專利名稱：中華根瘤菌制劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中華根瘤菌制劑及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
煙堿(俗稱尼古丁)是煙草生物堿中的主要成分，是影響煙葉品質(zhì)的重要因素之一， 也是煙草工業(yè)生產(chǎn)廢水、廢物中的主要有害成分。煙堿進(jìn)入人體后90%被肺部吸收，進(jìn) 入血液6秒鐘后即可到達(dá)大腦，嚴(yán)重影響人體的呼吸系統(tǒng)和交感神經(jīng)。在香煙生產(chǎn)過程 中，煙堿的含量過高會(huì)增加煙氣的刺激性，影響巻煙吸味，安全性也差。如何把煙草的 煙堿含量控制到人們所期望的范圍，是煙草科技工作者和環(huán)境保護(hù)者研究的熱點(diǎn)課題。 降低煙草中的煙堿含量的方法通常利用農(nóng)業(yè)操作在煙草生長過程中控制煙堿的含量和利 用物化手段在煙草加工過程中降低煙葉中的煙堿含量，但由于以上方法操作性不強(qiáng)、效 果不明顯，國內(nèi)外的研究正趨向于利用微生物降解煙堿。
微生物特別是細(xì)菌廣泛存在于各種生態(tài)條件下，特定的環(huán)境孕育了特殊的微生物類 群。早在20世紀(jì)三、四十年代就有關(guān)于從土壤中分離可代謝尼古丁微生物的報(bào)道。1947 年Enders等就發(fā)現(xiàn)酵母菌可以降解煙堿，隨后研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了許多可以降解煙堿的 微生物如球形節(jié)桿菌(y4rtAro6a"erWoZ>//orau'Zs)、煙草節(jié)桿菌(A / /co"朋ae人噬 煙堿節(jié)桿菌"./w'co"/ c^ora/w)、氧化節(jié)桿菌(A oiyfifens)、巨大芽孢桿菌(fec/"ws 邁e卵ter/咖)、蕈狀芽孢桿菌U邁yco/ofes)、短小芽孢桿菌(丑/ 咖W"s)、棒桿菌菌 (Cbr/weAac ter/taz sp.)、煙草微球菌Wcrococcws /w'co "朋ae)等。這些微生物多數(shù)是 通過富集培養(yǎng)，然后以尼古丁為唯一碳氮源分離而得。
雖然目前微生物降解尼古丁的機(jī)理還不是十分明確，但國內(nèi)外仍然有許多應(yīng)用微生物 活體降解煙堿的報(bào)道。煙草加工過程中產(chǎn)生的許多固態(tài)或液態(tài)廢物主要含有大量的尼古 丁等生物堿類有毒物質(zhì)，平均含量達(dá)18 000mg/kg干重。這些廢物如不及時(shí)處理會(huì)給人 們的生存和生活帶來極大的危害。1997年Civilini等報(bào)道了采用i 和A oxWa/w
pAOl處理尼古丁廢棄物的滲洗液，結(jié)果表明i /urf/rfa的處理效果最好。 Browii&WiUiamson煙草公司利用纖維單胞菌來降低煙草中的煙堿和硝酸鹽含量。結(jié)果 顯示，將經(jīng)過處理的白肋煙和其它煙葉混合，與未經(jīng)處理的白肋煙葉片相比，混合煙絲 的硝酸鹽含量從1.63%降至1.04%,煙堿從1.79%降至1.32%。將這些經(jīng)過處理的混合 煙絲制成巻煙后，煙氣分析表明，硝酸鹽、氰化氫和煙堿各降低了 38.8%、19.7%和15J%。 由此可見，通過微生物手段降低尼古丁含量和消除污染在生產(chǎn)中具有很高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)
值，其意義不但可以提高煙葉資源的利用率，取得豐厚的經(jīng)濟(jì)效益，而且還可以改善生 態(tài)環(huán)境，獲得顯著的社會(huì)效益，利用微生物降解煙堿前景廣闊。
中華根瘤菌是我國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的一個(gè)根瘤菌的新屬，在豆科作物固氮等領(lǐng)域得到了 廣泛的研究和應(yīng)用，但在降解煙堿的方面，在國內(nèi)外還未見到報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種煙堿降解率高，并能夠提高煙草品質(zhì)的中華根瘤菌制劑 及其應(yīng)用。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
1、 中華根瘤菌(5Y加r力i加Zw',砂.)N7的獲得
選自煙草葉片，煙葉樣品研磨，稀釋涂布平板，在M9+煙堿培養(yǎng)基Na2HP04 12. 8g 、 KH2P04 3.0g、 NaCl 0. 5g 、肌C1 0. 5g 、瓊脂粉17g、煙堿10g(單獨(dú)滅菌)、10. 0g維 生素B1(單獨(dú)滅菌)lyg/ml、 pH自然，于28。C溫度下培養(yǎng)2d，挑取能夠在平板上健康 生長的細(xì)菌菌落，其中有一菌落表現(xiàn)較好，定名為N7菌株。
對(duì)N7菌株進(jìn)行生物學(xué)和生化試驗(yàn)，革蘭氏陰性菌。桿狀，0.6 0.8umX1.2 3.0 ym。不產(chǎn)生芽孢。鞭毛周生1 3根。好氧。NA培養(yǎng)基上菌落呈圓形、凸起、有粘液， 在酵母膏一甘露醇一無機(jī)鹽瓊脂上3天后直徑一般為2 3誦。最適生長溫度為25 35 'C，該菌株能在38。C和l(TC能生長；最適p朋.0 8.0?？梢岳靡韵挛镔|(zhì)作為唯一碳 源葡萄糖、D—阿拉伯糖、纖維二糖、果糖、D—半乳糖、D—甘露糖、甘露醇、L一古 酰胺、乳糖、D —核糖、琥珀酸鹽、木糖和D—松二糖。不能利用以下碳源酒石酸胺、 草酸胺、纖維素、衛(wèi)毛醇、巖糖、甘氨酸、山梨糖、藻元酸鈉和香草酸。在YMA培養(yǎng)基 上產(chǎn)酸。可生長于1.0XNaCl?？梢岳寐然@和硝酸鹽作為碳源，利用蛋白胨能力差。 氧化酶和接觸酶為陽性。
對(duì)該菌進(jìn)行16SrDNA序列測定，GenBank注冊(cè)號(hào)DQ659139。通過序列比對(duì)和生化
特性將N7鑒定為中華根瘤菌屬的某個(gè)種(&'/707^'加/^/歷sp.)。
本發(fā)明所述的中華根瘤菌(57/ or力i加/7ii朋邵.)N7已于2006年10月9日在中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號(hào)， 保藏編號(hào)為CGMCC N0. 1829，分類命名為中華根瘤菌(5Y加r力"o/)i咖邵.)。
2、 制備中華根瘤菌制劑， 本發(fā)明中使用的比例為g/L。
a. 斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28 3(TC保溫培養(yǎng)28h。
b. 搖瓶種子培養(yǎng)將中華根瘤菌N7斜面菌種接種到配方為牛肉膏3g/L、蛋白胨 0. 5g/L、氯化鈉0.5g/L、其余為蒸餾水、pH7.0-7.2的培養(yǎng)液中，搖瓶轉(zhuǎn)速為150rpm, 在28 — 3(TC溫度下培養(yǎng)48h，獲得液體發(fā)酵種子。
C.液體發(fā)酵工藝將發(fā)酵種子接種到裝有液體培養(yǎng)基配方(g/U:葡萄糖20 30;
硫酸氨2 5;磷酸二氫鉀O. 5 1，磷酸氫二鉀0.5 1,氯化鈣O. 1，硼砂0.005，鉬酸 鈉0.005，消泡劑0.8，其余為水的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度29 — 3(TC、接種量5 10%、 發(fā)酵罐攪拌速度120—150rpm、通氣量5-10%、發(fā)酵時(shí)間45—48小時(shí)的條件下得到中華 根瘤菌制劑，放入容器中避光保存，l星期內(nèi)使用完畢。其'1'，接種雖和通氣呈比例釆 用休積百分比。
本發(fā)明的中華根瘤菌制劑作為降解煙草或煙草廢棄物中的煙堿的應(yīng)用。 本發(fā)明的中華根瘤菌制劑具有煙堿降解率高，并能夠提高煙草品質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。


附圖為N7菌株在含有煙堿的液體中的生長和煙堿降解效果圖(實(shí)施1)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:(用于含煙堿液體)
一、 制備中華根瘤菌制劑
制劑采用的菌種為中華根瘤菌(5Y/7or力i卵W湖印.)N7菌株。
a. 發(fā)酵菌種培養(yǎng)將中華根瘤菌N7斜面菌種接種到配方(g/U為牛肉膏3、蛋白 胨0.5、氯化鈉0.5、其余為蒸餾水、pH7.0的培養(yǎng)液中，搖瓶轉(zhuǎn)速為150rpm，在28°C 溫度下培養(yǎng)48小時(shí)，獲得液體發(fā)酵種子。
b. 發(fā)酵罐發(fā)酵將試管種接種到裝有液體培養(yǎng)基配方(g/U:葡萄糖20;硫酸氨
2;磷酸二氫鉀0.5,磷酸氫二鉀O. 5，氯化鈣O. 1，硼砂0.005，鉬酸鈉0. 005，消泡劑 0.5，其余為水的發(fā)酵罐中，在發(fā)酵溫度29'C、接種量5%。發(fā)酵罐攪拌速度120rpm、通 氣量5%、發(fā)酵時(shí)間45小時(shí)的條件下得到中華根瘤菌制劑。其屮，接種雖和通氣雖比例 采川休積百分比。
二、 中華根瘤菌制劑的應(yīng)用-
將降煙堿降解制劑接種(接種量1%)到含有0. 1%煙堿的M9液體中，30°C 150rpm 藥瓶培養(yǎng)，每隔2小時(shí)取樣檢測溶液的煙堿含量，和代表菌體數(shù)量的溶液0D600值。應(yīng) 用結(jié)果見附圖，降解24小時(shí)后煙堿含量為0.014%，即應(yīng)用制劑將溶液中的煙堿降解了 86%。
實(shí)施例2:(用于含煙堿液體)
基本同實(shí)施例l。不同之處為試管種培養(yǎng)中pH為7.2、溫度30'C;發(fā)酵工藝 中葡萄糖30;硫酸氨5;磷酸二氫鉀1 ，磷酸氫二鉀l，消泡劑1,發(fā)酵溫度30°C 、接
種量10%。發(fā)酵罐攪拌速度150rpm、通氣量10%、發(fā)酵時(shí)間48小時(shí)。 實(shí)施例3:(用于烤煙煙葉處理)
中華根瘤菌制劑的制備基本同實(shí)施例1。不同之處為:發(fā)酵菌種培養(yǎng)中PH為7. 1、 溫度29'C。發(fā)酵工藝中將發(fā)酵種子接種到裝有液體培養(yǎng)基配方葡萄糖28，硫酸氨3，
磷酸二氫鉀0.8，磷酸氫二鉀0.8，消泡劑0.8;發(fā)酵溫度29.5'C、接種量8%。發(fā)酵罐 攪拌速度130rpm、通氣量8%、發(fā)酵時(shí)間46小時(shí)。
本發(fā)明的煙堿降解制劑的應(yīng)用將本發(fā)明的制劑用水稀釋10倍，放入長X寬X高 為1.5mX0.5mXlm的水泥池中。將成熟好的煙葉采收后編桿。編桿后的煙葉放入含有 菌劑的池中浸泡均勻，取出，自然流失掉多余的溶液，然后裝入烤房中，按常規(guī)的烘烤 方法進(jìn)行烘烤。烘烤后的煙葉進(jìn)行煙堿的檢測，結(jié)果表明，本發(fā)明的煙堿降解制劑可以 降低22. 6%的烤煙煙堿。
使用本發(fā)明制劑后的烤煙的煙葉感官質(zhì)量評(píng)吸結(jié)果表明煙葉的勁頭明顯降低，香 氣質(zhì)和香氣量有不同程度改善；刺激性明顯減弱，雜氣明顯減輕。
權(quán)利要求
1、一種中華根瘤菌制劑，由生產(chǎn)菌株經(jīng)發(fā)酵種子培養(yǎng)、發(fā)酵罐發(fā)酵后得到，其特征在于該制劑由下列步驟得到a.選用的生產(chǎn)菌株為中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7，CGMCC NO.1829；b.發(fā)酵種子培養(yǎng)將中華根瘤菌N7斜面菌種接種到配方為牛肉膏3g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化鈉0.5g/L、其余為蒸餾水、pH 7.0-7.2的培養(yǎng)液中，搖瓶轉(zhuǎn)速為150rpm，在28-30℃溫度下培養(yǎng)48h，獲得液體發(fā)酵種子；c.發(fā)酵罐發(fā)酵將液體發(fā)酵種子接種到裝有液體發(fā)酵體系的發(fā)酵罐中發(fā)酵；培養(yǎng)基配方為葡萄糖20～30g/L，硫酸氨2～5g/L，磷酸二氫鉀0.5～1g/L，磷酸氫二鉀0.5～1g/L，氯化鈣0.1g/L，硼砂0.005g/L，鉬酸鈉0.005g/L，消泡劑0.5～1g/L；操作條件為發(fā)酵溫度29-30℃，接種量5～10％，發(fā)酵罐攪拌速度120-150rpm，通氣量5-10％，發(fā)酵時(shí)間為45-48小時(shí)。
2、 權(quán)利要求l所述中華根瘤菌制劑的應(yīng)用，其特征在于該制劑作為降解煙草或煙草 廢棄物中的煙堿的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種中華根瘤菌制劑及其應(yīng)用，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明制劑的生產(chǎn)步驟為a.生產(chǎn)菌株為中華根瘤菌(Sinorhizobium sp.)N7，CGMCC NO.1829；b.將中華根瘤菌N7接種到配方為牛肉膏3g/L、蛋白胨0.5g/L、氯化鈉0.5g/L、其余為蒸餾水、pH 7.0-7.2的培養(yǎng)液中，在轉(zhuǎn)速為150rpm，溫度為28-30℃下培養(yǎng)48小時(shí)，獲得液體發(fā)酵種子；c.將液體發(fā)酵種子接種到發(fā)酵罐中，液體培養(yǎng)基配方(g/L)葡萄糖20～30，硫酸氨2～5，磷酸二氫鉀0.5～1，磷酸氫二鉀0.5～1，氯化鈣0.1，硼砂0.005，鉬酸鈉0.005，消泡劑0.5～1；操作條件為發(fā)酵溫度29-30℃、接種量5～10％，攪拌速度120-150rpm，通氣量5-10％，發(fā)酵時(shí)間為45-48小時(shí)。本發(fā)明具有煙堿降解率高，并能夠提高煙草的品質(zhì)，作為降解煙草或煙草廢棄物中的煙堿的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A62D3/00GK101099493SQ200710065880
公開日2008年1月9日 申請(qǐng)日期2007年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日
發(fā)明者碩 劉, 吳玉萍, 夏振遠(yuǎn), 雷麗萍, 魏海雷 申請(qǐng)人:云南省煙草科學(xué)研究所