專利名稱：一種菌藻混合生物降解甲基叔丁基醚的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌藻混合生物降解甲基叔丁基醚的方法，屬環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲基叔丁基醚(Methyl tert-Butyl Ether，MTBE)在國外已被廣泛用作汽油添加劑，國內(nèi)于2000年停止銷售含鉛汽油而改為使用含MTBE的清潔汽油以來，MTBE的使用量也在不斷增加。MTBE已成為美國地下水中廣泛分布的、較持久的污染物，而且有研究表明MTBE有潛在致癌可能性。因此，美國的加州和紐約州先后禁止在汽油中添加MTBE。但國內(nèi)由于目前可替代的氧化物添加劑技術(shù)還不成熟，禁用MTBE是不現(xiàn)實的，因此我國面臨MTBE污染加劇及其對人類的潛在危害。發(fā)明人對杭州周邊地區(qū)進行了MTBE檢測，在加油站周邊水體中檢測到了MTBE的存在，含量在18μg/L左右，隨著我國汽車產(chǎn)業(yè)和汽油使用量的不斷增加，MTBE在環(huán)境中的累積會對我國人民的生活造成影響，進行我國環(huán)境條件下MTBE各種降解和修復(fù)技術(shù)研究十分必要。近年來隨著多種MTBE降解菌株的發(fā)現(xiàn)，MTBE的微生物降解技術(shù)倍受關(guān)注。但在微生物降解過程中普遍存在降解速率低、微生物生長緩慢等問題。氧氣是影響MTBE微生物降解的重要因素之一。雖然，有報道(Bradeley et al.，2001，Effect ofredox conditions on MTBE biodegradation in surface water sediments.Environ Sci Technol，35(23)4643-4647)在厭氧環(huán)境中也能發(fā)生MTBE的生物降解(SO4，F(xiàn)e(III)，Mn(IV)和NO3等為電子受體)，但降解速率要比以氧氣為電子受體低得多。因此，氧氣是MTBE降解菌所必需的，尤其是在密閉系統(tǒng)或地下水環(huán)境。已有報道的措施有采取充氧氣或持續(xù)供氧的裝置來滿足降解空間對溶解氧的需求(Zhong Weihong et al.，2007，Aerobicdegradation of methyl tert-butyl ether by a Proteobacteria strain in a closedculture system，Journal of Environmental Sciences 19(1)315-319)，但迄今，關(guān)于采用藻菌共生系統(tǒng)進行MTBE降解的方法研究尚無文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明即是為了提供一種菌藻混合培養(yǎng)、提高甲基叔丁基醚降解菌降解速率和微生物生長速度的混合生物降解甲基叔丁基醚的方法。
為達到發(fā)明目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種菌藻混合生物降解甲基叔丁基醚的方法，所述方法是將甲基叔丁基醚降解菌和小球藻以初始細胞濃度1～1000∶1的比例混合，于光照條件下、在含有甲基叔丁基醚的培養(yǎng)體系中、20～40℃共生培養(yǎng)5～15天，將甲基叔丁基醚完全降解，所述甲基叔丁基醚降解菌在培養(yǎng)體系中初始細胞濃度為106～108cells/mL。
小球藻(Chlorella)，屬綠藻門，綠藻綱，綠球藻目，卵孢藻科，小球藻屬。常見的有核蛋白小球藻、眼點小球藻、卵形小球藻、鹽生小球藻和海生小球藻等。形態(tài)特征球形或廣橢圓形。優(yōu)選為下列之一①橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)，②蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，③普通小球藻(Chlorella vulgaris)，④Chlorella sorokiniana(無中文譯名)，⑤Chlorella saccharophila(無中文譯名)。
本發(fā)明采用藻類在光照條件下可以利用光合作用持續(xù)供氧，而降解菌則利用氧氣進行MTBE的加氧分解，最終產(chǎn)物二氧化碳反過來又成為藻類的光合作用底物，實現(xiàn)內(nèi)循環(huán)的共生體系來持續(xù)降解MTBE。實驗證明，藻菌混合降解效果明顯好于單菌或單藻，藻菌混合體系內(nèi)MTBE在7天內(nèi)即可被全部降解，而單菌未能完全降解，單藻則幾無降解。藻菌系統(tǒng)在整個反應(yīng)過程中的溶氧水平也要高于單菌系統(tǒng)，相對于單藻系統(tǒng)來看，藻菌系統(tǒng)中細菌的存在又促進了藻的生長。
另外，MTBE降解效果也隨培養(yǎng)體系中甲基叔丁基醚降解菌和橢圓小球藻初始細胞濃度之比不同而有所區(qū)別，當培養(yǎng)體系中甲基叔丁基醚降解菌和小球藻初始細胞濃度之比為1～1000∶1時，均有較好的效果。其初始細胞濃度之比優(yōu)選為50～300∶1，最優(yōu)選為約100∶1，效果最為顯著。
所述甲基叔丁基醚降解菌為β變性菌屬細菌、或假單胞菌屬、或黃色桿菌屬、或分枝桿菌屬細菌，優(yōu)選為PM1菌、SCL-1菌或銅綠假單孢菌、母牛分枝桿菌。
所述培養(yǎng)體系中甲基叔丁基醚濃度為10～500mg/L。
所述方法為將甲基叔丁基醚降解菌和橢圓小球藻以初始細胞濃度1～1000∶1的比例，加至光照反應(yīng)器中的培養(yǎng)液中，使甲基叔丁基醚降解菌在培養(yǎng)液中初始細胞濃度為106～108cells/mL，將含有甲基叔丁基醚的廢水通入反應(yīng)器中反應(yīng)，20～40℃下反應(yīng)5～15天，將廢水中甲基叔丁基醚降解為二氧化碳和水。
所述光照反應(yīng)器出口處可設(shè)置細胞過濾器，以防止菌藻細胞流失。為防止菌藻細胞流失降低降解速率，也可將所述甲基叔丁基醚降解菌和小球藻固定化后用于光照反應(yīng)器中反應(yīng)。固定化是將游離細胞或者酶定位于限定的區(qū)域，使其保持活性并可反復(fù)利用的方法。廢水處理中常用微生物固定化方法主要有包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法。
包埋法的原理是將微生物細胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中。通過聚合作用或者離子網(wǎng)絡(luò)形成，或通過沉淀作用，或改變?nèi)軇?、溫度、pH值使細胞截流。凝膠聚合物的網(wǎng)絡(luò)可以阻止細胞的泄漏，同時能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴散出來。常見有海藻酸鈣包埋法或聚乙烯醇—硼酸包埋法。
交聯(lián)法是使用雙功能的試劑與酶分子進行分子間的交聯(lián)固定化方法。由于酶蛋白的功能團參與此反應(yīng)，所以酶的活性中心構(gòu)造可能受到影響，而使酶顯著失活。此外，交聯(lián)劑如戊二醛等價格昂貴，限制了其應(yīng)用。
吸附法又稱載體結(jié)合法，是通過物理吸附、化學(xué)或者離子的結(jié)合，將微生物固定于非水溶性載體。這種方法操作簡單，對微生物活力影響小，但所結(jié)合的微生物數(shù)量有限，反應(yīng)穩(wěn)定性和反復(fù)使用性差。主要分為物理吸附法、共價結(jié)合法、離子結(jié)合法和生物特異性吸附法四種方法。
所述固定化方法優(yōu)選為海藻酸鈣包埋法或聚乙烯醇—硼酸包埋法。
海藻酸鈣包埋法是一種使用最廣、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，對微生物毒性小，固定化細胞密度高等優(yōu)點。利用海藻酸鈉凝膠固定化微生物法安全、快速、制備簡單，反應(yīng)條件溫和，成本低廉且適用于大多數(shù)微生物的固定化。
以海藻酸鹽為載體，建立包埋固定化微生物的方法如下①將海藻酸鈉加熱溶于水；②將海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻，使海藻酸鈉最終質(zhì)量濃度為2％～4％；③將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5％～10％的CaCl2溶液中，固定化7～8h；④濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。
聚乙烯醇是一種新型的微生物包埋固定化載體，它具有機械強度高，化學(xué)穩(wěn)定性好，抗微生物分解性能強，對微生物無毒，價格低廉等一系列優(yōu)點，是一種具有實用潛力的包埋材料，近年來在國內(nèi)外獲得了較廣泛的研究。
以PVA為固定化載體，建立利用PVA-H3BO3包埋固定化微生物細胞的方法，具體方法如下①將聚乙烯醇(PVA)與海藻酸鈉加熱溶于水，冷卻；②將微生物細胞與上述溶液混合均勻，使PVA與海藻酸鈉最終質(zhì)量濃度分別為7.5％～10％，0.4％～1.0％；③將上述混合液用針形管滴入下列溶液中H3BO3(飽和溶液)，CaCl21.0％～5.0％，pH值4.0～7.0；④放置10h，使之充分反應(yīng)；⑤濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。
所述培養(yǎng)液為常用適用于甲基叔丁基醚降解菌和橢圓小球藻的液體培養(yǎng)基，本發(fā)明中采用BSM培養(yǎng)液。BSM培養(yǎng)基組成為(終濃度，g/L)Na2HPO45.57，KH2PO42.44，NH4Cl 2.0，MgCl2·6H2O 0.2，MnCl2·4H2O0.0004，F(xiàn)eCl3·6H2O0.001，CaCl20.001 pH7.0。
具體的，所述方法如下將PM1菌或SCL-1菌和橢圓小球藻以初始細胞濃度100∶1的比例，加至光照反應(yīng)器中的BSM培養(yǎng)液中，使PM1菌或SCL-1菌在培養(yǎng)液中初始細胞濃度為106～108cells/mL，將含有甲基叔丁基醚的廢水通入反應(yīng)器中，30℃下反應(yīng)7～10天，將廢水中甲基叔丁基醚降解為二氧化碳和水。
本發(fā)明方法的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一種菌藻混合生物降解甲基叔丁基醚的方法，可在封閉容器中進行，無需額外供氧設(shè)備，且降解速度快，降解徹底，效果好于單菌系統(tǒng)。


圖1為不同菌(PM1菌)藻及其組合對密閉系統(tǒng)中MTBE降解的影響；
圖2為不同菌(SCL-1菌)藻及其組合對密閉系統(tǒng)中MTBE降解的影響；圖3為密閉系統(tǒng)中菌藻比例對MTBE降解的影響。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例14個250mL培養(yǎng)瓶加200mLBSM培養(yǎng)基(含MTBE約50mg/L)，分為4組，分別接種(1)5mL PM1菌(β變形菌屬)(濃度約2.683×108cells/mL)；(2)5mL橢圓小球藻(濃度約1.306×106cells/mL)；(3)10mL藻菌混合液(PM1菌濃度約2.683×108cells/mL，橢圓小球藻濃度約1.306×106cells/mL)；(4)空白對照；30℃，150r/min，光照培養(yǎng)。結(jié)果藻菌混合降解MTBE效果明顯比單菌好，藻菌混合體系內(nèi)MTBE在7天內(nèi)即可被全部降解，而單菌未能完全降解，單藻則幾無降解。(見圖1)。藻菌系統(tǒng)在整個反應(yīng)過程中的溶氧水平也要高于單菌系統(tǒng)(表1)，相對于單藻系統(tǒng)來看，藻菌系統(tǒng)中細菌的存在又促進了藻的生長(表2)。
注PM1菌分離自美國加利佛尼亞洲，由美國加州大學(xué)戴維斯分校Scow教授提供。
橢圓小球藻購自中科院水生生物所。
表1不同密閉培養(yǎng)系統(tǒng)中溶氧變化(30℃，mg/L)
表2不同密閉培養(yǎng)系統(tǒng)中藻濃度變化(cell/ml)
實施例2250mL培養(yǎng)瓶加50mLBSM培養(yǎng)基(含MTBE約25mg/L)，分為6組，分別接種B空白對照；C1mL橢圓小球藻(濃度為0.82×106個/mL)；D1mL橢圓小球藻(濃度為1.64×106個/mL)；E1mLSCL-1菌(假單胞菌屬)(濃度為1.4×107cells/mL)；F2mL菌藻混合液(SCL-1菌濃度為1.4×107cells/mL，藻濃度為0.82×106個/mL)；G2mL菌藻混合液(SCL-1菌濃度為1.4×107cells/mL，藻濃度為1.64×106個/mL)；30℃，150r/min，光照培養(yǎng)。結(jié)果菌藻混合降解MTBE效果明顯比單菌好(見圖2)。
注SCL-1菌從杭州某加油站分離獲得，浙江工業(yè)大學(xué)提供。
橢圓小球藻購自中科院水生生物所。
實施例35個250ml培養(yǎng)瓶加200mL BSM培養(yǎng)基(含MTBE約50mg/L)，分別接種
1)空白對照；2)1mL PM1菌(濃度約9.297×107cells/mL)，5mL橢圓小球藻(濃度約1.85×107cells/mL)；3)1mL PM1菌(濃度約9.297×107cells/mL)，5mL橢圓小球藻(濃度約1.85×106cells/mL)；4)1mL PM1菌(濃度約9.297×107cells/mL)，5mL橢圓小球藻(濃度約1.85×105cells/mL)；5)1mL PM1菌(濃度約9.297×107cells/mL)，5mL橢圓小球藻(濃度約1.85×104cells/mL)；30℃，150r/min，光照培養(yǎng)。結(jié)果菌藻比為100∶1時效果最好(圖3)。
實施例4微生物固定化將海藻酸鈉加熱溶于水；將海藻酸鈉溶液與微生物細胞(PM1菌和橢圓小球藻以初始細胞濃度100∶1)混合均勻，使海藻酸鈉最終質(zhì)量濃度為3％；將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入8％的CaCl2溶液中，固定化8h；濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。
甲基叔丁基醚降解將以上固定化顆粒置于光照反應(yīng)器中，添加BSM培養(yǎng)液，使PM1菌在培養(yǎng)液中初始細胞濃度為1.27×107cells/mL，將含有甲基叔丁基醚的廢水(MTBE含量約60mg/L)通入反應(yīng)器中，30℃下反應(yīng)，10天后，廢水中已檢測不出甲基叔丁基醚，證明其已完全降解；同時經(jīng)GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)單菌培養(yǎng)體系中CO2的含量有顯著增加，說明降解菌可以將MTBE徹底降解為CO2。
權(quán)利要求
1.一種菌藻混合生物降解甲基叔丁基醚的方法，所述方法是將甲基叔丁基醚降解菌和小球藻以初始細胞濃度1～1000∶1的比例混合，于光照條件下、在含有甲基叔丁基醚的密閉培養(yǎng)體系中、20～40℃共生培養(yǎng)5～15天，將甲基叔丁基醚完全降解，所述甲基叔丁基醚降解菌在培養(yǎng)體系中初始細胞濃度為106～108cells/mL。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)體系中甲基叔丁基醚降解菌和小球藻初始細胞之比為50～300∶1。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述甲基叔丁基醚降解菌為β變形菌屬、或假單胞菌屬、或黃色桿菌屬、或分枝桿菌屬細菌。
4.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述甲基叔丁基醚降解菌為PM1菌，銅綠假單孢菌，母牛分枝桿菌或SCL-1菌。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述小球藻為下列之一①橢圓小球藻(Chlorella ellipsoidea)，②蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)，③普通小球藻(Chlorella vulgaris)，④Chlorellasorokiniana，⑤Chlorella saccharophila。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)體系中甲基叔丁基醚濃度為10～500mg/L。
7.如權(quán)利要求1～6之一所述的方法，其特征在于所述方法為將甲基叔丁基醚降解菌和小球藻以初始細胞濃度1～1000∶1的比例，加至光照反應(yīng)器中的培養(yǎng)液中，使甲基叔丁基醚降解菌在培養(yǎng)液中初始細胞濃度為106～108cells/mL，將含有甲基叔丁基醚的廢水通入反應(yīng)器中反應(yīng)，20～40℃下反應(yīng)5～15天，將廢水中甲基叔丁基醚降解為二氧化碳和水。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于將所述甲基叔丁基醚降解菌和小球藻固定化后用于光照反應(yīng)器中反應(yīng)。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)液為BSM培養(yǎng)液或自來水。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下將PM1菌或SCL-1菌和橢圓小球藻以初始細胞濃度100∶1的比例，加至光照反應(yīng)器中的BSM培養(yǎng)液中，使PM1菌或SCL-1菌在培養(yǎng)液中初始細胞濃度為1.0～1.5×107cells/mL，將含有甲基叔丁基醚的廢水通入反應(yīng)器中，30℃下反應(yīng)7～10天，將廢水中甲基叔丁基醚降解為二氧化碳和水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種菌藻混合生物降解甲基叔丁基醚的方法，所述方法是將甲基叔丁基醚降解菌和小球藻以初始細胞濃度1～1000∶1的比例混合，于光照條件下、在含有甲基叔丁基醚的密閉培養(yǎng)體系中、20～40℃共生培養(yǎng)5～15天，將甲基叔丁基醚完全降解，所述甲基叔丁基醚降解菌在培養(yǎng)體系中初始細胞濃度為10
文檔編號A62D101/06GK101015731SQ20071006734
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者鐘衛(wèi)鴻, 孫柯丹, 李藝瀟, 陳建孟, 陳東之 申請人:浙江工業(yè)大學(xué)