Tyr基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種TYR基因突變檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對G6895A位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.9及SEQ?ID?NO.10，針對C1205T位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，針對C575A位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，和/或針對A99214C位點(diǎn)的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16；有anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％，實(shí)現(xiàn)多個突變位點(diǎn)的野生型和突變型并行檢測。
【專利說明】TYR基因突變檢測特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種TYR基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)位于11號染色體llql4.3長臂上,具體位于11號染色體88911039到89028926堿基對之間。酪氨酸酶(TYR)是一種75kD含銅酶，來源于胚胎神經(jīng)峭細(xì)胞，是黑素代謝和兒茶酚胺的關(guān)鍵酶。有研究發(fā)現(xiàn)，眼皮膚白化病I型患者身上可以發(fā)現(xiàn)TYR基因100多種突變，這些突變破壞了黑色素的正常生成，從而降低了頭發(fā)、皮膚和眼睛的著色。另外，酪氨酸酶可能是白癜風(fēng)自身免疫的重要抗原。最近發(fā)現(xiàn)部分白癜風(fēng)患者血清中有酪氨酸酶抗體，且與白癜風(fēng)臨床類型和分期密切相關(guān)。自身免疫性白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制與酪氨酸酶抗體水平有關(guān)，為其免疫治療提供依據(jù)。酪氨酸酶抗體可以作為白癜風(fēng)活動性的一個指標(biāo)。
[0003]目前，TYR基因突變檢測方法主要有=Illumina光纖微珠芯片技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALD1-T0F-MS)和熒光定量PCR技術(shù)，雖然Illumina光纖微珠芯片技術(shù)是高靈敏度和精確性的高通量檢測系統(tǒng)，但是自動化程度低，手工操作比較多，難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動化程度高的特點(diǎn)，但也存在樣品易污染、假陽性率高的缺點(diǎn)，且每次只能檢測一種突變類型，同樣不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要，基質(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜技術(shù)是一種軟電離技術(shù)，在蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測中有著強(qiáng)大而成熟的功能，但是在核酸檢測領(lǐng)域，由于核酸分子本身的特殊性，檢測受到一定的限制，也難以滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供一種TYR基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨(dú)或并行檢測TYR基因四種常見基因型G6895A、C1205T、C575A和A99214C的野生型和突變型。
[0005]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0006]一種TYR基因突變檢測液相芯片，包括有:
[0007](A).針對TYR基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對G6895A位點(diǎn)的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，針對C1205T位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C575A 位點(diǎn)的 SEQ ID` N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 /或針對A99214C位點(diǎn)的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16 ;所述tag序列選自SEQ ID N0.1~SEQ ID N0.8 ；
[0008](B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.17~SEQ IDN0.24,且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；
[0009]( C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
[0010]在其中一個實(shí)施例中，所述擴(kuò)增引物為:針對G6895A位點(diǎn)的SEQ ID N0.25及SEQID N0.26，針對 C1205T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.27 及 SEQ ID N0.28，針對 C575A 位點(diǎn)的 SEQ IDN0.29 及 SEQ IDN0.30，和 / 或針對 A99214C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32。
[0011]在其中一個實(shí)施例中，所述ASPE引物對為:針對G6895A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.9組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10組成的序列，針對C1205T位點(diǎn)的由SEQ IDN0.3和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12組成的序列，針對C575A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14組成的序列，和/或針對A99214C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ IDN0.16組成的序列。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供用于TYR基因突變檢測的特異性引物。
[0013]實(shí)現(xiàn)該目的的技術(shù)方案如下。
[0014]用于TYR基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物為:針對G6895A位點(diǎn)的SEQIDN0.9 及 SEQ ID N0.10，針對 C1205T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C575A位點(diǎn)的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 A99214C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQID N0.16。
[0015]實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。
[0016]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0017]1.本發(fā)明所提供的TYR基因突變檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100%，且檢測所需要的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合實(shí)際應(yīng)用需要。所制備的TYR基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計(jì)的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)多個突變位點(diǎn)的并行檢測。
[0018]2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)和大量的實(shí)驗(yàn)操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計(jì)的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點(diǎn)，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個位點(diǎn)突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點(diǎn)的突變情況，檢測效果一致。
[0019]3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，4種突變位點(diǎn)檢測可通過一步PCR即可完成4條含有突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。 [0020]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項(xiàng)目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【具體實(shí)施方式】[0021]實(shí)施例1TYR基因突變檢測液相芯片，主要包括有:
[0022]一、ASPE 引物
[0023]針對TYR基因四種常見基因型G6895A、C1205T、C575A和A99214C的野生型和突變型，分別設(shè)計(jì)特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0024]表1TYR基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
【權(quán)利要求】
1.一種TYR基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對TYR基因不同突變位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點(diǎn)的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對G6895A位點(diǎn)的SEQ ID N0.9及SEQ ID N0.10，針對C1205T位點(diǎn)的SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C575A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，和 / 或針對 A99214C 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.8 ； (B).有不同ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.17~SEQ ID N0.24，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點(diǎn)的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的TYR基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為:針對G6895A位點(diǎn)的 SEQ ID N0.25 及 SEQ ID N0.26，針對 C1205T 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.27 及 SEQIDN0.28，針對 C575A 位點(diǎn)的 SEQ ID N0.29 及 SEQ ID N0.30，和 / 或針對 A99214C 位點(diǎn)的SEQ IDN0.31 及 SEQ ID N0.32。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的TYR基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物對為:針對G6895A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.9組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.10組成的序列，針對C1205T位點(diǎn)的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.12組成的序列，針對C575A位點(diǎn)的由SEQ ID N0.5和SEQID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.14組成的序列，和/或針對A99214C位點(diǎn)的由SEQ ID N0.7和SEQ IDN0.15組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.16組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 或2所述的TYR基因突變檢測液相芯片，其特征在于，所述間隔臂為5— 10 個 T。
5.用于TYR基因突變檢測的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物為:針對G6895A位點(diǎn)的 SEQ ID N0.9 及 SEQ ID N0.10，針對C1205T位點(diǎn)的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對C575A位點(diǎn)的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，和/或針對A99214C位點(diǎn)的SEQ IDN0.15 及 SEQ ID N0.16。
【文檔編號】C40B40/06GK103849941SQ201210512220
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月4日
【發(fā)明者】吳詩揚(yáng), 陳昌華 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司