基于固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明為一種基于固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法。具體地說(shuō)，是將混合蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)作用鍵合到固相載體上作為篩選庫(kù)，將該蛋白庫(kù)與蛋白酶孵育，蛋白庫(kù)中蛋白酶的底物蛋白被酶切后所產(chǎn)生的肽段進(jìn)入溶液，非底物蛋白不能被酶切而完整的保留在固相載體上，固液分離后，采用生物質(zhì)譜進(jìn)行溶液中底物肽段的定性定量鑒定，從而得到特異性蛋白酶的底物蛋白信息。本發(fā)明是利用蛋白酶與其底物的高度特異性作用，以及固液分離的簡(jiǎn)便性，將底物蛋白從固載的混合蛋白庫(kù)中篩選出來(lái)的方法?！緦?zhuān)利說(shuō)明】基于固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明是一種基于固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法。蛋白酶酶切其底物具有高特異性和高選擇性。固載在固相載體上的蛋白庫(kù)中的底物蛋白能夠被蛋白酶酶切，產(chǎn)生的肽段進(jìn)入溶液，而非底物蛋白不能被酶切仍舊保留在固相載體上，通過(guò)固液分離法即選擇性地將底物的酶切肽段與非底物蛋白進(jìn)行分離，結(jié)合生物質(zhì)譜進(jìn)行底物蛋白定性定量分析，從而得到特異性蛋白酶的底物蛋白?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]蛋白酶作為生命體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)酶，參與細(xì)胞增值、分化、凋亡等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在生物體特定的生理?xiàng)l件下，蛋白酶被激活，酶切底物蛋白，調(diào)節(jié)生命活動(dòng)的整個(gè)過(guò)程。蛋白酶的異常激活可以產(chǎn)生異常的細(xì)胞增值和存活信號(hào)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，對(duì)于蛋白酶底物的研究，有利于了解其參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白種類(lèi)及相互作用關(guān)系，并進(jìn)一步闡述機(jī)理。[0003]通常大規(guī)模篩選蛋白酶底物的方法，分為兩種，一種是基于凝膠電泳的方法，另一種是基于蛋白質(zhì)端基標(biāo)記的方法。基于凝膠電泳的方法(文獻(xiàn)1:1dentificat1nofcaspase-3degradomebytwo-dimens1nalgelelectrophoresisandmatrix-assistedlaserdesorpt1n/1nizat1n-timeofflightanalysis.Proteomics2004，4(11)，3429-3436.文獻(xiàn)2:Shotgunproteomeanalysisofproteincleavageinapoptoticcells.Proteomics2005,5，21232130.文獻(xiàn)3:Globalmappingofthetopographyandmagnitudeofproteolyticeventsinapoptosis.Cell2008，134,679691.)，是利用體外或者體內(nèi)蛋白酶酶切的實(shí)驗(yàn)組和未酶切的對(duì)照組在SDS-PAGE膠上的位置不同進(jìn)行比較分析，尋找差異的蛋白酶的底物蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。由于疏水性強(qiáng)、難溶的、極堿性的蛋白以及分子量很高或很低的蛋白難以實(shí)現(xiàn)較好的膠上分離、分辨分析，而且凝膠電泳實(shí)驗(yàn)整個(gè)處理過(guò)程繁瑣，對(duì)實(shí)驗(yàn)者操作技能要求較高，因此該方法應(yīng)用受到限制。而基于蛋白質(zhì)端基標(biāo)記的底物篩選方法(文獻(xiàn)4:Aquantitativeproteomicsdesignforsystematicidentificat1nofproteasecleavageevents.Mol.Cell.Proteomics2010,9(10),2327-2333.文獻(xiàn)5:GlobalSequencingofProteolyticCleavageSitesinApoptosisbySpecificLabelingofProteinNTermin1.Cell2008,134(5)，866-876.)，是將體外或者體內(nèi)蛋白酶酶切反應(yīng)后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分別引入不同的端基標(biāo)記分子，然后進(jìn)行選擇性分離富集，將蛋白酶酶切底物的端基標(biāo)記肽段篩選出來(lái)進(jìn)行分析鑒定。該方法對(duì)于酶切位點(diǎn)的定位更加準(zhǔn)確可靠，因而得到了迅速的發(fā)展。然而，該方法所產(chǎn)生的端基標(biāo)記的酶切肽段受大量背景肽段干擾，需要選擇性較好的富集材料和標(biāo)記定量方法，還要進(jìn)行樣品除鹽等多步操作，容易產(chǎn)生樣品損失，弓丨入一定的誤差。[0004]上述文獻(xiàn)對(duì)固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法未作任何記載，也未作任何啟示。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種準(zhǔn)確、可靠、操作簡(jiǎn)單的蛋白酶底物的篩選方法，該方法可適用于大規(guī)模蛋白酶底物的體外篩選。[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人仔細(xì)研究了固載的混合蛋白庫(kù)與蛋白酶的特異性酶切作用，發(fā)現(xiàn)只有底物蛋白才能被酶切，產(chǎn)生的肽段從固相載體上釋放進(jìn)入溶液，而非底物蛋白由于不能被酶切而保留在固相載體上，從而實(shí)現(xiàn)底物蛋白肽段與非底物蛋白的分離，有效降低了非底物蛋白的背景干擾。[0007]因此，本發(fā)明提出一種基于固載的混合蛋白質(zhì)為篩選庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法。該方法采用的技術(shù)方案為:[0008]一種篩選蛋白酶底物的方法，將蛋白質(zhì)固載于固相載體上，利用蛋白酶的高特異性酶切反應(yīng)，以及固液分離操作進(jìn)行底物肽段篩選，進(jìn)而通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行底物蛋白的鑒定。[0009]其中蛋白固載于固相載體表面的過(guò)程以及蛋白酶特異性酶切反應(yīng)的過(guò)程可按本領(lǐng)域常規(guī)方法操作。[0010]所述載體為瓊脂糖微球或酰肼微球，蛋白固載于瓊脂糖微球或酰肼微球上。所用的特異性蛋白酶為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase-3,caspase-7,caspase-2,caspse-8等)、金黃色葡萄菌V8蛋白酶(GluC)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、凝血酶(Thrombin)、彈性蛋白酶(Elastase)、組織蛋白酶(CathepsinG,CathepsinK)等，蛋白酶能夠特異性切割底物蛋白特定位置上的氨基酸位點(diǎn)。利用固載的蛋白庫(kù)和蛋白酶的特異性作用，酶切產(chǎn)生的蛋白酶底物的肽段釋放進(jìn)入溶液中，固液分離后采用質(zhì)譜進(jìn)行定性定量鑒定。固液分離的簡(jiǎn)便性，有效降低了非底物蛋白的背景干擾，避免了樣品除鹽等操作造成的損失，適合規(guī)?；鞍酌傅孜锓治?。[0011]一種基于固載的混合蛋白質(zhì)為蛋白庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法，混合蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)作用鍵合到固相載體上作為篩選蛋白庫(kù)，將該蛋白庫(kù)與特異性蛋白酶孵育，蛋白庫(kù)中與特異性蛋白酶相應(yīng)的底物蛋白被特異性蛋白酶酶切后所產(chǎn)生的肽段進(jìn)入溶液，而蛋白庫(kù)中與特異性蛋白酶不相應(yīng)的非底物蛋白不能被特異性蛋白酶酶切而完整的保留在固相載體上，固液分離后，采用生物質(zhì)譜進(jìn)行底物肽段定性定量分析，從而得到特異性蛋白酶的底物蛋白信息。[0012]蛋白酶與其底物具有高度特異性作用；底物蛋白被酶切后所產(chǎn)生的肽段能夠直接從固相載體上釋放進(jìn)入溶液，非底物蛋白不能被酶切而仍舊完整地保留在固相載體上。[0013]特異性蛋白酶可以是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase-3,caspase-7,caspase-2,caspse-8等)，也可以是金黃色葡萄菌V8蛋白酶(GluC)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、凝血酶(Thrombin)、彈性蛋白酶(Elastase)、組織蛋白酶(CathepsinG,CathepsinK)等中的一種或二種以上。[0014]具體操作過(guò)程為:[0015]I)固載蛋白庫(kù)的構(gòu)建:混合蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)作用鍵合到固相載體上；[0016]2)底物蛋白酶切反應(yīng):將固載的混合蛋白庫(kù)與蛋白酶孵育反應(yīng)后，底物蛋白被酶切后所產(chǎn)生的肽段釋放進(jìn)入溶液，非底物蛋白不能被酶切而完整的保留在固相載體上；[0017]3)底物蛋白分析鑒定:通過(guò)固液分離，得到溶液中的底物蛋白肽段，采用質(zhì)譜進(jìn)行底物肽段的定性定量分析。[0018]所述的混合蛋白質(zhì)為細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)、組織提取的蛋白質(zhì)等中的一種或二種以上。[0019]所述的固相載體是酰肼微球(Aff1-HzhydrazideGel,B1-Rad),蛋白質(zhì)通過(guò)酰肼化學(xué)的方法固載于酰肼微球上。[0020]所述的固相載體是瓊脂糖微球(CNBr-activatedSepharose4B,GEHealthcare),蛋白質(zhì)通過(guò)溴化氫法固載于瓊脂糖微球上。[0021]當(dāng)?shù)鞍酌笧樘於彼崽禺愋园腚装彼岬鞍酌?和7時(shí)，其酶切反應(yīng)條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μI,50mM4_輕乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4),10mM氯化鈉，5mM或1mM二硫蘇糖醇，ImM乙二胺四乙酸，1%或10%(wt/v)鹿糖，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100,在37°C下反應(yīng)Ih以上。[0022]當(dāng)?shù)鞍酌笧辄S色葡萄菌V8蛋白酶、凝血酶、彈性蛋白酶、組織蛋白酶G時(shí)，其酶切反應(yīng)的條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μ8/μl，150mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)，50mM氯化鈉，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100，在37°C下反應(yīng)Ih以上。[0023]當(dāng)?shù)鞍酌笧榛|(zhì)金屬蛋白酶2時(shí)，其酶切反應(yīng)的條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μ1，150mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)，50mM氯化鈉，5mM氯化鈣，10μM氯化鋅，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100,在37°C下反應(yīng)Ih以上。[0024]當(dāng)?shù)鞍酌笧榻M織蛋白酶K時(shí)，其酶切反應(yīng)條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μ1，10mM醋酸鈉(pH=5.5),2.5mM乙二胺四乙酸，2.5mM二硫蘇糖醇，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100，在37°C下反應(yīng)Ih以上。[0025]本發(fā)明所建立的蛋白酶底物的篩選方法是基于蛋白酶與固載的底物蛋白的高特異性作用，以及固液分離的簡(jiǎn)便性雙重特征而進(jìn)行的。該方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、可信度高，可用于生物樣品中高特異性蛋白酶的底物篩選?！緦?zhuān)利附圖】【附圖說(shuō)明】[0026]圖1為瓊脂糖微球固載的混合蛋白庫(kù)用于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)底物的篩選流程圖。[0027]圖2為天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)酶切底物的定量結(jié)果分析。圖2A為所有定量肽段1g2Rat1分布情況。圖2B為所有定量肽段在天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶底物數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布情況。圖2C為所含不同數(shù)目的上調(diào)肽段(1g2Rat1^2.0)的潛在底物蛋白在天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶底物數(shù)據(jù)庫(kù)中的分布情況。[0028]圖3潛在的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)底物蛋白與天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶底物數(shù)據(jù)庫(kù)中已知底物蛋白的比較分析?！揪唧w實(shí)施方式】[0029]本發(fā)明方法的最大特征在于:利用蛋白酶與底物的高特異性酶切作用，以及固液分離的簡(jiǎn)便性，從固載的蛋白庫(kù)中篩選出蛋白酶的底物蛋白。在實(shí)施方式上，可以分成三大步，第一步是固載蛋白庫(kù)的構(gòu)建，即蛋白質(zhì)固載在固相載體上。凡是能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)通過(guò)化學(xué)作用鍵合的固相載體均適用；第二步是蛋白酶體外特異性酶切反應(yīng)。將蛋白酶與固載的蛋白庫(kù)孵育反應(yīng)，只有底物蛋白才能被酶切，從固相載體上釋放，而非底物蛋白由于不能酶被酶切而保留在載體上，然后通過(guò)固液分離得到溶液中的底物蛋白肽段。第三步采用生物質(zhì)譜對(duì)底物蛋白進(jìn)行定性定量分析。若蛋白酶酶切肽段過(guò)大過(guò)長(zhǎng)，超出質(zhì)譜檢測(cè)范圍，需要將蛋白酶酶切肽段進(jìn)行二次酶解之后，再做質(zhì)譜分析。[0030]以下具體介紹基于瓊脂糖微球的蛋白庫(kù)中蛋白酶底物的篩選方法。[0031]蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)瓊脂糖微球固載后用于蛋白酶底物的篩選，以天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)底物的篩選為例說(shuō)明本發(fā)明的蛋白酶底物的篩選方法，蛋白酶酶切的底物肽段用LTQ-OrbitrapXL(Thermo,SanJose,CA)質(zhì)譜檢測(cè)。[0032]附圖1給出了瓊脂糖微球固載的混合蛋白庫(kù)用于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)底物的篩選流程示意圖。為了消除實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中可能產(chǎn)生的自然降解的背景肽段干擾，獲得更加準(zhǔn)確的結(jié)果，本方法設(shè)定對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，并采用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行比較分析。所述方法具體按照以下四個(gè)步驟進(jìn)行:(1)固載蛋白庫(kù)的構(gòu)建。蛋白質(zhì)固載于瓊脂糖微球上作為篩選庫(kù)；(2)蛋白酶特異性酶切反應(yīng)。蛋白庫(kù)分為兩等份，一份不加天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3作為對(duì)照組，用以確定自然降解的背景肽段；另一份加入天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3作為實(shí)驗(yàn)組，用以確定蛋白酶酶切的底物蛋白。酶切反應(yīng)時(shí)，蛋白酶識(shí)別并酶切固載的底物蛋白，產(chǎn)生的肽段進(jìn)入溶液，非底物蛋白不能被酶切，仍舊保留在瓊脂糖微球上，然后離心分離得到溶液中的實(shí)驗(yàn)組底物蛋白酶切肽段和對(duì)照組自然降解的背景肽段。(3)二次酶切。由于天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3直接酶切的底物肽段太長(zhǎng)太大，因此需要進(jìn)行二次酶切。即將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組獲得肽段同時(shí)分別進(jìn)行胰蛋白酶酶解。(4)二甲基標(biāo)記與質(zhì)譜定量分析。按照二甲基標(biāo)記策略，將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行輕、重標(biāo)記。待標(biāo)記完全，二者混合除鹽后，按照定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，用LTQ-OrbitrapXL質(zhì)譜檢測(cè),用Mascot(vers1n2.1)、MSQuant(vers1n2.0)和StatQuant(vers1nl.2.2)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索及定量分析。本例以瓊脂糖微球?yàn)榈鞍纵d體,但并不僅限于瓊脂糖微球，其他材料如酰肼微球等均可使用；本例以L(fǎng)TQ-Orbitrap質(zhì)譜為檢測(cè)手段，但檢測(cè)手段可以擴(kuò)展到LTQ-Orbitrap-Ve1s、LTQ-Orbitrap-Elite等質(zhì)譜儀器；本例以天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3為例，但所述的蛋白酶還可以擴(kuò)展到其他高特異性的蛋白酶，如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶7(caspase-7)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶2(caspase-2)，天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶8(caspase-8)，金黃色葡萄菌V8蛋白酶(GluC)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、凝血酶(Thrombin)、彈性蛋白酶(Elastase)、組織蛋白酶(CathepsinG,CathepsinK)等。[0033]實(shí)施例1基于瓊脂糖微球?yàn)檩d體的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3底物的篩選。[0034]蛋白樣品的制備:人源急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat)蛋白通過(guò)非變性裂解提取。18個(gè)Jurkat細(xì)胞中加入4mL冰浴的非變性裂解液，裂解液組成如下:50mM4_羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)、1禮二硫蘇糖醇、1501111氯化鈉、1%&八)非離子表面活性劑TritonX-100、ImM乙二胺四乙酸、2%(v/v)蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitorcocktail,Sigma)、2/5片的磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)、ImM苯甲基磺酰氟。冰浴超聲功率400W，超聲3s,間歇5s，重復(fù)超聲180次。然后4°C，16000g離心機(jī)上離心20min，取上清液蛋白，按照BCA蛋白濃度測(cè)定方法測(cè)定蛋白濃度為6.5mg/mL，放置_80°C冰箱中備用。[0035]瓊脂糖微球固載蛋白庫(kù)的構(gòu)建:利用溴化氫法將Jurkat非變性細(xì)胞裂解蛋白與溴化氰活化的瓊脂糖微球(CNBr-activatedsepharose4B,GEHealthcare)按照說(shuō)明書(shū)所示質(zhì)量比(wt/wt)為1:25-1:50混合進(jìn)行固載反應(yīng)。取0.67mL上述蛋白裂解液,加入10mg,ImM鹽酸洗滌過(guò)的溴化氫活化的瓊脂糖微球，于4°C，200rpm振蕩進(jìn)行固載反應(yīng)18h。之后，100g離心，用洗滌緩沖液(50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)UmM二硫蘇糖醇、4μM亮肽素，0.1μM抑肽酶、1%(ν/ν)非離子表面活性劑TritonX-100)洗滌瓊脂糖微球三次，抑制內(nèi)源性的蛋白酶活性的同時(shí)洗非特異性吸附的蛋白。然后，用甘氨酸封閉液(50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)、IM甘氨酸、ImM二硫蘇糖醇、2%(ν/ν)蛋白酶抑制劑(proteaseinhibitorcocktail)、l%(v/v)非離子表面活性劑TritonX-100)于4°C過(guò)夜封閉反應(yīng)，封閉未被固載的瓊脂糖活性位點(diǎn)。待封閉完全，再用上述洗滌緩沖液洗滌瓊脂糖微球三次，50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液(pH=7.4)洗滌一次。[0036]蛋白酶特異性酶切反應(yīng):將上述瓊脂糖微球固載的蛋白庫(kù)等分為兩份，一份作為不加天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的空白對(duì)照組,另一份作為加天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的實(shí)驗(yàn)組。兩份蛋白微球分別重懸于500μL蛋白酶切反應(yīng)緩沖液(50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(ρΗ=7.4)、ImM乙二胺四乙酸、10mM氯化鈉、ImM二硫蘇糖醇、1%(wt/v)鹿糖)中，實(shí)驗(yàn)組加入5μg天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3,而空白組不加天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3，反應(yīng)2h后，離心去除瓊脂糖微球，取上清液。用100^，25禮4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液(？!1=7.4)洗滌兩次，合并上清液，并加入2.5μLlmM天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3的抑制劑(z-DEVD-fmk)終止反應(yīng)。[0037]二次酶切及定量標(biāo)記:將上述實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組所得到的上清液冷凍干燥后，分別復(fù)溶于100μL溶液(8Μ尿素、10mM四乙基溴化銨(ρΗ=8.0)),加入終濃度為20mM二硫蘇糖醇，37°C反應(yīng)2h后，加入終濃度為40mM碘代乙酰胺，25°C避光反應(yīng)45min，之后，各加入10mM四乙基溴化銨(pH=8.0)緩沖液稀釋至600μL，最后分別加入15μg序列純胰蛋白酶，37°C酶解反應(yīng)過(guò)夜。[0038]二甲基標(biāo)記方法按照常規(guī)在柱標(biāo)記方法進(jìn)行(文獻(xiàn)6Multiplexpeptidestableisotopedimethyllabelingforquantitativeproteomics.Nat.Protoc.2009,4(4)，484-494.)。采用30mgC18柱子進(jìn)行在柱標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)組肽段采用8mL含4%氘代甲醛(CD2O)和0.6M氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)各240μL的PBS(ρΗ=7.5)溶液進(jìn)行重標(biāo)標(biāo)記，對(duì)照組肽段采用8mL含4%甲醛(CH2O)和0.6M氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)各240μL的PBS(pH=7.5)溶液進(jìn)行輕標(biāo)標(biāo)記。標(biāo)記完全后，各用2mL洗脫液(80%乙腈，0.1%三氟乙酸)洗脫并將輕、重標(biāo)記的兩組樣品肽段混合，凍干，待做質(zhì)譜。[0039]質(zhì)譜定量及結(jié)果處理:將凍干的輕、重標(biāo)記混合后的肽段復(fù)溶于100μL0.1%甲酸中，取20μL進(jìn)行LTQ-OrbitrapXL質(zhì)譜分析。采用在線(xiàn)二維SCX-RP-LC-MS/MS系統(tǒng)(文獻(xiàn)7:Afullyautomatedsystemwithonlinesampleloading,isotopedimethyllabelingandmultidimens1nalseparat1nforhigh-throughputquantitativeproteomeanalysis.AnalChem.2010，82，29072915.)進(jìn)行質(zhì)譜分析。經(jīng)過(guò)50，100，150，200，250，300，350，400，500mM和100mM共10個(gè)醋酸銨鹽梯度洗脫，并用140min反相梯度系統(tǒng)分析。質(zhì)譜重復(fù)鑒定三次。所得結(jié)果采用軟件Mascot(vers1n2.1)進(jìn)行搜索數(shù)據(jù)庫(kù)(IPIhuman3.52)、MSQuant(vers1n2.0)進(jìn)行定量和StatQuant(vers1nl.2.2)進(jìn)行結(jié)果整合分析。[0040]結(jié)果分析:定量到的所有肽段1g2Rat1值分布見(jiàn)圖2A。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，通常把定量結(jié)果變化在兩倍以上的看作顯著變化。為了提高結(jié)果的可靠性，我們將所定量到的所有肽段與已知的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶底物數(shù)據(jù)庫(kù)CASBAH進(jìn)行比較，如圖2B所示，結(jié)果顯示1g2Rat1彡2.0，即四倍以上變化的肽段在數(shù)據(jù)庫(kù)中的比值趨于恒定，因此，我們?cè)O(shè)定上調(diào)四倍以上的肽段為顯著變化的肽段，即約有7149條肽段為顯著上調(diào)。[0041]蛋白質(zhì)組學(xué)中，認(rèn)為至少有兩條唯一肽段鑒定到的蛋白才比較可信。因此，我們將鑒定蛋白的上調(diào)肽段數(shù)目與已知蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，分析上調(diào)肽段數(shù)目與上調(diào)變化的蛋白之間的關(guān)系。如圖2C，結(jié)果顯示當(dāng)上調(diào)肽段數(shù)為2時(shí)，數(shù)據(jù)庫(kù)中的底物蛋白所占的比例已經(jīng)達(dá)到27.5%,與文獻(xiàn)報(bào)道(文獻(xiàn)8:Caspasesubstratesandcellularremodeling.Annu.Rev.B1chem.2011,80,1055-1087.)的結(jié)果相當(dāng)。上調(diào)肽段數(shù)目越多，數(shù)據(jù)庫(kù)中的底物蛋白所占的比值也相對(duì)較大。[0042]通過(guò)如上分析，設(shè)定篩選參數(shù)為:上調(diào)肽段為1g2Rat1彡2.0,且上調(diào)肽段數(shù)目至少為2時(shí)，所定量的蛋白為可信的底物蛋白。結(jié)果顯示，1098個(gè)潛在的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3底物蛋白被定量到。[0043]進(jìn)一步，我們將1098個(gè)潛在的天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶3底物蛋白進(jìn)行分析分類(lèi)，如圖3所示。一類(lèi)是“Hot”底物蛋白，該類(lèi)蛋白所含上調(diào)肽段數(shù)目至少為4。此類(lèi)蛋白中底物所占的比例達(dá)到40%，即5個(gè)潛在的底物蛋白中就有2個(gè)是已知的底物蛋白，可信度大大提高。第二類(lèi)為“Warm”蛋白，此類(lèi)蛋白所含的上調(diào)肽段數(shù)目為2或者3，已知底物所占的比例僅接近20%。這類(lèi)蛋白可能是由于豐度較低，或者蛋白本身可酶切的位點(diǎn)不多等原因，往往容易被忽視掉，這部分蛋白也是很重要的一部分。[0044]以上結(jié)果說(shuō)明，通過(guò)本發(fā)明所建立的體外篩選蛋白酶底物的方法，操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可靠，可適用于大規(guī)模蛋白酶底物的體外篩選?！緳?quán)利要求】1.一種基于固載的混合蛋白質(zhì)為蛋白庫(kù)的蛋白酶底物篩選方法，其特征在于:混合蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)作用鍵合到固相載體上作為篩選蛋白庫(kù)，將該蛋白庫(kù)與特異性蛋白酶孵育，蛋白庫(kù)中與特異性蛋白酶相應(yīng)的底物蛋白被特異性蛋白酶酶切后所產(chǎn)生的肽段進(jìn)入溶液，而蛋白庫(kù)中與特異性蛋白酶不相應(yīng)的非底物蛋白不能被特異性蛋白酶酶切而完整的保留在固相載體上，固液分離后，采用生物質(zhì)譜進(jìn)行底物肽段定性定量分析，從而得到特異性蛋白酶的底物蛋白信息。2.按照權(quán)利要求1所述的篩選方法，其前提特征在于:蛋白酶與其底物具有高度特異性作用；底物蛋白被酶切后所產(chǎn)生的肽段能夠直接從固相載體上釋放進(jìn)入溶液，非底物蛋白不能被酶切而仍舊完整地保留在固相載體上。3.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于:特異性蛋白酶可以是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族(caspase-3,caspase-7,caspase-2,caspse-8等)，也可以是金黃色葡萄菌V8蛋白酶(GluC)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、凝血酶(Thrombin)、彈性蛋白酶(Elastase)、組織蛋白酶(CathepsinG,CathepsinK)等中的一種或二種以上。4.按照權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于:具體操作過(guò)程為:1)固載蛋白庫(kù)的構(gòu)建:混合蛋白質(zhì)通過(guò)化學(xué)作用鍵合到固相載體上；2)底物蛋白酶切反應(yīng):將固載的混合蛋白庫(kù)與蛋白酶孵育反應(yīng)后，底物蛋白被酶切后所產(chǎn)生的肽段釋放進(jìn)入溶液，非底物蛋白不能被酶切而完整的保留在固相載體上；3)底物蛋白分析鑒定:通過(guò)固液分離，得到溶液中的底物蛋白肽段，采用質(zhì)譜進(jìn)行底物肽段的定性定量分析。5.按照權(quán)利要求1或4所述方法，其特征在于:所述的混合蛋白質(zhì)為細(xì)胞提取的蛋白質(zhì)、組織提取的蛋白質(zhì)等中的一種或二種以上。6.按照權(quán)利要求1或4所述方法，其特征在于:所述的固相載體是酰肼微球(Aff1-HzhydrazideGel,B1-Rad),蛋白質(zhì)通過(guò)酰肼化學(xué)的方法固載于酰肼微球上。7.按照權(quán)利要求1或4所述方法，其特征在于:所述的固相載體是瓊脂糖微球(CNBr-activatedSepharose4B,GEHealthcare),蛋白質(zhì)通過(guò)溴化氫法固載于瓊脂糖微球上。8.按照權(quán)利要求3或4所述方法，當(dāng)?shù)鞍酌笧樘於彼崽禺愋园腚装彼岬鞍酌?或7時(shí)，其酶切反應(yīng)條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μ8/μl，50mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4),10mM氯化鈉，5mM或1mM二硫蘇糖醇，ImM乙二胺四乙酸，1%或10%(wt/v)鹿糖，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100，在37°C下反應(yīng)Ih以上；當(dāng)?shù)鞍酌笧辄S色葡萄菌V8蛋白酶、凝血酶、彈性蛋白酶、或組織蛋白酶G時(shí)，其酶切反應(yīng)的條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μ1，150mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)，50mM氯化鈉，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100,在37°C下反應(yīng)Ih以上。9.按照權(quán)利要求4所述方法，當(dāng)?shù)鞍酌笧榛|(zhì)金屬蛋白酶2時(shí)，其酶切反應(yīng)的條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5yg/yl，150mM4-羥乙基哌嗪乙磺酸(pH=7.4)，50mM氯化鈉，5mM氯化I丐,10μM氯化鋅,蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100，在37°C下反應(yīng)Ih以上。10.按照權(quán)利要求4所述方法，當(dāng)?shù)鞍酌笧榻M織蛋白酶K時(shí)，其酶切反應(yīng)條件為:固載的蛋白濃度為0.2-5μg/μ1，10mM醋酸鈉(pH=5.5),2.5mM乙二胺四乙酸，2.5mM二硫蘇糖醇，蛋白酶與固載蛋白庫(kù)中蛋白質(zhì)的質(zhì)量比值(wt/wt)范圍為1:10-1:100,在37°C下反應(yīng)Ih以上。【文檔編號(hào)】C12Q1/37GK104419746SQ201310374698【公開(kāi)日】2015年3月18日申請(qǐng)日期:2013年8月23日優(yōu)先權(quán)日:2013年8月23日【發(fā)明者】鄒漢法,王春麗,葉明亮申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所