本發(fā)明涉及熒光標(biāo)記領(lǐng)域，尤其涉及一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法。

背景技術(shù)：
石墨烯的存在自從被發(fā)現(xiàn)以來，一直受到了科學(xué)家們極大的關(guān)注。石墨烯是目前人們發(fā)現(xiàn)的最薄、最堅(jiān)韌的材料，同時(shí)具有超乎尋常的導(dǎo)電、導(dǎo)熱性能。由于石墨烯優(yōu)異的性能，使其在電化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域發(fā)揮巨大的作用。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，由于石墨烯具有大的比表面積和較強(qiáng)的蛋白吸附特性，使它成為一種理想的藥物載體。因此，對于石墨烯的生物毒性的研究也受到了廣大科學(xué)家們的關(guān)注。觀察石墨烯與細(xì)胞的相互作用是研究的主要手段，其中對石墨烯的熒光染色是觀察石墨烯材料在細(xì)胞內(nèi)部分布情況以及細(xì)胞對石墨烯材料胞吞情況最重要的步驟，然而石墨烯表面并沒有與常見染色劑可進(jìn)行標(biāo)記的特性，所以對氧化石墨烯的染色對其與細(xì)胞的相互作用等研究中是十分關(guān)鍵的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法。本發(fā)明通過甲狀腺球蛋白與羅丹明B熒光素的作用先制備合成羅丹明B熒光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白，然后利用氧化石墨烯與蛋白質(zhì)的吸附特性間接將羅丹明B熒光素標(biāo)記在氧化石墨烯上，該方法不會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。本發(fā)明的具體技術(shù)方案為：一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將羅丹明B熒光素溶解于二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存，其中羅丹明B熒光素與二甲基亞砜的用量比為(0.5~1)/(1~5)mol/mL。2）將甲狀腺球蛋白添加到pH為8.5~9.5的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液,其中甲狀腺球蛋白與碳酸鈉水溶液用量比為(0.1~0.5)/(10~20)mol/mL。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將1~5體積份的A溶液滴加至10~20體積份的B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于pH為8.5~9.5的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）取氧化石墨烯分散于水中配制成1.5~2.5mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至3~6mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1：（0.8~1.2）的比例混合處理12~60h，然后將混合溶液經(jīng)離心分離后取固體，制得紅色標(biāo)記熒光的氧化石墨烯。本發(fā)明通過甲狀腺球蛋白與羅丹明B熒光素的作用先制備合成羅丹明B熒光素標(biāo)記的甲狀腺球蛋白，然后利用氧化石墨烯與蛋白質(zhì)的吸附特性間接將羅丹明B熒光素標(biāo)記在氧化石墨烯上，該方法不會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生顯著影響，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。作為優(yōu)選，步驟1）中羅丹明B熒光素與二甲基亞砜的用量比為(0.7~0.8)/(2~4)mol/mL。作為優(yōu)選，步驟2）中甲狀腺球蛋白與碳酸鈉水溶液用量比為(0.2~0.4)/(14~16)mol/mL。作為優(yōu)選，步驟3）中所述A溶液與所述B溶液的體積比為1:5。作為優(yōu)選，步驟3）中將所述A溶液滴加至所述B溶液的滴加速度為0.05-0.15mL/sec。慢速滴加能夠避免A溶液滴加到B溶液后發(fā)生團(tuán)聚現(xiàn)象，只有在特定的慢速滴加才能使A溶液與B溶液均勻、充分地混合而不發(fā)生團(tuán)聚。另一方面，慢速的滴加，也有利于甲狀腺球蛋白能夠被羅丹明B熒光素均勻地標(biāo)記，避免大多數(shù)羅丹明B熒光素標(biāo)記于少量的甲狀腺球蛋白上。作為優(yōu)選，在步驟3）的透析過程中，所述透析袋的截留分子量為7000-10000；所述C溶液與碳酸鈉水溶液的體積比為1:(50-150)。作為優(yōu)選，步驟4）中的氧化石墨烯經(jīng)過預(yù)處理：將氧化石墨烯在鹽酸水溶液中浸泡處理，然后經(jīng)離心分離得到預(yù)處理的氧化石墨烯。本發(fā)明預(yù)先將氧化石墨烯與酸性溶液作用，減小了氧化石墨烯表面的zate電位，減弱了甲狀腺球蛋白與材料的電荷排斥作用，有利于材料與蛋白的結(jié)合，同時(shí)也能夠使得標(biāo)記物能夠均勻地分布在標(biāo)記對象上。作為優(yōu)選，所述鹽酸水溶液的濃度為1mol/L，所述氧化石墨烯與鹽酸水溶液用量比為(2~3):(20~30)mg/mL，浸泡時(shí)間為4~8h，離心轉(zhuǎn)速為14000~18000g。作為優(yōu)選，步驟4）的離心分離過程具體為：將所述混合溶液在18000-22000g的轉(zhuǎn)速下離心4-6min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。與現(xiàn)有技術(shù)對比，本發(fā)明的有益效果是：1）羅丹明B熒光素與甲狀腺球蛋白的化學(xué)鍵作用十分牢靠，再利用氧化石墨烯對蛋白質(zhì)的吸附性能，使氧化石墨烯標(biāo)記上紅色熒光。2）本發(fā)明用甲狀腺球蛋白促使熒光劑與氧化石墨烯的結(jié)合，不影響細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。3）使用化學(xué)藥品較少，實(shí)驗(yàn)過程綠色環(huán)保。4）方法簡便、成本低、效果好。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將0.75mol的羅丹明B熒光素溶解于3mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.3mol的甲狀腺球蛋白添加到15mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.1mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為9000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于100倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）取氧化石墨烯分散于水中配制成2mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至4.5mg/mL，得到E溶液。在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1的比例混合處理36h，然后將混合溶液在20000g的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實(shí)施例2一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將0.75mol的羅丹明B熒光素溶解于3mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.3mol的甲狀腺球蛋白添加到15mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.1mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為8000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于100倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）將2.5mg的氧化石墨烯在25mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理6h，然后在16000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的氧化石墨烯。5）取預(yù)處理后的氧化石墨烯分散于水中配制成2mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至4.5mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1的比例混合處理36h，然后將混合溶液在19000g的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實(shí)施例3一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將0.5mol的羅丹明B熒光素溶解于1mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.1mol的甲狀腺球蛋白添加到10mL的pH為8.5的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.05mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為7000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于50倍質(zhì)量的pH為8.5的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）取2mg氧化石墨烯在30mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理4h，然后在14000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的氧化石墨烯。5）取預(yù)處理后的氧化石墨烯分散于水中配制成1.5mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至3mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:0.8的比例混合處理12h，然后將混合溶液在18000g的轉(zhuǎn)速下離心4min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實(shí)施例4一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將1mol的羅丹明B熒光素溶解于5mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.5mol的甲狀腺球蛋白添加到20mL的pH為9.5的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.15mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于150倍質(zhì)量的pH為9.5的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）取3mg氧化石墨烯在20mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理8h，然后在18000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的氧化石墨烯。5）取預(yù)處理后的氧化石墨烯分散于水中配制成2.5mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至6mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1.2的比例混合處理60h，然后將混合溶液在22000g的轉(zhuǎn)速下離心6min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實(shí)施例5一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將0.7mol的羅丹明B熒光素溶解于2mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.2mol的甲狀腺球蛋白添加到14mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.1mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為10000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于120倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）取3mg氧化石墨烯在25mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理5h，然后在15000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的氧化石墨烯。5）取預(yù)處理后的氧化石墨烯分散于水中配制成2mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至4mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:0.9的比例混合處理24h，然后將混合溶液在17000的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。實(shí)施例6一種紅色熒光標(biāo)記氧化石墨烯的方法，采用如下步驟：1）將0.8mol的羅丹明B熒光素溶解于4mL的二甲基亞砜中配制得A溶液，避光保存。2）將0.4mol的甲狀腺球蛋白添加到16mL的pH為9的碳酸鈉水溶液中，并在室溫下攪拌至完全溶解，配制得B溶液。3）將所述A溶液轉(zhuǎn)移至注射器中，將所述B溶液轉(zhuǎn)移至容器中，在避光條件下將A溶液以0.05mL/sec的速度滴加至B溶液中，配制得C溶液，接著將所述C溶液轉(zhuǎn)移至截留分子量為7000的透析袋中，然后將所述透析袋浸沒于80倍質(zhì)量的pH為9的碳酸鈉水溶液中進(jìn)行透析，直至透析袋中溶液由渾濁轉(zhuǎn)變?yōu)榍宄和该骱?，取出透析袋，得到羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液。4）取2mg氧化石墨烯在25mL的濃度為1mol/L的鹽酸水溶液中浸泡處理4~8h，然后在17000g的轉(zhuǎn)速下離心分離得到預(yù)處理的氧化石墨烯。5）取預(yù)處理后的氧化石墨烯分散于水中配制成2mg/mL的D溶液，再將所述羅丹明B標(biāo)記的甲狀腺球蛋白溶液加水稀釋濃度至5mg/mL，得到E溶液；在避光條件下將所述D溶液與所述E溶液按體積比1:1.1的比例混合處理48h，然后將混合溶液在21000g的轉(zhuǎn)速下離心5min，分離出固體后，用PBS緩沖液對剩余溶液進(jìn)行洗滌，然后反復(fù)進(jìn)行離心、分離、洗滌，直至不再有固體分離出為止。本發(fā)明中所用原料、設(shè)備，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常用原料、設(shè)備；本發(fā)明中所用方法，若無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對本發(fā)明作任何限制，凡是根據(jù)本發(fā)明技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、變更以及等效變換，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。