專利名稱：高分子聚合物三維氨基基片及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分子聚合物三維氨基基片及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)作為一種高效、大規(guī)模獲取相關(guān)信息的重要手段，是生物技術(shù)、 醫(yī)學(xué)技術(shù)、微加工技術(shù)、微電子技術(shù)、材料技術(shù)的綜合，而材料技術(shù)的應(yīng)用集中體 現(xiàn)在生物芯片片基(載體)上，也即基片的制備?；切酒幕A(chǔ)，基片的制備 尤為重要。
目前點(diǎn)制芯片常用的硅垸化氨基基片，在點(diǎn)制高密度芯片存在穩(wěn)定性問題，在 點(diǎn)樣環(huán)境下長時(shí)間點(diǎn)樣出現(xiàn)點(diǎn)樣剛開始時(shí)點(diǎn)直徑正常、往后絕大部分點(diǎn)直徑越來越 小的現(xiàn)象，也即星星點(diǎn)現(xiàn)象，導(dǎo)致芯片雜交后剛開始點(diǎn)樣的區(qū)域信號正常、往后絕 大部分點(diǎn)基本沒有信號，而且點(diǎn)樣時(shí)間越長，這種問題越嚴(yán)重。因此，需要一種穩(wěn) 定性更高的基片。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生物芯片的基片及其制備方法。 本發(fā)明所提供的制備生物芯片基片的方法，包括如下步驟在玻片片基表面連
接富含氨基的聚合物，得到表面連接上富含氨基的聚合物的基片。
上述過程中，所述連接的方法可包括如下步驟將所述玻片片基置于所述富含
氨基的聚合物的溶液中，吸附，得到所述基片。將此技術(shù)方案記作方法I。 上述方法I中，所述吸附的溫度可為10-50°C。 上述任一所述方法I中，所述吸附的時(shí)間可為0. 5-30小時(shí)。
上述任一所述方法I中，在置于富含氨基的聚合物溶液中之前，先將玻片片基
清洗和表面親水改性，這樣片基可以直接用于連接富含氨基的聚合物；如果最終的 基片要求具有一定疏水性，則將玻片進(jìn)行烘烤以達(dá)到所需的疏水要求，然后再置于
富含氨基的聚合物溶液中，烘烤的溫度、時(shí)間隨疏水要求變化而變化。
上述制備方法中，所述連接的方法還可為包括如下步驟的方法將所述玻片片 基環(huán)氧基化，得到環(huán)氧基化的玻片片基；將所述環(huán)氧基化的玻片片基置于所述富含 氨基的聚合物的溶液中，接枝反應(yīng)，得到所述基片。將此技術(shù)方案記作方法II。上述方法II中，所述將玻片片基環(huán)氧基化的方法可為包括如下步驟的方法將 所述玻片片基置于環(huán)氧基硅烷化試劑的溶液中，進(jìn)行環(huán)氧基化反應(yīng)，得到所述環(huán)氧 基化的玻片片基。
上述任一所述方法II中，所述環(huán)氧基硅烷化試劑的溶液的溶劑可為異丙醇、乙 醇、甲苯或水。
上述任一所述方法II中，所述環(huán)氧基化反應(yīng)的溫度可為15-70°C。所述環(huán)氧基
化反應(yīng)的時(shí)間可為0. 5-30小時(shí)。
上述任一所述方法n中，所述環(huán)氧基硅垸化試劑的溶液中環(huán)氧基硅垸化試劑的
濃度可為0. 01%-10% (體積百分含量)。
上述任一所述方法II中，所述環(huán)氧基硅烷化試劑可為
(3-Glycidyloxyp:ropyl)trimethoxysilane (簡禾爾GPTMS)、
(3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilane (簡稱GPDMES)或
(3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsilane (簡稱GPD顧S)。
上述方法II中，所述將玻片片基環(huán)氧基化的方法還可為包括如下步驟的方法 將環(huán)氧基聚硅氧烷涂敷在所述玻片片基的表面，得到環(huán)氧基化玻片片基。
上述涂敷過程中，所述環(huán)氧基聚硅氧烷可為 Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-epoxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane] 或 Poly(dimethylsiloxane)，diglycidyl ether terminated。
上述涂敷過程中，所述環(huán)氧基聚硅氧垸具體可以是先被制成環(huán)氧基聚硅氧烷的 二氯甲烷溶液，然后再進(jìn)行涂敷；所述環(huán)氧基聚硅氧烷的二氯甲垸溶液中環(huán)氧基聚 硅氧垸的濃度可為0. 005~5% (體積百分含量)，具體可為1% (體積百分含量)。
上述任一所述方法II中，所述接枝反應(yīng)的溫度可為10-50°C。
上述任一所述方法II中，所述接枝反應(yīng)的時(shí)間可為0. 5-30小時(shí)；
上述任一所述方法i和方法n中，所述富含氨基的聚合物的溶液中富含氨基的
聚合物的濃度可為0. 001%-0. 3% (質(zhì)量百分含量)。
上述任一所述方法I和方法II中，所述富含氨基的聚合物的溶液為水相。 上述任一所述方法中，所述富含氨基的聚合物包括但不限于殼聚糖 (chitosan)、多聚賴氨酸(polylysine)、聚亞乙基亞胺(polyethyleneimine)、
聚烯丙基胺(polyallylamine)。
上述任一所述方法中，所述富含氨基的聚合物的分子量為0. 1萬-50萬Da。其中，所述殼聚糖的分子量可為5-19萬、19-31萬、31-37. 5萬；所述多聚賴 氨酸的分子量可為O. 1-0.4萬、0.4-1.5萬、1.5-3萬、3萬-7萬、7-15萬、15-30 萬；所述聚亞乙基亞胺的分子量可為O. 13萬、0.2萬、2.5萬；所述聚烯丙基胺的 分子量可為1.5萬、1.7萬、6.5萬、7萬。
上述任一所述方法中，當(dāng)所述富含氨基的聚合物為殼聚糖時(shí)，所述殼聚糖的溶 液具體可以是按照包括如下步驟的方法制得的先用醋酸溶解殼聚糖，得到溶液I ，
再用O. 1XPBS緩沖液稀釋所述溶液I ，得到殼聚糖的溶液；所述殼聚糖的溶液的 pH值為5.0-6.0。
由上述任一所述方法制備得到的生物芯片基片也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 由上述任一所述基片制得的生物芯片也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。 本發(fā)明的基片是一種高分子聚合物三維氨基基片，具體的說是一種富含氨基的 高分子聚合物三維氨基基片。該基片是在玻璃片基上先進(jìn)行預(yù)處理然后通過靜電吸 附直接涂敷上富含氨基的聚合物高分子從而形成高分子三維氨基分布的基片，也可 以選擇不同的方法先進(jìn)行表面環(huán)氧基修飾，然后通過環(huán)氧基活性基團(tuán)接枝上富含氨 基的聚合物高分子，最終使片基表面為高分子三維氨基分布的基片。這里，可以分 別采用chitosan (即脫乙?；募讱に?、polylysine、 polyethyleneimine、 polyallylamine，本專利分別將這種高分子聚合物三維氨基基片稱為甲殼素基片、 PLL基片、PEI基片、PAA基片。這類基片上的富含氨基的聚合物高分子其較長的親 水連接臂有足夠柔韌度，能夠使通過共價(jià)或高親和力的方式固定于基片表面的樣品 分子同目標(biāo)分子充分接觸而結(jié)合，因此，該基片能較快的實(shí)現(xiàn)分子之間的結(jié)合而平 衡，從而提高點(diǎn)樣環(huán)境下基片的穩(wěn)定性。其中像chitosan和polylysine等聚合物 具有天然無毒、良好的生物親和性和生理活性等特性。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的基片生 物分子固定靈敏度大大提高、樣品點(diǎn)飽滿、基片表面性質(zhì)更穩(wěn)定、確保長時(shí)間樣品 點(diǎn)制過程中樣品點(diǎn)的形狀始終保持均一、非特異性吸附和自發(fā)熒光背景均非常低。 本發(fā)明基片適合長時(shí)間點(diǎn)樣的高密度芯片的點(diǎn)制，解決了普通氨基基片存在的長時(shí) 間點(diǎn)制的高密度芯片中遇到的大部分樣品固定不上的問題。本發(fā)明基片是一種性能 優(yōu)良的生物芯片基底材料，可廣泛應(yīng)用于各種生物芯片的制備上。


圖l是高分子聚合物三維氨基基片表面分子的結(jié)構(gòu)示意圖2是普通氨基基片點(diǎn)制高密度Oligo的芯片(31K)點(diǎn)制效果6圖3是高分子聚合物三維氨基基片點(diǎn)制高密度OligO的芯片(31K)點(diǎn)制效果圖4是高分子聚合物三維氨基基片點(diǎn)制高密度Oligo的芯片(31K)雜交效果圖； 圖5是高分子聚合物三維氨基基片點(diǎn)制高密度Oligo的芯片(22K)點(diǎn)制效果圖； 圖6是高分子聚合物三維氨基基片點(diǎn)制高密度miRNA芯片的雜交效果圖。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
殼聚糖(chitosan)、多聚賴氨酸(polylysine)、聚亞乙基亞胺 (polyethyleneimine)、聚烯丙基胺(polyallylamine)均購自Sigma。
(3-Glycidyloxypropyl)trimethoxysilane)(簡稱GPTMS)購自Sigma; (3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilane)(簡稱GPDMES)購自Sigma; (3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsilane)(簡稱GP醒S)購自Sigma;
Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-印oxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane] 購自Sigraa。
下述實(shí)施例中的殼聚糖均為先用1% (體積百分比)醋酸溶解，然后根據(jù)所需濃 度要求配制成O. 1XPBS的相應(yīng)濃度的殼聚糖稀溶液，且pH值調(diào)為5.(T6.0。
實(shí)施例1、通過在玻片片基上吸附殼聚糖，制備甲殼素基片
1、 玻璃片基的預(yù)處理
將玻片片基在Piranha溶液(濃H2S04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡過夜，然后用 去離子水清洗、干凈；在120度的真空烘箱中真空烘烤lh;
2、 吸附殼聚糖高分子
所用的殼聚糖的分子量為31萬-37.5萬Da (高分子量)；
殼聚糖反應(yīng)液為終濃度為O. 1% (質(zhì)量百分含量)的殼聚糖的O. IX PBS緩沖
液，所述終濃度為殼聚糖在殼聚糖反應(yīng)液中的濃度；殼聚糖反應(yīng)液的pH值調(diào)至為
6.0。
將步驟l得到的干凈疏水玻片片基浸入殼聚糖反應(yīng)液中，在3(TC、以120 rpm 的速度搖動的條件下浸泡30小時(shí)；停止浸泡，將玻片用去離子水洗滌、甩干，得 到甲殼素基片。
玻片片基通過表面清洗和表面改性，與富含氨基的聚合物高分子殼聚糖上的部 分氨基發(fā)生靜電吸附作用從而使玻片片基表面吸附上殼聚糖高分子，這樣，每個(gè)殼聚糖分子上還剩下多數(shù)氨基，從而使二維玻片表面形成三維的氨基，該三維氨基基 片即為甲殼素基片。
實(shí)施例2、通過在玻片片基上吸附殼聚糖，制備甲殼素基片
1、 玻璃片基的預(yù)處理 同實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)1;
2、 吸附殼聚糖高分子
所用的殼聚糖的分子量為5萬-19萬Da (高分子量)；
殼聚糖反應(yīng)液為終濃度為0.3% (質(zhì)量百分含量)的殼聚糖的O. IX PBS緩沖 液，所述終濃度為殼聚糖在殼聚糖反應(yīng)液中的濃度；殼聚糖反應(yīng)液的pH值調(diào)至為 5. 0。
將步驟l得到的干凈疏水玻片片基浸入殼聚糖反應(yīng)液中，在10'C、以120 rpm 的速度搖動的條件下浸泡0.5小時(shí)；停止浸泡，將玻片用去離子水洗滌、甩干，得 到甲殼素基片。
實(shí)施例3、通過在玻片片基上吸附殼聚糖，制備甲殼素基片
1、 玻璃片基的預(yù)處理 同實(shí)施例l中的實(shí)驗(yàn)l;
2、 吸附殼聚糖高分子
所用的殼聚糖的分子量為19萬-31萬Da (高分子量)；
殼聚糖反應(yīng)液為終濃度為0.001% (質(zhì)量百分含量)的殼聚糖的O. IX PBS緩 沖液，所述終濃度為殼聚糖在殼聚糖反應(yīng)液中的濃度；殼聚糖反應(yīng)液的pH值調(diào)至 為6.0。
將步驟l得到的干凈疏水玻片片基浸入殼聚糖反應(yīng)液中，在5(TC 、以120rpm 的速度搖動的條件下浸泡15小時(shí)；停止浸泡，將玻片用去離子水洗滌、甩干，得 到甲殼素基片。
實(shí)施例4、在玻璃片基上吸附聚烯丙基胺(polyallylamine)或聚亞乙基亞胺 (polyethyleneimine)，制備PAA基片、PEI基片 1、玻璃片基的預(yù)處理同實(shí)施例1中的實(shí)驗(yàn)l; 2、吸附聚烯丙基胺高分子 所用的聚烯丙基胺的分子量為6. 5萬；
聚烯丙基胺反應(yīng)液為終濃度為0.03% (質(zhì)量百分含量)的聚烯丙基胺的水溶 液，所述終濃度為聚烯丙基胺在聚烯丙基胺反應(yīng)液中的濃度。
將步驟1得到的干凈疏水玻片片基浸入聚烯丙基胺反應(yīng)液中，在25°C 、以120 rpm的速度搖動的條件下浸泡15小時(shí)；停止浸泡，將玻片用去離子水洗滌、甩干， 得到PAA基片。
在上述方法中，將聚烯丙基胺替換為聚亞乙基亞胺(分子量為2.5萬)，得到 PEI基片。
實(shí)施例5、用化學(xué)方法制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備PLL基片
1、 片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理目的是使玻片表面裸露出活性的羥基； 將玻片片基在Piranha溶液(濃H2S04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡過夜，然后用
去離子水清洗、甩干；或?qū)⒉Ｆ萌ルx子水清洗、甩干后進(jìn)行通氧條件下Plasma 處理2min;
2) 環(huán)氧基化將步驟l)預(yù)處理后的玻片片基置于含有GPTMS的乙醇溶液中， GPTMS在乙醇溶液中的濃度為1% (體積百分含量)，在5(TC、 120rpm搖動條件下 反應(yīng)15小時(shí)；用乙醇清洗、甩干；
2、 接枝多聚賴氨酸(Polylysine)高分子 所用的多聚賴氨酸的分子量為7萬-15萬Da
多聚賴氨酸反應(yīng)液:為終濃度為0. 08%(質(zhì)量百分含量)的多聚賴氨酸的0. IX PBS 緩沖液，所述終濃度為多聚賴氨酸在多聚賴氨酸反應(yīng)液中的濃度。
將步驟1得到的環(huán)氧基化的玻片片基浸入多聚賴氨酸反應(yīng)液中，在5(TC、以120 rpm的速度搖動的條件下反應(yīng)30小時(shí)；停止反應(yīng)，將玻片用去離子水洗滌、甩干；
3、 封閉未連接多聚賴氨酸的環(huán)氧基團(tuán)
封閉方法以含0.01% (體積百分比)二乙胺的O. 1XPBS緩沖液作為封閉液， 室溫封閉l小時(shí)；洗滌干燥，得到PLL基片。
玻片通過表面清洗和表面改性露出硅羥基，硅羥基與GPTMS反應(yīng)使玻片表面為環(huán)氧基團(tuán)分布，然后每個(gè)多聚賴氨酸分子上的一個(gè)氨基或多個(gè)氨基與玻片表面上的 環(huán)氧基團(tuán)反應(yīng)形成共價(jià)鍵，每個(gè)多聚賴氨酸分子上剩下的氨基使玻片表面形成三維 的氨基，該三維氨基基片即為PLL基片。
實(shí)施例6、用化學(xué)方法制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備甲殼素基片
1、 片基的環(huán)氧基化
同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)1;
2、 接枝殼聚糖(chitosan)高分子 所用的殼聚糖的分子量為5萬-19萬Da (中分子量)；
殼聚糖反應(yīng)液為終濃度為0.3% (質(zhì)量百分含量)的殼聚糖的O. IX PBS緩沖 液，所述終濃度為殼聚糖在殼聚糖反應(yīng)液中的濃度；殼聚糖反應(yīng)液的pH值調(diào)至為 5. 5。
將步驟l得到的環(huán)氧基化的玻片片基浸入殼聚糖反應(yīng)液中，在1(TC、以120rpm 的速度搖動的條件下反應(yīng)0.5小時(shí)；停止反應(yīng)，將玻片用去離子水洗滌、甩干；
3、 封閉未連接殼聚糖的環(huán)氧基團(tuán)
封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到甲殼素基片。
實(shí)施例7、用化學(xué)方法制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備PEI基片
1、 片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理-
將玻片片基在Piranha溶液(濃H2S04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡過夜，然后用 去離子水清洗、甩干；或?qū)⒉Ｆ萌ルx子水清洗、甩干后進(jìn)行通氧條件下Plasma 處理2min;
2) 環(huán)氧基化將步驟l)預(yù)處理后的玻片片基置于含有GPD醒S的異丙醇溶液 中，GPD醒S在異丙醇溶液中的濃度為O.OP/。(體積百分含量)，在70。C、 150 rpm 搖動條件下反應(yīng)0.5小時(shí)；用異丙醇清洗、甩干；
2、 接枝聚亞乙基亞胺(polyethyleneimine)高分子 所用的聚亞乙基亞胺的分子量為25,000 Da (低分子量)
聚亞乙基亞胺反應(yīng)液為終濃度為0.001% (質(zhì)量百分含量)的聚亞乙基亞胺的 水溶液，所述終濃度為聚亞乙基亞胺在聚亞乙基亞胺反應(yīng)液中的濃度。
10將步驟l得到的環(huán)氧基化的玻片片基浸入聚亞乙基亞胺反應(yīng)液中，在25。C、以
150rpra的速度搖動的條件下反應(yīng)15小時(shí)；停止反應(yīng)，將玻片用去離子水洗漆、甩 干；
3、封閉未連接聚亞乙基亞胺的環(huán)氧基團(tuán) 封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到PEI基片。
實(shí)施例8、用化學(xué)方法制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備PAA基片
1、 片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理
將玻片在Piranha溶液(濃H2S 04/30%H202， V/V=7:3)中浸泡過夜，然后用去離 子水清洗、甩干；或?qū)⒉Ｆ萌ルx子水清洗、甩干后進(jìn)行通氧條件下Plasma處理 2min;
2) 環(huán)氧基化將步驟l)預(yù)處理后的玻片片基置于含有GPDMES的甲苯溶液中， GPDMES在甲苯溶液中的濃度為10% (體積百分含量)，在15i:、 150rpm搖動條件 下反應(yīng)30小時(shí)；用甲苯清洗、甩干；
2、 接枝polyallylamine高分子
所用的polyallylamine的分子量為65, 000 Da (低分子量)
polyallylamine反應(yīng)液為終濃度為0. 05%(質(zhì)量百分含量)的polyallylamine
的水溶液，所述終濃度為polyallylamine在polyallylamine反應(yīng)液中的濃度。 將步驟l得到的環(huán)氧基化的玻片浸入polyallylamine反應(yīng)液中，在10°C、以
150rpm的速度搖動的條件下反應(yīng)30小時(shí)；停止反應(yīng)，將玻片用去離子水洗滌、甩
干；
3、 封閉未連接polyallylamine的環(huán)氧基團(tuán) 封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到PAA基片。
實(shí)施例9、用化學(xué)方法(水相中)制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備 甲殼素基片
1、片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)1中的1);
2) 環(huán)氧基化將步驟l)預(yù)處理后的玻片置于含有GPTMS的水溶液中，GPTMS在水溶液中的濃度為0.5% (體積百分含量)，在50。C、 120 rpm搖動條件下反應(yīng) 20小時(shí)；用去離子水清洗、甩干；
2、 接枝殼聚糖(chitosan)高分子 所用的殼聚糖的分子量為5萬-19萬Da (中分子量)；
殼聚糖反應(yīng)液為終濃度為0.05% (質(zhì)量百分含量)的殼聚糖的0. IX PBS緩沖 液，所述終濃度為殼聚糖在殼聚糖反應(yīng)液中的濃度；殼聚糖反應(yīng)液的pH值調(diào)至為 6.0。
將步驟l得到的環(huán)氧基化的玻片浸入殼聚糖反應(yīng)液中，在25'C、以120rpm的 速度搖動的條件下反應(yīng)3小時(shí)；停止反應(yīng)，將玻片用去離子水洗滌、甩干；
3、 封閉未連接殼聚糖的環(huán)氧基團(tuán)
封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到甲殼素基片。
實(shí)施例10、用化學(xué)方法(水相中)制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備 甲殼素基片
1、 片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)1中的l);
2) 環(huán)氧基化將步驟l)預(yù)處理后的玻片置于含有GPTMS的水溶液中，GPTMS 在水溶液中的濃度為10% (體積百分含量)，在15'C、 120 rpm搖動條件下反應(yīng)30 小時(shí)；用去離子水清洗、甩干；
2、 接枝殼聚糖(chitosan)高分子 同實(shí)施例9中的實(shí)驗(yàn)2;
3、 封閉未連接殼聚糖的環(huán)氧基團(tuán)
封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到甲殼素基片。
實(shí)施例11、用化學(xué)方法(水相中)制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備 甲殼素基片
1、片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)1中的1);
2) 環(huán)氧基化將步驟l)預(yù)處理后的玻片置于含有GPTMS的水溶液中，GPTMS 在水溶液中的濃度為0.01% (體積百分含量)，在70"C、 120 rpm搖動條件下反應(yīng)0.5小時(shí)；用去離子水清洗、甩干；
2、 接枝殼聚糖(chitosan)高分子
同實(shí)施例9中的實(shí)驗(yàn)2;
3、 封閉未連接殼聚糖的環(huán)氧基團(tuán)
封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到甲殼素基片。
實(shí)施例12、用物理方法制備環(huán)氧基化的玻璃片基，再用此片基制備甲殼素基片
1、 片基的環(huán)氧基化
1) 片基的預(yù)處理將玻片片基在Piranha溶液(濃H2S04/30%H202， V/V二7:3)中 浸泡過夜，然后用去離子水清洗、甩干；
2) 環(huán)氧基化用終濃度為1% (體積百分含量)的
Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-epoxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane] 的二氯甲烷溶液，通過提拉法在步驟l)預(yù)處理后的玻片片基表面物理吸附一層環(huán) 氧基團(tuán)；所述終濃度為Poly[dimethylsiloxane-co-(2-(3， 4-epoxycyclohexyl) ethyl)methylsiloxane]在二氯甲烷溶液中的濃度；用去離子水清洗、甩干；
2、 接枝殼聚糖(chitosan)高分子 所用的殼聚糖的分子量為19萬-31萬Da (中分子量)；
殼聚糖反應(yīng)液殼聚糖反應(yīng)液為終濃度為0.06% (質(zhì)量百分含量)的殼聚糖 的O. 1XPBS緩沖液，所述終濃度為殼聚糖在殼聚糖反應(yīng)液中的濃度；殼聚糖反應(yīng) 液的pH值調(diào)至為6.0。
將步驟l得到的環(huán)氧基化的玻片浸入殼聚糖反應(yīng)液中，在3(TC、以120rpm的 速度搖動的條件下反應(yīng)5小時(shí)；停止反應(yīng)，將玻片用去離子水洗滌、甩干；
3、 封閉未連接殼聚糖的環(huán)氧基團(tuán)
封閉方法同實(shí)施例5中的實(shí)驗(yàn)3;洗滌干燥，得到甲殼素基片。
由實(shí)施例1-12制得的高分子聚合物三維氨基基片的表面分子結(jié)構(gòu)示意圖如圖 l所示，基片每個(gè)點(diǎn)上去是一條含有幾個(gè)、幾十個(gè)或更多氨基的長鏈聚合物，所以 整個(gè)基片表面形成一種高分子聚合物三維氨基分布。
實(shí)施例13、高分子聚合物三維氨基基片以及普通氨基基片應(yīng)用于高密度的核酸芯片的制備
本實(shí)施例所用的普通氨基基片為目前常用的玻片氨基硅烷化方法制得，即玻片 先進(jìn)行氨基硅垸化后烘烤交聯(lián)，即得普通氨基基片。
本實(shí)施例所用的高分子聚合物三維氨基基片是分別由實(shí)施例1-12中方法得到的。
1. 將31K種46-55mer的01igo樣品(購自德國operon公司，產(chǎn)品編號 Cat#852102，商品名Homo sapiens (human) Promoter CoRe)進(jìn)行點(diǎn)樣，每種樣 品取出10ul轉(zhuǎn)移加入384孔板中；
2. 通過自動點(diǎn)樣裝置將準(zhǔn)備好的點(diǎn)樣樣品點(diǎn)到高分子聚合物三維氨基基片以 及普通氨基基片表面。每張芯片包括48個(gè)點(diǎn)陣，每個(gè)點(diǎn)陣包含702個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)間距 是160uM，普通氨基基片、實(shí)施例1制得的甲殼素基片以及實(shí)施5制得的PLL基片 的點(diǎn)制效果分別如圖2、圖3(a)、圖3(b)所示；實(shí)施例2-4、 6-12制得的高分子聚 合物三維氨基基片具有相似效果。
3. 將點(diǎn)樣后芯片于125-400 mj紫外交聯(lián)進(jìn)行固定，隨后清洗、甩干；
4. 樣品制備、擴(kuò)增、標(biāo)記；
5. 向每個(gè)芯片點(diǎn)陣上加入帶有標(biāo)記樣品的雜交液，在100%濕度下，于42。C下 雜交12-16小時(shí)；雜交液0. 1%SDS、 3XSSC、 25%甲酰胺、5XDenhardt， s。
6. 反應(yīng)后芯片分別用兩種洗液清洗，離心甩干；兩種特定洗液I和II的組成分 別為洗液I: 0. 3XSSC/0. 1%SDS;洗液II: 0. 06XSSC。
7. 芯片掃描和數(shù)據(jù)處理。實(shí)施例l制得的甲殼素基片以及實(shí)施5制得的PLL 基片檢測掃描結(jié)果如圖4(a)、圖4(b)所示。實(shí)施例2-4、 6-12制得的高分子聚合 物三維氨基基片具有相似效果。
在本實(shí)驗(yàn)中，用本發(fā)明高分子聚合物氨基基片和普通氨基基片分別制作芯片 時(shí)，所用的探針與反應(yīng)液都完全相同，相應(yīng)的反應(yīng)條件等也都相同。
使用晶芯TMLuxscan-10K/A (博奧生物有限公司)掃描點(diǎn)樣后的芯片，掃描參數(shù) 均設(shè)定Laser/PMT=90/900。掃描結(jié)果表明，在點(diǎn)制高密度Oligo芯片過程中，對于 普通氨基基片，剛開始點(diǎn)樣時(shí)，普通氨基基片的點(diǎn)直徑在100土3um，然后每個(gè)點(diǎn)陣 點(diǎn)直徑開始變小，趨勢非常明顯，變小的點(diǎn)直徑在20-50mn之間；對于本發(fā)明的高 分子聚合物三維氨基基片，在整個(gè)長時(shí)間點(diǎn)樣過程中(點(diǎn)樣環(huán)境濕度大)，點(diǎn)直徑 幾乎沒有變化，說明基片表面性質(zhì)更穩(wěn)定，如甲殼素基片一直在135士3咖，PLL基片一直在145±3um。
使用晶芯TMLuxscan-10K/A (博奧生物有限公司)掃描雜交后的芯片，掃描參數(shù) 均設(shè)定Cy3通道Laser/PMT=85/850， Cy5通道Laser/PMT=93/940。掃描結(jié)果表明， 本發(fā)明的高分子聚合物三維氨基基片的樣品分子固定靈敏度高，樣品點(diǎn)飽滿，且所 有點(diǎn)的直徑大小幾乎相等，如甲殼素基片均為135士3um， PLL基片均為145士3um， 且界限非常明顯，易于提取數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)分析。普通氨基基片由于從點(diǎn)制效果可以判 斷雜交效果很差，且即便雜交有信號但大部分點(diǎn)因?yàn)辄c(diǎn)直徑太小(20-50uin)難于 提取數(shù)據(jù)，所有沒有進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)。
實(shí)施例14、高分子聚合物三維氨基基片應(yīng)用于高密度的核酸芯片的制備 本實(shí)施例所用的高分子聚合物三維氨基基片是分別由實(shí)施例1-12中方法得到的。
1. 將22K種70mer的01igo樣品(購自德國operon公司，產(chǎn)品編號GS-500-16， 商品名Homo sapiens (human) AROS V2.1)進(jìn)行點(diǎn)樣，每種樣品取出lOul轉(zhuǎn)移加 入384孔板中；
2. 通過自動點(diǎn)樣裝置將準(zhǔn)備好的點(diǎn)樣樣品點(diǎn)到高分子聚合物三維氨基基片表 面。每張芯片包括48個(gè)點(diǎn)陣，每個(gè)點(diǎn)陣包含482個(gè)點(diǎn)，點(diǎn)間距是185uM，實(shí)施8 制得的PAA基片以及實(shí)施例7制得的PEI基片的點(diǎn)制效果分別如圖5 (a)、圖5 (b) 所示；實(shí)施例1-6和9-12制得的高分子聚合物三維氨基基片具有相似效果。考慮 到實(shí)施例13中的普通氨基基片點(diǎn)制高密度Oligo芯片效果很差，所以本實(shí)施例中 點(diǎn)制高密度Oligo芯片沒有加入普通氨基基片。
使用晶芯TMLuxscan-10K/A (博奧生物有限公司)掃描點(diǎn)樣后的芯片，掃描參數(shù) 均設(shè)定Laser/PMT^90/900。掃描結(jié)果表明，在點(diǎn)制高密度Oligo芯片過程中，對于 本發(fā)明的高分子聚合物三維氨基基片，在整個(gè)長時(shí)間點(diǎn)樣過程中(點(diǎn)樣環(huán)境濕度 大)，PEI基片和PAA基片點(diǎn)直徑幾乎沒有變化，PAA基片點(diǎn)直徑為130土3uM， PEI 基片點(diǎn)直徑為160土3uM，都沒有隨點(diǎn)樣先后順序，樣點(diǎn)點(diǎn)直徑變小趨勢，說明基片 穩(wěn)定性高。
實(shí)施例15、將高分子聚合物三維氨基基片應(yīng)用于哺乳動物miRNA芯片的制備 生物芯片的制備過程如下
151. 哺乳動物microRNA芯片V3. 0，針對人677 (包含jVa"re雜志預(yù)測的有122 個(gè)，#3fwre 2005， 434， 338-345.)、大鼠292、小鼠461個(gè)成熟microRNA，(由 于人、大鼠和小鼠的miRNA三者具有共同的序列，取三者的并集)， 一共設(shè)計(jì)了 924條探針(數(shù)據(jù)來自Sanger miRNA數(shù)據(jù)庫miRBaselO. 0)。將這924種核酸探 針用博奧核酸點(diǎn)樣液配制成相應(yīng)924種樣品，每種樣品取出lOuM轉(zhuǎn)移加入384孔 板中；
2. 通過自動點(diǎn)樣裝置將準(zhǔn)備好的點(diǎn)樣樣品分別點(diǎn)到實(shí)施例l-12制備的高分子 聚合物三維氨基基片表面。每張基片點(diǎn)制兩個(gè)點(diǎn)陣。每個(gè)點(diǎn)陣分成8個(gè)亞陣，點(diǎn)陣 示意如圖5:每個(gè)亞陣有22行，21列，點(diǎn)間距為245um，點(diǎn)的直徑為150 ii ra。每 條探針對每種基片重復(fù)三次。
3. 將點(diǎn)樣后芯片于125-400 mj紫外交聯(lián)進(jìn)行固定，隨后清洗、甩干；
4. 樣品制備、標(biāo)記；
5. 向每個(gè)芯片點(diǎn)陣加入含有標(biāo)記的樣品雜交液，雜交液組成為0. 2%SDS、 3X SSC， 25%甲酰胺、5XDenhardt， s。在100%濕度下，于42°C下雜交12-16小時(shí)；
6. 反應(yīng)后芯片分別用兩種洗液清洗，離心甩干；兩種特定洗液I和II的組成分 別為洗液I: 0. 3XSSC/0. 1%SDS;洗液II: 0. 06XSSC。
7. 芯片掃描和數(shù)據(jù)處理。使用晶芯tm Luxscan-10K/A (博奧生物有限公司)掃 描雜交后的miRNA芯片，掃描參數(shù)均設(shè)定Laser/PMT^95/710。實(shí)施例9制得的甲殼 素基片檢測掃描結(jié)果如圖6所示。實(shí)施例1-8和10-12制得的其它高分子聚合物三 維氨基基片具有相似效果。
掃描結(jié)果表明，本發(fā)明的高分子三維氨基基片所有點(diǎn)的直徑大小幾乎相等，沒 有隨點(diǎn)樣順序減小的趨勢，說明基片穩(wěn)定性高，點(diǎn)形狀飽滿，均為130土3um，且界 限非常明顯，易于提取數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)分析。
權(quán)利要求
1、一種制備生物芯片基片的方法，包括如下步驟在玻片片基表面連接富含氨基的聚合物，得到表面連接上富含氨基的聚合物的基片。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述連接的方法包括如下步驟: 將所述玻片片基置于所述富含氨基的聚合物的溶液中，吸附，得到所述基片。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述吸附的溫度為10-50°C。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述吸附的時(shí)間為0.5-30小時(shí)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述連接的方法包括如下步驟: 將所述玻片片基環(huán)氧基化，得到環(huán)氧基化的玻片片基；將所述環(huán)氧基化的玻片片基 置于所述富含氨基的聚合物的溶液中，接枝反應(yīng)，得到所述基片。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述將玻片片基環(huán)氧基化的方 法包括如下步驟將所述玻片片基置于環(huán)氧基硅烷化試劑的溶液中，進(jìn)行環(huán)氧基化 反應(yīng)，得到所述環(huán)氧基化的玻片片基。
7、 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:所述環(huán)氧基化反應(yīng)的溫度為15-70。c。
8、 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于所述環(huán)氧基硅烷化試劑的溶液的溶劑為異丙醇、乙醇、甲苯或水。
9、 根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于所述環(huán)氧基硅烷化試 劑的溶液中環(huán)氧基硅烷化試劑的濃度為0.01%-10% (體積百分含量)。
10、 根據(jù)權(quán)利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于所述環(huán)氧基硅烷化 試劑為(3-Glycidyloxypropyl) triraethoxysilane、(3-Glycidoxypropyl)dimethylethoxysilane或 (3-Glycidoxypropyl)dimethoxymethylsilane。
11、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述將所述玻片片基環(huán)氧基化的方法為將環(huán)氧基聚硅氧烷涂敷在所述玻片片基的表面，得到所述環(huán)氧基化的玻片 片基。
12、 根據(jù)權(quán)利要求5-11中任一所述的方法，其特征在于所述接枝反應(yīng)的溫 度為10-5(TC。
13、 根據(jù)權(quán)利要求5-12中任一所述的方法，其特征在于所述接枝反應(yīng)的時(shí)間為0. 5-30小時(shí)。
14、 根據(jù)權(quán)利要求2-13中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚 合物的溶液中富含氨基的聚合物的濃度為0.001%-0.3% (質(zhì)量百分含量)。
15、 根據(jù)權(quán)利要求2-14中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚 合物的溶液為水相。
16、 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚 合物為殼聚糖、多聚賴氨酸、聚亞乙基亞胺或聚烯丙基胺。
17、 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于所述殼聚糖的溶液是按照包 括如下步驟的方法制得的先用醋酸溶解殼聚糖，得到溶液I，再用O. 1XPBS緩 沖液稀釋所述溶液I ，得到殼聚糖的溶液；所述殼聚糖的溶液pH值為5. 0-6. 0。
18、 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一所述的方法，其特征在于所述富含氨基的聚合物的分子量為0. 1萬-50萬Da。
19、 由權(quán)利要求1-18中任一所述方法制備得到的生物芯片基片。
20、 由權(quán)利要求19中所述基片制得的生物芯片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高分子聚合物三維氨基基片及其制備方法與應(yīng)用。該制備生物芯片基片的方法，包括如下步驟在玻片片基表面連接富含氨基的聚合物，得到表面連接上富含氨基的聚合物的基片。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的基片生物分子固定靈敏度大大提高、樣品點(diǎn)飽滿、基片表面性質(zhì)更穩(wěn)定、確保長時(shí)間樣品點(diǎn)制過程中樣品點(diǎn)的形狀始終保持均一、非特異性吸附和自發(fā)熒光背景均非常低。本發(fā)明基片適合長時(shí)間點(diǎn)樣的高密度芯片的點(diǎn)制，解決了普通氨基基片存在的長時(shí)間點(diǎn)制的高密度芯片中遇到大部分樣品固定不上的問題。本發(fā)明基片是一種性能優(yōu)良的生物芯片基底材料，可廣泛應(yīng)用于各種生物芯片的制備上。
文檔編號C03C17/28GK101643321SQ20091009214
公開日2010年2月10日 申請日期2009年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月1日
發(fā)明者品 呂, 周玉祥, 佳 王, 王素珍, 甘五鵬, 京 程, 黃明賢 申請人:博奧生物有限公司;清華大學(xué)