genbank中比對結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株Sulfobacillus acidophilus DSM 10332株(登陸號 AB08訴42)以及NAL株(登陸號AF050169)的同源性均為99%。(一).提取基因組DNA:將初步鑒定為不同種的菌株提取Genomic DNA，方法如下1. 取對數(shù)期(否則不易裂解)細(xì)菌1.5-4.5ml, 12000rpm, lmin2. 用567uL的TE(pH8.0)重懸，加入3uL RNA酶(20ug/uL)，luL 溶菌酶(50mg/ml)，混勻，37'C 10min以上(此時菌液可能變 澄清);再加入30uL 10%的SDS(十二烷基磺酸鈉)和3uL20mg/mL 的蛋白酶K,混勻，15min以上(此時菌液應(yīng)為澄清， 否則菌不是處于對數(shù)期或是菌數(shù)太多而沒有完全裂解)3. 加入100uL 5M NaCl,充分混勻，再加入80uL CTAB/NaCl溶 液(10%CTAB/0.7M NaCl:在80ml H20中溶解4.1gNaCl，緩 慢加入10g CTAB，同時加熱并攪拌。如果需要，可加熱到65 T溶解。定容終體積至100ml) (CTAB:十六垸基三甲基溴化 銨)，混勻，于65°C lOmin4. 加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)，混勻，12000rpm5min,上 清移入新管5. 加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:l)，混勻，12000rpm5min，上清移入新管6. 加入0.6體積的異丙醇(或2體積乙醇)，輕輕混勻直到DNA 沉淀下來，靜置2min， 12000rpm 2min7. 去上清，70%乙醇洗兩次，晾干。8. 加入30-60uLddH2O溶解DNA，一20'C保存。(二)16SrDNA擴(kuò)增采用細(xì)菌的通用引物fD 1:5'-agagtttgatcctggctcag-3'rp2:5'-acggctaccttgttacgactt-3'PCR體系ddH20Genomic DNA:fDl:rp2:PCR bufferMg2+:dNTP:Taq13.5uL 4.50.5 ix L 0.5 2.5"2uL 0.5PCR程序95'CTotal94551C 72'C3min45s ， 45s 2min72'C 化lOmin pause25 uL30cycles(三) 膠回收將克隆的16SrDNA用1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，然后用膠回收試 劑盒回收克隆片斷(膠回收試劑盒夠自上海華瞬生物工程有限公司)(四) 連接T-vector (T載體)1 L; T4 DNA ligase (連接酶)0.5 u L; lOxBuffer: luL; 16SrDNA:5uL; ddH20: 2.5 uL于16X:過夜連接. (連接酶以及T載體均夠自晶美生物工程有限公司)(五) 制備感受態(tài)細(xì)胞1. 提前一天挑單菌落接種到試管中過夜培養(yǎng)2. 將試管中已經(jīng)長好的大腸桿菌按照1:50或者1:75或者1:100 的比例接種到100mL新鮮LB培養(yǎng)基中，于37'C搖床中培養(yǎng).3.直到OD6oo達(dá)到0.3-0.45，將菌液取出于冰上放置15min以上(一
般為半個小時左右)。4. 在4'C， 5000rpm條件下離心10min,取出后放在冰上，倒掉上 清液，加入0.1mol/L的CaCl2,使沉淀細(xì)胞重懸，并盡量分散 均勻。5. 于冰上放置30min后，4'C于5000rpm離心10min，倒去上清液，6. 加入4-8mL的0.1mol/LCaCl2(含15%的甘油)，使之重懸，并分 散均勻，按照每管100uL分裝到1.5mL的EP管中，于一 70 匸保存待用.(六) 轉(zhuǎn)化1. 取大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞100uL(冰上融化)；2. 加入5 u L連接體系，用移液槍吸打均勻(輕吸),于冰上放置30min; 3.42"水浴90s，不要搖動管.4. 將管快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，是細(xì)胞冷卻2min.5. 每管加入200uL的LB培養(yǎng)基，于37'C搖床溫育，使菌體富集，但注 意轉(zhuǎn)速要低于160rpm.6. 將菌液涂布平板在含有氨芐抗生素的LB平板培養(yǎng)基上，于371C 倒置培養(yǎng)過夜.(七) 菌落PCR: 引物序列M13M1: AGTC ACGACGTTGTA M13RV:C AGGAA AC AGCTATGAC1、 PCR體系ddH20 16.5 uLM13M1 luLM13RV lliLPCR buffer (10x) 2.5 ixLdNTP 2 u LMg2+: 1.5 uLTotal 24.5uL2、 挑單菌落接種于PCR體系中，同時對應(yīng)接種到含3mlLBA+液體培 養(yǎng)基中。3、 液體培養(yǎng)放于37'C培養(yǎng)。4、 PCR體系于99'C10min后，加入Taq酶0.5 u L后進(jìn)行PCR循環(huán)。 PCR程序95 C 15min35cycles72 C 10min 4°C pause (八)電泳檢測用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測是否有條帶擴(kuò)增出來.5 5 m4 4 2P P P4 5 29 5 7
若有1.5kb的明顯條帶則說明挑選的是陽性克隆，16SrDNA已經(jīng)轉(zhuǎn) 化進(jìn)大腸桿菌，取對應(yīng)的菌液直接送往上海生工測序.序列表16SrDNA序列CAGCGGTAGTGCCAAGAGCATGACGGCAGTGGACGATTAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCGTAATACATGCAAGTCGAGCGGTCGACGGCTCTTCGGAGGCGTCGGCAGCGGCGGACGGGTGAGGAACACGTGAGTAACCGGGCGTCCGGTGGGGGATATCGGGCCGAAAGGCGCGGCAATCCCGCATGCGCCCCGGGCGGCGCCAGCCGCCGGGGGGAAAGGCCTTCGGGTCGCCGGACGGGGGGCTCGCGGCCCATTAGCTAGTTGGGGGGGTAACGGCCTCCCAAGGCGACGATGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGACGGCCTTCGGGTTGTAAAGCTCTGTCTGTCGGGACGAGGACCGCGCCGTCCGGCGCGGGGGGACGGTACCGGCGGAGGAAGCCCCTGCAAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGTGTAGGCGGTTGCGCATGTAGCGGTTTTCAGCCGTCGGCTCACCCGACGGAGGGCGGCTAAACGGCGCAGCTCGAGGGCAGGAGAGGTGCATGGAATTCCTGGTGGAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCAGGAAGAACACCGGTGGCGAAGGCGGTGCACTGGCCTGGCCCTGACGCTGAGGCGCGACAGCGTGGGGAGCGAACGGGATTAGATACCCCGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACGAGGTGTCGCGGGGGTCCACCTCGCGGTGCCGGAGCTAACGCACTCAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGACGCAACGCGCAGAACCTTACCAGGGCTAGACGGGACCGTGAGCCGCGCGAAAGCGCGGGGCTGCTTCGGCAGAGCGGTCGTCAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGTCGGCTGTTGCCAGCGATTCGGTCGGGCACTCAGCCGAGACAGCCGGGGACGACCCGGGGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCCGCATGGCCTTCATGTCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCCGACAACGGGCCGCGACCTCGCGAGGGGGAGCGAATCCTTCAAACGGCGTCTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATCCGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTCGGCCACACCCGAAGCCGGTCGGTCGAACCCTGTCAGGGGACGACCCCGTCGACGGTGGGGCGGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAATCTCCAGAGGATCGCCGGGAACCGAGGACGAGTCGTAATCAGTCCATTGTT
權(quán)利要求
1. 一種從西太平洋熱液區(qū)菌Sulfobacillus acidophilus，其特征為革蘭氏陽性、桿狀、能夠自養(yǎng)、異養(yǎng)、混和營養(yǎng)型、耐高溫、嗜酸、高活動性、具有浸礦能力。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種來自于西太平洋熱液區(qū)菌Sulfobacillus acidophilus,其特征在于所述菌株為16SrDNA序列。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從西太平洋熱液區(qū)獲取的，細(xì)菌名(拉丁語名Sulfobacillus acidophilus)，其主要表型特征革蘭氏陽性、桿狀、能夠自養(yǎng)、異養(yǎng)、混和營養(yǎng)型、耐高溫(最高能夠耐受到70℃)、嗜酸、高活動性、具有浸礦能力。與Acidithiobacillus ferrooxidans相比長處是耐受的溫度更高。與Leptospirillus ferrooxidans相比長處是耐受溫度高，同時能夠異養(yǎng)和自養(yǎng)兩種營養(yǎng)型。同時能夠利用硫?yàn)槟芰縼碓础Ｄ軌蚶昧蚧V物浸礦。
文檔編號C12N1/20GK101210225SQ200610135418
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月31日
發(fā)明者紅 陳, 陳新華 申請人:國家海洋局第三海洋研究所