Bard1基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種BARD1基因突變檢測(cè)液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：T6883G位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，針對(duì)A43635G位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，針對(duì)G1670C位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，針對(duì)G25542A位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18，和/或針對(duì)G1134C位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20；有不同anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100％，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的野生型和突變型并行檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】BARD1基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種BARDl基因突變檢測(cè)特異性引物和液相芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]BRCAl 關(guān)聯(lián)環(huán)域 I (BRCA1 associated RING domain，BARDl)是一種可以與 BRCAl蛋白結(jié)合的蛋白，因?yàn)榫哂泻虰RCAl相似的環(huán)指功能域，所以命名為BARD1。BARDl基因位于2號(hào)染色體2q34_35的長(zhǎng)臂上，編碼含777個(gè)氨基酸殘基的蛋白。該蛋白的主要功能域有環(huán)指功能域、三個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和兩個(gè)羧基端功能域。BARDl基因突變可以阻止BARDl蛋白對(duì)受損DNA的修復(fù)，DNA缺陷的累積會(huì)使細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂失去控制，從而形成腫瘤。另外，有研究發(fā)現(xiàn)BARDl基因在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了一定的作用。
[0003]目前，BARDl基因突變檢測(cè)方法主要有:基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALD1-T0F-MS)、熒光定量PCR技術(shù)和PCR-RFLP，基質(zhì)輔助激光解析電離時(shí)間飛行質(zhì)譜技術(shù)是一種軟電離技術(shù)，在蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測(cè)中有著強(qiáng)大而成熟的功能，但是在核酸檢測(cè)領(lǐng)域，由于核酸分子本身的特殊性，檢測(cè)受到一定的限制，熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高的特點(diǎn)，但也存在樣品易污染、假陽(yáng)性率高的缺點(diǎn)，且每次只能檢測(cè)一種突變類型，PCR-RFLP法是基于基因突變?cè)斐傻南拗菩詢?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改變，如位點(diǎn)丟失或產(chǎn)生新位點(diǎn)，通過(guò)PCR擴(kuò)增某一特定片段，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳觀察片段的大 小，這種方法用于檢測(cè)酶切位點(diǎn)改變的基因突變，可直接判斷基因型，但該法不能用于沒(méi)有產(chǎn)生新酶切位點(diǎn)的基因突變檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，該液相芯片可用于單獨(dú)或并行檢測(cè)BARDl基因五種常見(jiàn)基因型T6883G、A43635G、G1670C、G25542A和G1134C的野
生型和突變型。
[0005]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0006]一種BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，包括有:
[0007](A).針對(duì)BARDl基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對(duì):每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對(duì)T6883G位點(diǎn)的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，針對(duì)A43635G位點(diǎn)的 SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，針對(duì) G1670C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對(duì) G25542A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對(duì) Gl 134C 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.21~SEQ IDN0.30,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)；[0009]( C).用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
[0010]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述擴(kuò)增引物為:針對(duì)T6883G位點(diǎn)的SEQ ID N0.31及SEQID N0.32，針對(duì) A43635G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，針對(duì) G1670C 位點(diǎn)的 SEQID N0.35 及 SEQ IDN0.36，針對(duì) G25542A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或針對(duì) G1134C 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述ASPE引物對(duì)為針對(duì)T6883G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.11組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12組成的序列，針對(duì)A43635G位點(diǎn)的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14組成的序列，針對(duì)G1670C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16組成的序列，針對(duì)G25542A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.18組成的序列，和/或針對(duì)Gl 134C位點(diǎn)的由SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20組成的序列。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供用于BARDl基因突變檢測(cè)的特異性引物。
[0013]實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0014]用于BARDl基因突變檢測(cè)的特異性引物，所述特異性引物為針對(duì)T6883G位點(diǎn)的SEQ IDN0.11 及 SEQ ID N0.12，針對(duì) A43635G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，針對(duì)G1670C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對(duì) G25542A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQID N0.18，和 / 或針對(duì) G1134C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0016]1.本發(fā)明所提供的BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法的吻合率高達(dá)100%。且檢測(cè)所需要的 時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測(cè)序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。所制備的BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片具有非常好的信號(hào)-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個(gè)突變位點(diǎn)的并行檢測(cè)。
[0017]2.本發(fā)明通過(guò)發(fā)明人長(zhǎng)期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識(shí)別目標(biāo)檢測(cè)的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個(gè)反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測(cè)特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測(cè)單個(gè)位點(diǎn)突變情況，也能夠同時(shí)并行檢測(cè)多個(gè)突變位點(diǎn)的突變情況，檢測(cè)效果一致。
[0018]3.本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，5種突變位點(diǎn)檢測(cè)可通過(guò)一步PCR即可完成5條含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時(shí)定性、定量分析特征。
[0019]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時(shí)對(duì)現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測(cè)項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測(cè)的熒光信號(hào)值大大提高，從而使得檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【具體實(shí)施方式】[0020]實(shí)施例1BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，主要包括有:
[0021]一、ASPE 引物
[0022]針對(duì)BARDl 基因五種常見(jiàn)基因型 T6883G、A43635G、G1670C、G25542A 和 G1134C 的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1BARDl基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
[0024]
【權(quán)利要求】
1.一種BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對(duì)BARDl基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對(duì):每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對(duì)目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對(duì)T6883G位點(diǎn)的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，針對(duì)A43635G位點(diǎn)的 SEQ IDN0.13 及 SEQ ID N0.14，針對(duì) G1670C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對(duì)G25542A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對(duì) G1134C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對(duì)； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測(cè)的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為:針對(duì) T6883G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32，針對(duì) A43635G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.33 及SEQID N0.34，針對(duì)G1670C位點(diǎn)的 SEQ ID N0.35 及 SEQ ID N0.36，針對(duì)G25542A位點(diǎn)的 SEQID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或針對(duì) G1134C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對(duì)為針對(duì)T6883G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.12組成的序列，針對(duì)A43635G位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.14組成的序列，針對(duì)G1670C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16組成的序列，針對(duì)G25542A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.7和SEQID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18組成的序列，和/或針對(duì)G1134C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQID N0.10和SEQ ID N0.2 0組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的BARDl基因突變檢測(cè)液相芯片，其特征在于，所述間隔臂為5 — 10個(gè)T。
5.用于BARDl基因突變檢測(cè)的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物為針對(duì)T6883G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對(duì) A43635G 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.13 及 SEQIDN0.14，針對(duì) G1670C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對(duì) G25542A 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對(duì) G1134C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
【文檔編號(hào)】C40B40/06GK103849940SQ201210512217
【公開(kāi)日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月4日
【發(fā)明者】劉麗, 胡文暉 申請(qǐng)人:益善生物技術(shù)股份有限公司