專利名稱：一種海洋青鳉魚特異性組織的均一化cDNA文庫及制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及cDNA文庫領域，具體涉及一種海洋青鏘魚特異性組織的均一化CDNA 文庫及制備方法。
背景技術：
海洋青鏘魚(Oryzias Melastigma)在中國、朝鮮、日本及印度等海域普遍存在，成 年個體長約3. 5-4厘米，生活周期大約為2-3個月，基因組較小，只有斑馬魚基因組的一半， 約為800Mb，性格溫和、產(chǎn)卵率高、易于觀察、海水消耗低，對海水環(huán)境壓力較能耐受，且肝、 生殖組織等對缺氧引起的環(huán)境壓力變化比較敏感，因此很適宜作為模式生物用于科學研 究，尤其適用于海洋環(huán)境質(zhì)量評估和海洋生態(tài)毒理學等方面的實驗研究。但海洋青鏘魚的 遺傳信息獲得還很不完整，檢索國內(nèi)外專業(yè)的cDNA文庫構建公司，未見到相關的產(chǎn)品；檢 索美國國立圖書館的遺傳數(shù)據(jù)庫，可獲得的基因信息不足30條。對海洋青鏘魚基因信息的 有限所知嚴重阻礙了其作為模式生物的研究與應用，因而獲得覆蓋面廣、質(zhì)量較高的cDNA 文庫是十分迫切的。cDNA文庫的構建是分子生物學領域的一項重要技術，但以常規(guī)方法構建的cDNA 文庫面臨的最大問題是高通量分析過程中重復的拷貝所占比例太高，其重要的原因就在于 高等真核生物的細胞中基因的表達水平差異很大。從基因的轉錄水平看，細胞中高豐度基 因可能僅有10-20個，但卻富含幾千個拷貝，占細胞mRNA含量20%以上；中等豐度的幾百 個基因，富含幾百個拷貝，約占細胞mRNA含量的40-60% ；而低豐度表達的幾千個稀有基 因，在單個細胞中僅存在著1-15個拷貝，占mRNA含量的20-40%。因此對于cDNA文庫而言， 高拷貝基因序列的大量存在給基因的篩選和鑒定帶來不必要的浪費是難免的，如日本水稻 基因組計劃(RGP) 1991年啟動的EST測序中，為獲得足夠多的基因信息，動用了多達15個 獨立的cDNA文庫，測序超過29000個cDNA克隆，才獲得近1萬條非重復序列。隨著分子生物學技術的長期發(fā)展，自1990年以來出現(xiàn)了各種均一化cDNA文庫 (equalized cDNA library, normalized cDNA library)的構建方法，試圖在文庫測序前 降低代表高豐度轉錄本的克隆，增加中低豐度轉錄本出現(xiàn)的頻次，以有利于低豐度表達 基因的發(fā)現(xiàn)。其中Zhulidov和Bogdanova等提出的利用一種特殊的雙鏈特異性核酸酶 (duplex-specific nuclease,DSN)進行 cDNA均一化的方法[Zhulidov PA,Bogdanova EA, Shcheglov AS, Vagner LL, Khaspekov GL, Kozhemyako VB, Matz MV, Meleshkevitch E, Moroz LL, Lukyanov SA, Shagin DA. Simple cDNA normalization using kamchatka crab duplex-specific nuclease. NucleicAcids Res. 2004,32(3) :e37]，與其它的 cDNA 均一化 方法比較，可以有效地均一化含有全長序列的cDNA樣本，并且可以減少物理性分離程序， 節(jié)省操作時間，因而十分適合基因信息量所知有限的生物進行高效的文庫構建。這種新型的cDNA均一化方法，利用DNA變性后可以再重新雜交的二級反應動力學 原理，并主要應用了一種提取自堪察加半島螃蟹(Paralithodescamtschaticus)的雙鏈特異性核酸酶參與反應。其均一化策略具體包括cDNA變性后重組、代表高豐度轉錄本的雙 鏈成分的降解以及均一化的單鏈DNA成分的PCR擴增。方法的關鍵是cDNA在變性及重組 后，利用雙鏈特異性核酸酶的特性一一在復雜的核酸復合物中，其裂解雙鏈成分的能力要 遠強于裂解單鏈DNA或RNA的能力，無論核酸序列長短，都可以高效的除去雙鏈成分，包括 DNA-DNA和DNA-RNA雜合體。這種酶發(fā)揮活性的溫度范圍較廣，在55_65°C間具有最佳活性； 而且其降解單鏈DNA成分僅在高溫時才發(fā)生，這可以避免二級結構形成或接合序列引起的 非特異性雜交等情況所致的轉錄本丟失。應用這種均一化方法，理論上講，如果樣本中存在10000-20000種mRNA，高豐度基 因的代表水平在均一化后可以降低1-2個數(shù)量級，中等豐度基因的代表水平可以降低幾倍 或維持不變，而代表低豐度的稀有基因濃度可以增加3倍。理想化的均一化文庫中各基因 的代表水平應該是0.01%。而且使用這種方法，cDNA序列長度保持不變，可以有效地用于富含全長cDNA的樣 本。此外，這種均一化方法對于單鏈cDNA和雙鏈擴增的cDNA同樣有效。當能夠獲得 足夠的polyA+RNA樣本時，以polyA+RNA為模板反轉錄形成cDNA第一鏈，均一化步驟主要 針對cDNA-RNA雜合體；當樣本來源稀少，只能獲得有限的總RNA含量而不方便分離提取 polyA+RNA時，可以先通過反轉錄獲得雙鏈cDNA，然后再進行均一化反應，這種方法同樣有 助于低豐度表達基因的發(fā)現(xiàn)。根據(jù)上述技術描述，建立海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫，能夠克服基 因轉錄水平上的巨大差異，有利于大量篩選、發(fā)現(xiàn)和研究海洋青鏘魚基因的表達并進行序 列分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫，為大量 發(fā)現(xiàn)和研究海洋青鏘魚的表達基因奠定基礎，同時為深入研究海洋青鏘魚特異性組織的表 達標志物提供依據(jù)。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫的 方法。本發(fā)明的思路是這樣的從海洋青鏘魚的一種或幾種特異性組織中提取總RNA， 利用SMART方法合成cDNA雙鏈，cDNA變性后重新雜交，經(jīng)雙鏈特異性核酸酶降解雙鏈cDNA 后完成cDNA的均一化過程，均一化后的單鏈cDNA成分經(jīng)PCR擴增并插入載體，即得海洋青 鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫。本發(fā)明一方面公開了一種海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫。本發(fā)明另一方面提供了制備海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫的方法， 包括如下步驟a)提取海洋青鏘魚特異性組織的總RNA，b)合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，c) cDNA變性后再重新雜交，d)雙鏈成分的選擇性降解，
e)均一化后cDNA成分的PCR擴增，f)擴增產(chǎn)物插入載體?？梢杂帽绢I域普通技術人員所熟知的技術提取海洋青鏘魚特異性組織的總RNA， 例如按照Invitrogen公司的Trizol試劑提取總RNA。可以用本領域普通技術人員所熟知的技術，以Oligo d(T)為引物反轉錄合成 cDNA的第一鏈。優(yōu)選地，在合成cDNA第一鏈時引入SEQ ID No. 1序列和SEQID No. 2序 列?？梢杂帽绢I域普通技術人員所熟知的PCR技術擴增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，優(yōu)選地，采用 LD-PCR方法合成并擴增cDNA多核苷酸產(chǎn)物，更優(yōu)選地，LD-PCR引物為SEQ IDNo. 2和SEQ IDNo. 3 序列?？梢杂帽绢I域普通技術人員所熟知的技術進行雙鏈cDNA的變性并再重新雜交?？梢杂帽绢I域普通技術人員所熟知的技術進行選擇性地降解cDNA雙鏈成分，優(yōu) 選地，采用雙鏈特異性核酸酶，更優(yōu)選地，采用一種提取自堪察加半島螃蟹的雙鏈特異性核 酸酶DSN。可以用本領域普通技術人員所熟知的技術PCR擴增均一化后的核苷酸成分?？梢杂帽绢I域普通技術人員所熟知的技術將cDNA多核苷酸產(chǎn)物插入載體，并用 載體轉化宿主細胞。因而含有cDNA文庫基因的載體和含有該載體的轉化體也在主張保護范圍內(nèi)。制備海洋青鏘魚特異性組織均一化cDNA文庫的方法，還包括轉化宿主細胞的步 驟，有多種方法可以使均一化的cDNA文庫轉化宿主細胞，優(yōu)選地采用電脈沖方法。制備海洋青鏘魚特異性組織均一化cDNA文庫的方法，合成的cDNA多核苷酸產(chǎn)物 可以經(jīng)過純化，提取200bp-5kb的組分插入載體，優(yōu)選地提取500bp-3000bp的組分插入載 體。以下結合實施例說明本發(fā)明的有益技術效果。對比人類細胞的基因數(shù)目大約有30000-40000個左右，本發(fā)明所構建的海洋青鏘 魚的文庫容量為1X106，基本能夠達到獲得大量海洋青鏘魚表達基因的要求。該海洋青鏘 魚的特異性組織的均一化CDNA文庫建立后，即可通過測序和比對篩選分離出海洋青鏘魚 特有的表達基因，而一旦發(fā)現(xiàn)有價值的基因，就可以方便地對其進一步分析研究。如本發(fā)明實施例一構建的海洋青鏘魚肝臟組織的均一化cDNA文庫中，由于采用 了雙鏈cDNA的DSN-均一化以及LD-PCR技術，可以保證一些低豐度表達的稀有cDNA片段被 擴增，因而擴增的片段具有很高的代表性，這有利于文庫的篩選和鑒定。如實施例三所述， 隨機挑選的cDNA文庫的20個克隆鑒定結果，插入片段大小范圍約為500bp-3kb，且多集中 在lkb-2kb左右，圖7。插入片段的測序結果與基因庫(GenBank)進行比對分析，其中1個 克隆與基因序列gb|EF392364. 1|99%—致。


圖1為海洋青鏘魚肝臟組織總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳結果；圖2為來源自海洋青鏘魚肝臟組織的cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果；圖3為來源自海洋青鏘魚肝臟組織的cDNA均一化后的脂糖凝膠電泳結果；
0036]圖4為海洋青鏘魚性腺組織的總RNA 1 %瓊脂糖凝膠電泳結果；
圖5為來源自海洋青鏘魚性腺組織的cDNA的瓊脂糖凝膠電泳結果；圖6為來源自海洋青鏘魚性腺組織的cDNA均一化后的瓊脂糖凝膠電泳結果；圖7為海洋青鏘魚肝臟組織的均一化cDNA文庫插入片段鑒定結果；圖8為海洋青鏘魚肝臟組織的均一化cDNA文庫的克隆12在基因庫中比對結果。
具體實施例方式以下結合具體實施例詳細說明本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例一海洋青鏘魚肝臟組織的均一化cDNA文庫的構建本實施例的步驟如下1.海洋青鏘魚的培養(yǎng)海洋青鏘魚來源于臺灣地區(qū)的商業(yè)性養(yǎng)殖場，由香港城市大學生物與化學系購買 并贈予。海洋青鏘魚的實驗室培養(yǎng)條件為海水的溶解氧水平5. 0-7. Omg/L，水溫28士2°C， 密度設置每條魚0. 3-0. 5L，鹽濃度30mg/L，光照周期為14h照明/10h暗室，每天喂食5次， 性別比例雄性雌性=1 1.5。實驗選取性成熟的、身長3. 5-4cm的成體魚作為研究對象。2.海洋青鏘魚肝臟組織的分離選取10條成體海洋青鏘魚，包括5條雌性和5條雄性，迅速斷頭處死，以PBS緩沖 液沖洗2次，無菌操作分離肝臟組織，置于含有緩沖液的瓶皿中，緩沖液清洗2次，轉移至 Eppendorf管中，2000rpm/min低速離心收集肝臟組織。3.肝臟組織的總RNA提取按照Invitrogen公司的Trizol 試劑總RNA提取操作指南，勻漿肝臟組織，從肝 臟組織中提取總RNA。總RNA樣品的瓊脂糖凝膠電泳如附圖l，28SrRNA和18S rRNA條 帶明亮清晰，5S rRNA條帶較弱，說明總RNA完整性較好。M為分子量標準。4.CDNA雙鏈的合成按照Clontech 公司 cDNA 文庫構建試劑盒(SMART cDNA library constructionkit)說明書推薦的方法，用Oligo d(T)作為反轉錄引物，反應體系中加入 SMART-Sfi 1A寡核苷酸和⑶S-Sfi IB引物，在反轉錄得到cDNA第一條鏈的同時分別引入 SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2序列。采用LD-PCR方法，再加入SMARTPCR引物，引入SEQ ID No. 3序列，擴增cDNA，循環(huán)數(shù)為18。如附圖2所示為擴增后cDNA的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖， 可見500bp-3000bp之間亮度不同的彌散條帶，M為分子量標準。擴增后按照QIAGEN公司 的PCR產(chǎn)物純化試劑盒(QIAquick PCR Purification Kit)的說明書純化PCR產(chǎn)物，乙醇 沉淀純化產(chǎn)物，超純水溶解DNA沉淀至50ng/ul。5. cDNA 的均一化取150ng 純化的雙鏈 cDNA，加入 lul 4x 雜交緩沖液(200Mm HEPES-HC1，pH 8. 0 ； 2M NaCl)，95°C變性 5min 后，68°C雜交 4h。加入 68°C預熱的 3. 5ul 超純水，lul 5x DNAse buffer (500mM Tris_HCl，pH 8. 0 ；50Mm MgC12, lOmM DTT)和0.5ul DSN酶，68°C孵育30min， 95°C 孵育 7min。6.均一化后cDNA的擴增cDNA樣本以40ul超純水稀釋后，取lul稀釋液，加入0. 3uM SMART PCRPrimer,按照Clontech公司Advantage 2 Polymerize說明書的方法進行擴增，反應體積為50ul，循環(huán) 數(shù)為18。如附圖3所示為均一化后的cDNA的瓊脂糖凝膠電泳圖，可見500bp-3000bp 之間的彌散條帶亮度比較均一，M為分子量標準。7.均一化cDNA文庫的構建擴增的cDNA純化后以限制性內(nèi)切酶Sf i 1消化，再按照BD公司的BDCHR0MA SPIN-1000 column分離，改良的pAL17載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sfi 1消化，在BioRad電脈沖 轉化儀的作用下，轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，在37°C LB培養(yǎng)板上培養(yǎng)，至克隆長出。 取出凍存管，加入凍存液，收集培養(yǎng)板上的克隆，混勻，分裝成lml，-80°C凍存。取lOOul凍 存文庫，分別稀釋100，1000,10000倍，取lOOul涂板于LB培養(yǎng)基上至克隆長出。計數(shù)長出 的克隆數(shù)(cfu)。文庫大小為lX107cfu/ml。實施例二海洋青鏘魚性腺組織的均一化cDNA文庫構建選10條成體海洋青鏘魚，包括5條雌性和5條雄性，迅速斷頭處死，以PBS緩沖 液沖洗2次，無菌操作分離性腺組織，置于含有緩沖液的瓶皿中，緩沖液清洗2次，轉移至 Eppendorf管中，2000rpm/min低速離心收集混合的性腺組織。其他步驟同實施例一。附圖4為海洋青鏘魚性腺組織的總RNA1 %瓊脂糖凝膠電泳結果，其中28SrRNA和 18S rRNA條帶明亮清晰，5S rRNA條帶較弱，說明總RNA完整性較好。 海洋青鏘魚性腺組織cDNA文庫LD-PCR擴增產(chǎn)物均一化前和均一化后的1 %瓊脂 糖電泳結果見附圖5和附圖6，可見500bp-3kb之間的彌散條帶在均一化后亮度比較一致。 上樣量為每泳道5ul PCR產(chǎn)物，M為分子量標準。文庫大小為7 X 105cfu/ml。實施例三海洋青鏘魚肝臟組織的均一化cDNA文庫的鑒定從LB培養(yǎng)板上隨機挑選22個克隆，接種與10ml LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)28h，收 集培養(yǎng)物，采用SEQ ID No.4*SEQ ID No. 5序列引物對插入片段進行擴增，擴增條件為 95°C，30秒；65°C，30秒；72°C，3分鐘；30個循環(huán)。產(chǎn)物5ul進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，觀 察插入片段大小，結果見附圖7，隨即挑選的22個克隆，均具有插入片段，其插入片段大小 為從500bp-3kb大小不等的片段，多集中在lkb-2kb在左右。同時測序，測序引物序列為 SEQ ID No.4和SEQ IDNo. 5，測序結果在基因庫中進行比對，其中1個測序結果與基因序列 gb | EF392364. 11 99%—致，圖8為基因庫中比對結果。序列表
SEQ ID No. 1
aagcagtggt atcaacgcagagtggccattacggccggg
SEQ ID No. 2
aagcagtggt atcaacgcagagtggccgaggcggcccttt tttttttttt tt
SEQ ID No. 3
aagcagtggt atcaacgcagagt
SEQ ID No. 4
gtattctata gtgtcaccta
SEQ ID No. 5
gtaatacgac tcactata
權利要求
一種海洋青鳉魚(Oryzias Melastigma)特異性組織的均一化cDNA文庫。
2.根據(jù)權利要求1所述的海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫，其特征在于該文 庫是從海洋青鏘魚的特異性組織制備的。
3.根據(jù)權利要求2所述的海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫，其特征在于該文 庫是從海洋青鏘魚的性腺、肝臟、腎臟、鰓、鱗、腦、心肌、肌肉、骨骼等一種或幾種特異性組 織制備的。
4.根據(jù)權利要求1至3任一所述的海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫的制備 方法，其特征在于包括如下步驟a)提取海洋青鏘魚特異性組織的總RNA，b)合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，c)cDNA變性后再重新雜交，d)雙鏈成分的選擇性降解，e)均一化后cDNA成分的PCR擴增，f)擴增產(chǎn)物插入載體。
5.根據(jù)權利要求4所述的海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫的制備方法，其 特征在于，在合成cDNA第一鏈時引入SEQ ID No. 1序列和SEQ ID No. 2序列，在合成雙鏈 cDNA時引入SEQ ID No. 3序列，用SMART方法PCR擴增cDNA多核苷酸產(chǎn)物。
6.根據(jù)權利要求4所述的海洋青鏘魚特異性組織的均一化cDNA文庫的制備方法，其特 征在于cDNA變性再重新雜交形成新的cDNA雙鏈后，經(jīng)過雙鏈特異性核酸酶DSN消化，選擇 性降解了雙鏈cDNA成分，完成了 cDNA的均一化。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種海洋青鳉魚特異性組織的均一化cDNA文庫及制備方法，涉及cDNA文庫領域，具體涉及一種海洋青鳉魚特異性組織的均一化cDNA文庫及制備方法。該文庫是從海洋青鳉魚的一種或幾種特異性組織制備的。所述的均一化cDNA文庫的制備方法包括提取海洋青鳉魚特異性組織的總RNA，合成cDNA多核苷酸產(chǎn)物，cDNA變性后再重新雜交，雙鏈成分的選擇性降解，均一化后cDNA成分的PCR擴增，擴增產(chǎn)物插入載體。本發(fā)明提供的海洋青鳉魚特異性組織的均一化cDNA文庫為大量發(fā)現(xiàn)和研究海洋青鳉魚的表達基因奠定基礎，同時對于深入研究海洋青鳉魚特異性組織的表達標志物具有重要意義。
文檔編號C40B50/06GK101851786SQ20091018883
公開日2010年10月6日 申請日期2009年12月11日 優(yōu)先權日2009年12月11日
發(fā)明者張琦, 方志俊, 曾志雄, 楊夢甦, 胡紹燊, 陳瑤 申請人:香港城市大學深圳研究院