一種優(yōu)秀冰雪運動員富集cDNA文庫及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及優(yōu)秀冰雪運動員富集cDNA文庫以及其構(gòu)建方法，其中利用優(yōu)秀冰雪運動員血液樣品作為材料，通過提取總RNA、合成雙鏈cDNA、蛋白酶K消化、Sfi1酶切并連接入載體、λ噬菌體的包裝，最終獲得高滴度、高重組率、插入片段范圍大的高質(zhì)量優(yōu)秀冰雪運動員富集cDNA文庫。此發(fā)明屬于體育科學(xué)、人類資源方法學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)的交叉學(xué)科領(lǐng)域。
【專利說明】一種優(yōu)秀冰雪運動員富集cDNA文庫及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種cDNA文庫及其構(gòu)建方法，具體地說是利用多名優(yōu)秀冰雪運動員血液樣品通過提取總RM、混合總RNA，合成雙鏈cDNA、蛋白酶K消化、Sfil酶切并連接入載體、λ噬菌體的包裝，最終獲得優(yōu)秀冰雪運動員富集cDNA文庫。
【背景技術(shù)】
[0002]人類遺傳資源是人類進(jìn)行自身探索與研究不可替代的資源。人類遺傳資源指代表人類基因的遺傳材料，在現(xiàn)今世界，最能代表人類自身身體素質(zhì)基因的人群，便是各個運動項目的優(yōu)秀運動員。作為人類遺傳資源的一部分，運動基因遺傳資源是人類寶貴的財富，但是由于運動基因遺傳資源僅存在于運動員個體的局限性，如果對優(yōu)秀的運動員不采取保護(hù)性的基因保存工作，任其退役后運動能力逐漸消退直至死亡，無疑是我國體育事業(yè)的巨大損失。因此，在人類還沒有更合理科學(xué)的開發(fā)利用運動基因遺傳資源之前，有效地保存并對其進(jìn)行必要的研究就顯得尤其重要。
[0003]運動基因遺傳資源，與運動能力的開發(fā)有著密切的聯(lián)系，隨著人類基因組計劃的完善，越來越多的運動基因被發(fā)現(xiàn)，對其功能的研究也將更加深入。我國的“人類遺傳資源”項目中，標(biāo)本類型包括血液、血漿、血清、組織、石蠟包塊、基因組DNA以及永生細(xì)胞系等，共計完成154713份實物標(biāo)本以及8320份顯微圖像的整理與整合。運動遺傳保存方面，根據(jù)《人類遺傳資源描述規(guī)范》，北京體育大學(xué)課題組已完成優(yōu)秀長跑運動員永生細(xì)胞庫100株永生細(xì)胞株、優(yōu)秀長跑運動員DNA庫的184份DNA標(biāo)本，以及用于與耐力訓(xùn)練前后生理生化指標(biāo)變化關(guān)聯(lián)分析的武警士兵DNA庫106份DNA標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)化整理整合。
[0004]由于血液、組織樣品和基因組DNA是無法復(fù)制的遺傳研究材料，不適合廣泛而深入的科學(xué)研究，因此急需探索一種便`捷，高效，穩(wěn)定的方法對運動基因遺傳資源進(jìn)行保存。通過構(gòu)建優(yōu)秀冰雪運動員組織cDNA文庫無疑是保存運動基因遺傳資源的有效方式。更重要的是，構(gòu)建單個個體血液cDNA文庫所涵蓋的遺傳信息量有限，通過混個多個優(yōu)秀個體血液總RNA后，構(gòu)建血液富集cDNA文庫將更具實際價值。本專利所構(gòu)建的優(yōu)秀冰雪運動員富集cDNA文庫就是為了可以永久的保存人類與杰出運動能力相關(guān)的基因，同時解決以往實驗研究的接力式進(jìn)行與標(biāo)本的暫時性采集中存在的矛盾，以便有效的對同一研究對象進(jìn)行持久的連續(xù)性研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供高滴度、高重組率的高質(zhì)量優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述cDNA文庫構(gòu)建方法，其中利用多個優(yōu)秀冰雪運動員血液樣品作為材料，通過提取總RNA、混合總RNA，合成雙鏈cDNA、蛋白酶K消化、Sfil酶切并連接入載體、λ噬菌體的包裝，最終獲得高滴度、高重組率、插入片段范圍大的高質(zhì)量優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫。[0007]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:
[0008]優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫，該文庫特征在于:滴度高，重組率高，插入片段范圍大。微量cDNA文庫樣品轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒文庫后就可大量篩選基因。
[0009]而本發(fā)明所述的滴度高，重組率高，插入片段范圍大的優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫可以為分子生物學(xué)、基因工程、遺傳標(biāo)記和醫(yī)學(xué)等基礎(chǔ)生命科學(xué)研究提供大量優(yōu)質(zhì)材料。
[0010]下面對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，以使公眾對
【發(fā)明內(nèi)容】
有整體和充分的了解，而并非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。前述部分已經(jīng)充分公開了本發(fā)明可以實施的保護(hù)范圍，因此凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容進(jìn)行的任何本領(lǐng)域公知的等同替換，均屬于對本發(fā)明的侵犯。
【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明首先涉及一種優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫，其特征在于滴度高，重組率高，插入片段范圍大。所述微量cDNA文庫樣品轉(zhuǎn)化為質(zhì)粒文庫后就可大量篩選基因。優(yōu)選地，所述cDNA文庫是λ噬菌體的包裝后的噬菌體文庫。
[0012]在所述cDNA文庫中，其滴度通常高于107pfu/ml、高于108pfu/ml,優(yōu)選高于109pfu/ml,最優(yōu)選高于 101Qpfu/ml。
[0013]在所述cDNA文庫中，其重組率通常高于大約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95 %、96 %、97 %、98 %、或99 %。優(yōu)選地，重組率高于95 %。
[0014]在所述cDNA文庫中 ，其插入片段范圍一般在大約0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6、
0.7、0.8、0.9或1.0kb至大約2.0、3.0、4.0、或5.0kb之間，優(yōu)選在約0.2-3.0kb之間，最優(yōu)選在約0.3-約2.0kb之間。
[0015]優(yōu)選地，本發(fā)明的cDNA文庫滴度為1.5 X IOiqpfu/mL，重組率在95.3%以上，插入載體的DNA片段范圍在0.3~2kb之間。
[0016]本發(fā)明還涉及優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫的構(gòu)建方法，所述方法包括以下步驟:
[0017](I)取優(yōu)秀冰雪運動員血液樣品；
[0018](2)提取總RNA并將總RNA混合；
[0019](3)合成雙鏈 cDNA;
[0020](4)蛋白酶K消化；
[0021](5) Sfi I酶切并連接入載體；
[0022](6) λ噬菌體的包裝；
[0023](7)未擴(kuò)增文庫滴度的測定；
[0024](8)文庫的擴(kuò)增及擴(kuò)增文庫滴度測定；
[0025](9)文庫重組率及平均插入片段長度的測定；
[0026](10)全長基因比率檢測。
[0027]其中，優(yōu)選地，步驟(1)所述的血液樣品是取自我國優(yōu)秀冰雪運動員；步驟(2)所述的提取總RNA，是將優(yōu)秀冰雪運動員血液樣品分離淋巴細(xì)胞后采用Trizol法提取總RNA，分別提取各個個體的總RNA后將其混合；步驟(3)所述的合成雙鏈cDNA是反轉(zhuǎn)錄先合成cDNA的第一鏈，然后通過LD-PCR合成并擴(kuò)增雙鏈cDNA ;步驟(4)所述蛋白酶K消化，是使用蛋白酶K消化方法消除步驟(3)反應(yīng)中殘余的酶。
[0028]步驟(6)所述的λ噬菌體(Lambda TriplEx2)的包裝方法為:
[0029]①從_80°C冰箱中取出包裝蛋白，用手溫快速解凍，直至包裝蛋白開始融解；
[0030]②立即加入4 μ I連接產(chǎn)物，輕輕混勻且避免產(chǎn)生氣泡，并于22°C孵育2h ；
[0031]③加入500ul SM buffer,再加入20ul氯仿，并輕輕混勻；
[0032]④得到的未擴(kuò)增文庫可進(jìn)行未擴(kuò)增文庫滴度的測定或4°C保存(不超過I個月)。
[0033]步驟(7)和(8)中未擴(kuò)增和擴(kuò)增文庫滴度測定的方法為:
[0034]①挑VCS257細(xì)菌單克隆在合適液體培養(yǎng)基(含IOmM MgS04,0.2% maltose)中震蕩培養(yǎng)至 OD600 = 1.5,1500rpm 離心 IOmin ；
[0035]②用IOmM MgS04重懸細(xì)菌至0D_為4.0 ;
[0036]③用SM Buffer稀釋包裝產(chǎn)物為1: 10和1: 20 ;
[0037]④將I μ I稀釋后的包裝產(chǎn)物與200 μ I OD600為4.0的菌液充分混勻，于37°C孵育15min ；
[0038]⑤加入3ml LB top agar (約48<? )并立即倒入已經(jīng)準(zhǔn)備好的LB agar plates中，37 °C孵育過夜；
[0039]⑥數(shù)噬菌斑，計算未擴(kuò)增文庫的滴度。
[0040]Pfu/ml =(噬菌斑數(shù)*稀釋倍數(shù)*103) /鋪板的稀釋噬菌體體積(μ I)
[0041]步驟(9)中文庫重組率及平均插入片段長度的測定的方法為:
[0042]①挑取96個分界良好的噬菌斑至含有20 μ I SM Buffer的96孔培養(yǎng)板；
[0043]②于37°C震蕩培養(yǎng)4h ;
[0044]③利用特異性引物進(jìn)行插入片段PCR檢測；
[0045]⑤1.2%電泳檢測片段長度
[0046]⑥分析電泳結(jié)果，計算重組率和平均插入片段長度。
[0047]重組率=陽性克隆檢出數(shù)/測定樣品數(shù)
[0048]上述構(gòu)建方法還包括測定所得的文庫的滴度，和/或測定所得文庫的重組率及平均插入片段長度；以及/或者還包括擴(kuò)增所得文庫，和/或測定所擴(kuò)增文庫的滴度。本發(fā)明還涉及由上述方法制備的優(yōu)秀冰雪運動員血液富集cDNA文庫。所述cDNA文庫是λ噬菌體的包裝后的曬菌體文庫。
[0049]實施例:
[0050]1.主要儀器設(shè)備
[0051]電動移液器(德國)；-70°C低溫冰箱(美國);PCR擴(kuò)增儀(德國Biomtera)；ND-1000核酸蛋白檢測儀(美國)；頗爾超純水器(德國Pall) ;Sigmal_15K型低溫離心機(德國)；凝膠自動成像分析系統(tǒng)(國產(chǎn))；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海)；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海)；PH030A型培養(yǎng)箱(上海)；HHS-21-4水浴鍋(上海)；電泳儀及電泳槽(北京六一廠)
[0052]2.主要試劑
[0053]SMART? cDNA Library Construction Kit (Clontech) ；Trizol(Invitrogen)；Gigapack IIIGold-7 (Stratagene)。其他試劑為分子生物學(xué)實驗室常用試劑。
[0054]3.總RNA的提取[0055](I)抽取取優(yōu)秀冰雪運動員血液樣品，放入檸檬酸鈉抗凝管中，上下顛倒數(shù)次使新鮮血液與抗凝劑充分混勻，24h內(nèi)帶回實驗室；
[0056](2) 5000rpm,離心5min,取淋巴細(xì)胞層至滅菌的1.5mL離心管中；
[0057](3)向離心管中加入Iml Trizol,混勻后室溫靜置5min ;
[0058](4)加入0.2ml氯仿，漩渦振蕩器振蕩15s混勻，室溫靜置2~3min ；
[0059](5) 4°C 12000r/min 離心 15min ；
[0060](6)取上層水相到另一離心管中，加入400 μ I異丙醇，混勻后室溫靜置IOmin ；
[0061](7) 40C 12000r/min離心lOmin，去上清，用lml75%乙醇洗滌沉淀兩次；
[0062](8) 37°C 5 ~IOmin 晾干乙醇；
[0063](9)將RNA溶于50~100 μ I無Rnase的DEPC處理過的水中，根據(jù)實驗設(shè)計混合總RNA樣品；
[0064](10)紫外分光光度計測定0D260/0D280檢測提取總RNA的純度，甲醛變性電泳估測濃度及判斷其完整性。
[0065]結(jié)果:RNA的18S和28S條帶清晰，分界清楚無拖帶，證明所抽提的RNA完整性很好，沒有發(fā)生降解。
[0066]4.cDNA 的合成
[0067]4.1cDNA第一鏈的合成
[0068](I)在一滅菌的0.5ml離心管中加入下列樣品:
[0069]3μ I 總 RNA樣品
[0070]I μ I SMART III Oligonucleotide
[0071]I μ I CDS III3'PCR Primer
[0072]總體積5μ1
[0073](2)稍作離心使樣混合；
[0074](3) 72 °C 2min ；
[0075](4)冰上冷卻 2min ；
[0076](5)稍離心使樣沉到管底；
[0077](6)加入下列樣品:(冰上操作)
[0078]2.0 μ 15X First-Strand buffer
[0079]1.0μ I DTT(20mM)
[0080]1.0μ I dNTP mix(IOmM)
[0081 ]1.0 μ I MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200U/ μ I)
[0082]10.0μ1 總體積.[0083](7)用槍溫和混勻，稍離心；
[0084](8)42。(:孵育1111.;
[0085](9)放到冰上終止反應(yīng)；
[0086](10)吸取2 μ I用于LD-PCR ;剩余_20°C可以保存三個月。
[0087]4.2LD-PCR 擴(kuò)增 cDNA
[0088](I) PCR 儀預(yù)熱到 95°C ；
[0089](2)取一 PCR管，按下列體系混合各溶液:[0090]
【權(quán)利要求】
1.一種優(yōu)秀冰雪運動員血液富集CDNA文庫構(gòu)建方法: 1)此方法的創(chuàng)新點:在于滴度高，重組率高，插入片段范圍大。要求的cDNA文庫，其滴度高于107pfu/ml，最優(yōu)選高于lO'fu/ml ;cDNA文庫重組率高于90 %，優(yōu)選高于95% ;其插入片段范圍在0.lkb-5.0kb之間，最優(yōu)選在0.3kb-2.0kb之間。 2)此方法的主要實驗步驟:(1)取不同個體優(yōu)秀冰雪運動員新鮮血液；(2)提取總RNA ； (3)混合多個個體總RNA ； (4)合成雙鏈cDNA ; (5)蛋白酶K消化；(6) Sfil酶切并連接入載體；(7) λ噬菌體的包裝。
2.一種優(yōu)秀冰雪運動員血液cDNA文庫質(zhì)量快速檢測的方法: 1)插入片段長度檢測； 2)重組率檢測； 3)全長基因比例檢測； 4)覆蓋率檢測； 5)重要基因的克隆率檢測； 6)重要基因的功能檢測。
【文檔編號】C40B40/08GK103806109SQ201310117930
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月8日
【發(fā)明者】高俊江, 李興洋, 高凡, 陸濤峰, 金紅, 關(guān)偉軍 申請人:哈爾濱體育學(xué)院