專利名稱：間充質(zhì)干細胞親和肽的篩選與用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術領域，涉及采用噬菌體隨機肽庫對間充質(zhì)干細胞表面親和肽的篩選及篩選出的親和肽的應用。
背景技術：
間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是來源于中胚層的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞。廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。近年報道從早產(chǎn)胎兒臍帶血、臍帶靜脈內(nèi)皮下層、骨膜、肌腱、血管、脂肪組織等亦分離到MSC。MSC具有高分化潛能，其中骨髓間充質(zhì)干細胞在不同的誘導條件下能分化成成熟的間質(zhì)細胞，如成骨細胞、成軟骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、網(wǎng)狀細胞、血管內(nèi)皮細胞等。目前的研究還顯示出MSC的終術分化有可能跨越胚層界限，超越傳統(tǒng)意義上的分化為中胚層來源的間質(zhì)細胞，而向?qū)嵸|(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，如分化為心肌細胞、神經(jīng)細胞等，這一研究成果不僅具有重大的理論意義，其多向分化潛能及其移植時不存在組織配型及免疫排斥等優(yōu)點使其作為組織工程的種子細胞，在骨及軟骨組織損傷的修復、肌肉組織退行性疾病、冠心病等方面提供了良好的治療途徑。MSC易于外源基因的導入和表達，在體外長期培養(yǎng)的過程中始終保持多向分化的潛能，遺傳背景相當穩(wěn)定，因此在組織工程創(chuàng)傷修復、細胞替代治療、支持造血、基因治療等方面的應用前景相當廣闊。間充質(zhì)干細胞的另一特性是具有遷移趨化能力，能夠向腫瘤細胞浸潤的方向遷移，目前國外有許多研究報道以MSC為載體攜帶治療基因?qū)崿F(xiàn)了對腫瘤的靶向治療(Nedime Serakinci，Oncogene，2004，235095-5098；Nakamural K，Gene Therapy，2004，111155-1164)，這些研究結(jié)果為以MSC為細胞載體的靶向治療提供了實驗依據(jù)。
常用的分離MSC的方法有全骨髓法和離心法，全骨髓法即根據(jù)干細胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細胞，如造血系細胞等，達到分離純化MSC的目的。離心法即根據(jù)細胞成分比重的不同，提取單核細胞進行貼壁培養(yǎng)，但獲取高純度MSC的時間較長。為了獲得更高純度的MSC，有人利用流式細胞儀法、免疫磁珠法等對MSC進行分離純化，但是所需儀器設備昂貴。
噬菌體展示隨機多肽庫技術是以噬菌體展示技術(phage display)為基礎的。1985年由Smith(Smith GP.，Science，1985，2281315-1317)首次通過基因工程手段將外源蛋白質(zhì)與噬菌體的次要外殼蛋白pIII形成融合蛋白展示于噬菌體顆粒表面，可保持相對獨立的空間構(gòu)象和生物活性，而不影響重組噬菌體對宿主菌的感染能力。與其他基因表達系統(tǒng)相比較，噬菌體展示技術的最大特點就是它有效地將被展示多肽或蛋白質(zhì)和基因偶聯(lián)起來，構(gòu)成一個實體，因而在得到某種多肽結(jié)構(gòu)的同時也就獲得了它的基因。
噬菌體展示隨機肽庫的篩選是一個親和純化(affinity purification)的生物淘選(biopanning)過程。其具體過程是先將噬菌體肽庫與靶分子相互作用一段時間，接著洗滌除去非特異結(jié)合噬菌體，將特異性結(jié)合噬菌體洗脫下來擴增，然后再投入下一輪的淘選。繼續(xù)重復淘選、洗脫、擴增，最終淘選出特異結(jié)合的重組噬菌體克隆。通過分析所篩選到的肽的結(jié)構(gòu)和序列，為蛋白質(zhì)分子之間(如抗原與抗體、受體與配體、酶與底物)的相互作用機理提供理論依據(jù)，同時篩選到有功能的活性肽可以進入臨床的應用與開發(fā)。
以往采用噬菌體隨機肽庫技術研究受體與配體的相互作用大多以純化的受體分子篩選肽庫，從而獲得與受體分子結(jié)合的肽段，而當對某一受體分子的結(jié)構(gòu)信息了解不多，以及在細胞膜表面受體未知的情況下，獲得純化的天然受體分子將十分困難，而且純化的受體分子還可能失去其天然構(gòu)象與功能，此時，采用表達該受體的完整細胞作為篩選靶標不失為一種簡便的選擇。目前，用于篩選噬菌體隨機肽庫技術的細胞包括轉(zhuǎn)染受體基因的細胞、血小板、外周血中性粒細胞及體外培養(yǎng)的腫瘤細胞等。
本發(fā)明的目的在于提供一種利用噬菌體隨機肽庫體外篩選細胞表面親合肽的技術，并獲得了能夠與間充質(zhì)干細胞結(jié)合的環(huán)七肽氨基酸序列，利用本發(fā)明篩選到的小肽將其連接于固相支持物上可用于MSC的篩選、分離和純化，與熒光標記物聯(lián)接后可用于制備MSC的示蹤劑，可作為MSC與藥物間的載體可用于制備靶向治療的制劑。本發(fā)明將在制備腫瘤靶向治療藥物、藥物篩選、細胞體內(nèi)示蹤及細胞分選中具有極佳的應用前景，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術途徑是首先分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，當細胞處于對數(shù)生長期并長滿瓶底時，用環(huán)七肽庫進行親和篩選，通過加強篩選強度，經(jīng)三輪篩選，ELISA鑒定，獲得親和性較強的克隆，測序并進行序列分析。用流氏方法對合成的肽進行親和性鑒定。具體的技術方案如下(1)間充質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)1)間充質(zhì)干細胞可來源于鼠的骨髓，人的骨髓、外周血、胚胎、臍血等。
2)人骨髓間充質(zhì)干細胞的分離無菌條件下，經(jīng)雙側(cè)髂后上棘穿刺，采集骨髓，經(jīng)Percoll(美國，Sigma公司產(chǎn)品，相對密度1.073g/ml)密度梯度離心后收集人骨髓單個核細胞，貼壁培養(yǎng)72h，去除懸浮細胞后貼壁生長的即為骨髓間充質(zhì)干細胞。培養(yǎng)傳代的細胞形態(tài)如附圖1所示。
3)鼠間充質(zhì)干細胞的分離無菌條件下分離股骨脛骨，沖出骨髓，吹打成細胞懸液，離心，棄上清，PBS重懸細胞，將細胞懸液貼壁輕輕加入到預置等體積淋巴細胞分離液(美國，Sigma公司產(chǎn)品，相對密度1.083g/ml)的離心管中，使懸于上層，離心，收集云霧狀白膜層的單個核細胞于另一離心管中，PBS洗滌后，貼壁培養(yǎng)72h，去除懸浮細胞后貼壁生長的即為骨髓間充質(zhì)干細胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)后得到逐步純化。
(2)間充質(zhì)干細胞表面標志與純度的鑒定取第3代培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞，胰酶消化收集細胞，離心。以PBS洗滌細胞2～3次后，用1ml PBS重懸細胞，計數(shù)。用PBS調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，按5×105個細胞/管將細胞平均分至多個EP管中，分別將PE或FITC標記的多個抗體進行組合，加入各管中，室溫下孵育20～30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細胞后，用流式細胞儀對培養(yǎng)擴增細胞的表面標志進行檢測和鑒定。
(3)噬菌體隨機肽庫篩選1)噬菌體隨機肽庫可以是商品化的十二肽庫(Ph.D.-12TM Phage Display PeptideLibrary Kit)、七肽庫(Ph.D.-7TM Phage Display Peptide Library Kit)和環(huán)七肽庫((Ph.D.-C7CTM Phage Display Peptide Library Kit)及其自己構(gòu)建的不同長度的肽庫。
2)抑制二硫鍵的環(huán)七肽庫(Ph.D.-C7C)所展示的多肽兩側(cè)各加了一個半胱氨酸。噬菌體組裝時經(jīng)過氧化，形成環(huán)化的多肽。一般肽庫的庫容量受電轉(zhuǎn)條件的限制，最高可達109庫容，足以覆蓋7肽的組合概率，但只能覆蓋部分12肽的組合概率。另外，7環(huán)肽庫由于肽的環(huán)化，增強了其空間構(gòu)象，使之更容易與受體牢固結(jié)合。因此選用7環(huán)肽庫更容易篩選到與MSC親和的肽，這是本發(fā)明的一個特別優(yōu)選肽庫。
3)篩選方法首先于平板或培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)貼壁的間充質(zhì)于細胞，至間充質(zhì)干細胞對數(shù)生長期且密度為90％時，除去培養(yǎng)液，PBS洗滌；加入含噬菌體肽庫的無血清培養(yǎng)液，37℃孵育15min～1h；吸除含噬菌體肽庫的無血清培養(yǎng)液，用含有0.1％～0.5％吐溫20(Tween 20)的PBS洗滌細胞3～6次；最后用pH2.2的甘氨酸緩沖液洗下與細胞表面強結(jié)合的噬菌體，并迅速用Tris(pH9.8)緩沖液中和后，留10μl進行滴度測定，剩余轉(zhuǎn)入新鮮菌液(ER2738)中，37℃孵育15min～30mm，然后37℃劇烈振搖4～5h擴增噬菌體，PEG法提純，再進入下一輪篩選。計數(shù)每次篩選后及擴增后的噬菌體數(shù)目。為提高噬菌體展示肽與細胞的親和性，在隨后的篩選過程中逐步減少噬菌體與細胞的結(jié)合時間，并增強洗滌強度。
(4)噬菌體滴度測定每一輪的篩選都需測定投入和產(chǎn)出噬菌體的滴度，并計算收率。將待測噬菌體按梯度(1∶10～1∶108)稀釋，加到含有宿主菌E.coliER2738(OD＝0.2～0.3)的LB中，加入溶化的上層瓊脂中混勻鋪于37℃預熱的底層平板中。于37℃培養(yǎng)過夜，計算其克隆數(shù)及噬菌體滴度(TU)。TU/L＝＝藍斑數(shù)×稀釋倍數(shù)×105。
(5)噬菌斑的擴增及噬菌體陽性克隆的鑒定將最后一輪洗脫的噬菌體鋪平板，在IPTG/X-gal瓊脂板上隨機挑選幾十個分隔良好的藍色噬菌體斑加入含有宿主菌(如ER2738)的抗性培養(yǎng)基中37℃劇烈振搖4～5h擴增噬菌體，離心取上清，復離心一次，取80％上清，4℃保存或加入甘油至終濃度50％后，-20℃保存。單克隆上清測定滴度后進行EL ISA鑒定。
將分離純化的MSCs細胞接種于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞生長良好至單層貼壁鋪滿板底時，用PBS沖洗2次，固定液固定(如0.25％的戊二醛、10％甲醛、丙酮等)；用PBS沖洗2次，3％雙氧水處理細胞內(nèi)源性過氧化物酶的活性；PBS沖洗后封閉液(如2～5％脫脂奶、0.1％～0.5％BSA)4℃封閉過夜或37℃封閉1h～3h；每孔加入純化的噬菌體(1×108～1×1010pfu)孵育1h～3h，并以野生型M13噬菌體和PBS為對照；用含有0.05％～0.3％吐溫20(Tween20)的PBS洗滌細胞3～6次；每孔加入辣根過氧化酶(HRP)標記的抗M13噬菌體mAb(1∶2000～1∶5000稀釋)50μL，孵育1h～3h；用含有0.05％～0.3％吐溫20(Tween 20)的PBS洗滌細胞3～6次，顯色劑(如四氨基聯(lián)苯胺(TMB)、鄰苯二胺(OPD)等顯色后測A450nm.。計算均值±標準差，從上述篩選獲得的噬菌體克隆中挑選陽性克隆。
(6)陽性噬菌體克隆DNA序列測定及分析參照噬菌體單鏈DNA抽提試劑盒提取ssDNA，將沉淀溶于30μl超純水中。取5μlssDNA進行電泳分析，剩余噬菌體ssDNA進行序列測定，比較序列中氨基酸出現(xiàn)的比率及規(guī)律。
(7)多肽的設計、合成選擇測序結(jié)果中出現(xiàn)頻率最高及ELISA陽性強的序列作為合成肽的模板。合成肽采用質(zhì)譜分析確定準確度和純度。根據(jù)需要可對合成肽進行標記(如FITC、Cy5.5等)。
(8)合成肽與MSC的親和性檢測可有多種方法檢測合成肽與MSC的親和性1)與野生型噬菌體M13的競爭結(jié)合試驗將陽性噬菌體克隆擴增后分別與野生型M13噬菌體以1∶1的比例混合加入到已長有間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)板中進行前述的篩選過程。由于野生型M13不含LacZ基因，故在IPTG/X-gal瓊脂板上不能顯示藍色斑，因此分別計數(shù)藍、白斑數(shù)目，并按照下面方法計算其相對與野生型M13噬菌體的結(jié)合能力(Zhang JB，Cancer Lett，2001，171(2)153-164.)相對結(jié)合力＝投入的M13×產(chǎn)出的肽庫噬菌體/產(chǎn)出的M13×投入的肽庫噬菌體2)流氏檢測將培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞用胰酶消化，PBS洗滌后與熒光標記(如FITC、Cy5.5等)的合成肽在37℃孵育20min～30min，陰性對照采用不加合成肽的MSC。PBS洗滌三次之后，流氏檢測熒光標記的比率與強度。


圖1人骨髓間充質(zhì)干細胞的形態(tài)(×100)圖2大鼠間充質(zhì)干細胞的形態(tài)(×100)圖3大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞流氏鑒定(1)FITC-CD90陽性表達(2)FITC-CD45陽性表達(3)PE-CD31陽性表達(4)FITC-CD44陽性表達圖4陽性克隆噬菌體克隆的DNA電泳分析圖5FITC標記合成肽與大鼠MSC結(jié)合的熒光觀察圖6FITC標記合成肽與大鼠MSC結(jié)合的流氏分析(1)大鼠腦膠質(zhì)瘤9L細胞陰性對照(2)大鼠腦膠質(zhì)瘤9L細胞與FITC標記合成肽的結(jié)合(3)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞陰性對照(4)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與FITC標記合成肽的結(jié)合表1陽性噬菌體的富集表2陽性噬菌體克隆的EL ISA法鑒定表38個陽性噬菌體克隆的氨基酸序列具體實施方案結(jié)合

本發(fā)明的具體實施方法如下實施例1、以大鼠為例說明MSC的分離培養(yǎng)本實施例的實驗步驟如下選用6周齡健康wistar大鼠(約150克，雌雄不限)，無菌條件下分離股骨、脛骨，沖出骨髓，吹打成細胞懸液，1200rpm，離心5min。棄上清，PBS重懸細胞，將細胞懸液貼壁輕輕加入到預置等體積淋巴細胞分離液(比重1.083)的離心管中，使懸于上層，1800rpm，離心25min。收集云霧狀白膜層的單個核細胞于另一離心管中，PBS洗滌一次(1200rpm離心5min)，棄上清，用含10％新生小牛血清L-DMEM重懸。以1×105/ml接種細胞于培養(yǎng)瓶中，于飽和溫度、37℃、pH7.2條件下培養(yǎng)于5％CO2恒溫培養(yǎng)箱。3d時首次換液，以后每周換液兩次，待細胞接近90％融合時，胰蛋白酶消化，1×104/ml傳代，標記為第一代，倒置顯微鏡逐日觀察，待細胞鋪滿瓶底時，重復上述操作，反復傳代擴增，每次傳代用0.25％胰蛋白酶消化2～3min，嚴格控制酶的量和消化時間，將MSC與可能混雜的淋巴細胞、單細胞分開，從而得到純化的MSC(見圖2)。
實施例2、大鼠骨髓MSC表面標志與純度的鑒定取第4代培養(yǎng)擴增的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，0.25％胰酶消化收集細胞，1200rpm離心5min。以PBS洗滌細胞2次后，用1ml PBS重懸細胞，計數(shù)。用PBS調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml，按5×105個細胞/管將細胞平均分至多個EP管中，分別將PE或FITC標記的多個抗體CD90、CD45、CD44和CD31(Peprotech公司產(chǎn)品)各5μl加入各管中，室溫下孵育30min，然后用PBS洗2遍，加入0.5ml PBS重懸細胞后，用流式細胞儀對培養(yǎng)擴增細胞的表面標志進行檢測和鑒定。結(jié)果顯示，培養(yǎng)擴增的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞CD90、CD45、CD44和CD31表達陽性(見圖3)。
實施例3、MSC親和肽的篩選本實施例的實驗步驟如下將分離純化的第2代或第3代的MSC接種在加有L-DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)的6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)2d，待細胞生長良好至單層貼壁鋪滿板底時，吸取培養(yǎng)液，用L-DMEM培養(yǎng)基沖洗2次，加入1ml含10μL Ph.D.-C7C噬菌體肽庫的原液(滴度為6.5×1012pfu/mL)L-DMEM培養(yǎng)基于37℃孵育1h。用含有0.1％Tween20的PBS液洗滌4次，每次1min。去除與MSC非特異結(jié)合的噬菌體，然后每孔加入1mL pH2.2的甘氨酸緩沖液于冰上放置8min，并不時搖動以使洗脫出結(jié)合到細胞表面的噬菌體。吸出洗脫下來的噬菌體，迅速用Tris(pH9.8)緩沖液中和。留10μl進行滴度測定，剩余轉(zhuǎn)入20ml含有4ml新鮮菌液(ER2738，OD＝0.2～0.4)的LB(四環(huán)素抗性)培養(yǎng)液中，37℃孵育15min，然后37℃劇烈振搖4～5h擴增噬菌體，PEG法提純，再進入下一輪篩選。計數(shù)每次篩選后及擴增后的噬菌體數(shù)目。每輪陽性噬菌體的富集情況見表1。為提高特異性，第2，3，4輪逐步減少噬菌體與細胞的結(jié)合時間(45min，30min，15min)，增強洗脫弱親和力的噬菌體(0.1％PBST，0.2％PBST，0.3％PBST)經(jīng)4輪洗脫-擴增-洗脫的篩選過程后，將第4輪洗脫的噬菌體鋪平板，在IPTG/X-gal瓊脂板上隨機挑選30個分隔良好的藍色噬菌體斑進行大量擴增提純，用于EILSA陽性克隆鑒定。
表1

實施例4、噬菌斑的擴增及噬菌體陽性克隆的鑒定挑取在LB(Tet抗性)生長的ER2738單克隆于LB(Tet抗性)培養(yǎng)基中擴增至OD＝0.4～0.5，用LB(Tet抗性)培養(yǎng)液1∶10稀釋，每個試管中加入2ml。分別從4輪篩選后測定滴度的平板上隨機挑取50個藍斑進行擴增，37℃，250rpm，振搖5h；培養(yǎng)液4℃，10000rpm，離心5min，取上清重復離心一次，取80％上清，4℃保存或加入甘油至終濃度50％后，-20℃保存。單克隆上清測定滴度后進行EL ISA鑒定。
噬菌體ELISA將分離純化的第2代或第3代的MSC接種在加有L-DMEM培養(yǎng)基(含10％胎牛血清)的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，待細胞生長良好至單層貼壁鋪滿板底時，吸取培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，0.25％的戊二醛4℃固定30min，用PBS沖洗2次，加入雙氧水(10μLH2O2/10ml PBS)常溫作用30min去除內(nèi)源性過氧化物酶。PBS沖洗2次，加入2％脫脂奶，4℃封閉過夜。每孔加入純化的噬菌體1×109，室溫孵育2h。0.1％PBST洗4次，每孔加入1∶2000稀釋的HRP標記抗M13噬菌體mAb(New England Biolabs)50μL，室溫孵育2h。0.1％PBST洗4次，TMB顯色后測A450nm。每個克隆均設6個平行孔，以包被PBS為陰性對照，同時以M13為對照，計算均值±標準差。從上述篩選獲得的噬菌體克隆中挑選陽性克隆比對照值＞2者，共獲得8個陽性克隆(表2)。
表2

實施例5、單鏈DNA提取與鑒定對陽性噬菌體克隆進行擴增，即取50μL單克隆上清加入到5ml含有ER2738的抗性培養(yǎng)基中37℃，250rpm，培養(yǎng)5h；培養(yǎng)液4℃，10000rpm，離心5min，取上清重復離心一次，取80％上清。取1ml噬菌體上清，加入400μLPEG，4℃ 10min沉淀噬菌體；4℃，12000rpm離心10min，獲得噬菌體沉淀；加入200μL Loddie Buffr(10mMTris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，4M NaCl，常溫閉光保存)重旋噬菌體；加入500μL乙醇，混勻室溫放置10min后室溫12000rpm離心10min，棄上清，用70％乙醇洗滌沉淀，室溫干燥5min，加入30μL DNA Free Warter溶解，取5μL用于電泳分析，其余用于序列測定。從電泳圖(圖4)可見提取8個陽性克隆的ssDNADNA條帶為3.4kb，證實提取的是噬菌體的ssDNA。
實施例6、陽性克隆DNA測序及多肽氨基酸序列分析對8個陽性克隆的ssDNA由上海生工生物工程技術服務有限公司進行DNA測序分析，其編碼氨基酸序列見表3。對8個陽性克隆的氨基酸進行對比分析，發(fā)現(xiàn)Asn、Lys、Thr、Ser在篩選的陽性克隆中出現(xiàn)的幾率較大，因此選用Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu進行化學合成。為了便于檢測，對此肽加入FITC作為熒光標記，由北京中科亞光生物科技有限公司合成的序列為FITC-Ahx-Cys-Ser-Thr-Asn-Pro-Lys-Val-Leu-Cys。
表3

實施例7、合成肽對MSC親和性的檢測1×104的MSC接種于96孔板，長至90％密度后，去除培養(yǎng)液，用100μL含有100μMFITC標記肽的無血清培養(yǎng)液中，37℃孵育30min，熒光顯微鏡檢測可見100％細胞呈現(xiàn)綠色熒光，見圖5。
用流氏細胞儀檢測合成肽對MSC的親和性，步驟如下分離純化的的Wistar大鼠MSC，2×105消化后用PBS沖洗一遍，加入200μL濃度為100μM的合成肽，37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min，用PBS沖洗2遍，1％多聚甲醛固定后進行流氏檢測，設立陰性對照除自身對照外，還以隨機不相干的膠質(zhì)瘤細胞9L為陰性對照。流氏檢測結(jié)果顯示幾乎100％MSC標記上綠色熒光，熒光強度為自身陰性對照的29.7倍，為陰性對照的3.8倍，說明合成肽對MSC有結(jié)合特異性。見圖6。
序列表<210>1<211>21<212>DNA<400>1ctatcaggct tattctgatc a21<210>2<211>21<212>DNA<400>2agcgacctct tcttatgctc a21<210>3<211>21<212>DNA<400>3agctgcttag gcttccaaga c21<210>4<211>21<212>DNA<400>4tcactaggcg acgccgtcga c21<210>5<211>21<212>DNA<400>5ttatgctaat catcctcact a21<210>6<211>21<212>DNA<400>6tgagactgat taataagcag c21
<210>7<211>21<212>DNA<400>7agcggaaaat tatgcttccg c21<210>8<211>21<212>DNA<400>8agcctactag tctcctccaa c2權利要求
1.一組能與間充質(zhì)干細胞(MSC)高親和力結(jié)合的小肽，其氨基酸序列從N末端到C末端為AspSer ProAsnLys Thr SerSerLeu GluLysAsn Thr SerSerThr AsnProLys Val LeuSerAsp ProLeuArg Gln LeuAsnThr IleMetArg Ser AspThrLeu ThrAsnTyr Ser SerSerPro PheAsnThr Lys AlaSerAsp AspGlnIle Ile Trp。
2.根據(jù)權利要求1所述小肽的反向序列，其氨基酸序列從N末端到C末端為SerThrLysAsn ProSerAspSerThrAsnLys GluLeuSerLeuValLysPro AsnThrSerLeuGlnArgLeu ProAspSerAspSerArgMet IleThrAsnSerSerTyrAsn ThrLeuThrAlaLysThrAsn PheProSerTrpIleIleGln AspAspSer。
3.根據(jù)權利要求1所述小肽，其特征在于所述的小肽的基因是下列核苷酸序列之一1)序列表中序列1～8的DNA序列；2)與序列表中序列1～8限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權利要求1所述小肽的融合蛋白。
5.與MSC具有高親和性的小肽的用途，其特征在于通過與MSC的高親和性，將此肽連接于固相支持物上可用于MSC的篩選、分離和純化。
6.與MSC具有高親和性的小肽的用途，其特征在于作為MSC與藥物間的載體可用于制備靶向治療的制劑。
7.與MSC具有高親和性的小肽的用途，其特征在于與熒光標記物聯(lián)接后可用于制備MSC的示蹤劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及細胞、多肽生物技術領域。本發(fā)明的目的在于篩選到一種與MSC強結(jié)合的小肽用于MSC的分離純化及作為載體用于靶向治療制劑的制備。本發(fā)明所述的MSC親和肽序列為富含Ser、Thr、Asn、Lys的環(huán)七肽序列。本發(fā)明利用噬菌體展示技術通過與MSC進行親和篩選，最終在隨機環(huán)7肽庫中篩選到能夠和MSC強結(jié)合的小肽。利用本發(fā)明篩選到的小肽將其連接于固相支持物上可用于MSC的篩選、分離和純化，與熒光標記物聯(lián)接后可用于制備MSC的示蹤劑，可作為MSC與藥物間的載體可用于制備靶向治療的制劑。本發(fā)明將在制備腫瘤靶向治療藥物、藥物篩選、細胞體內(nèi)示蹤及細胞分選中具有極佳的應用前景，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。
文檔編號C40B30/04GK1978463SQ20051012797
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權日2005年12月9日
發(fā)明者裴雪濤, 趙敬湘, 楊麗平, 王韞芳, 閆舫, 師偉, 秦立蓬, 管利東 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所