專利名稱：芫花素和櫻花素衍生物、其化妝和治療用途及其制備方法
專利說(shuō)明芫花素和櫻花素衍生物、其化妝和治療用途及其制備方法 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及芫花素(genkwanin)和櫻花素(sakuranetin)的糖衍生物。更具體而言，一方面涉及下式I的芫花素和櫻花素的糖衍生物的(i)化妝和皮膚病學(xué)用途，另一方面涉及其治療用途，(ii)作為工業(yè)產(chǎn)物的式I的新衍生物，和(iii)它們的制備方法。
根據(jù)本發(fā)明的化合物相應(yīng)于式I
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，R表示H或糖殘基，尤其是S1或S2的結(jié)構(gòu)的糖殘基
Z表示H或C1-C4烷基、C1-C5?；?、糖基或硫酸基(sulfate group)。
現(xiàn)有技術(shù) 已知過(guò)去已經(jīng)描述并研究了多種式I的產(chǎn)物。特別是，5-O-β-D-櫻草糖基-芫花素(5-O-β-D-primeverosyl-genkwanin)(是一種式I的化合物，其中，符號(hào)表示雙鍵，R是結(jié)構(gòu)S2的糖殘基，Z是H)通過(guò)提取Gnidia kraussiana(一種來(lái)自Thymeleacea科的非洲稀樹(shù)草原(savanna)的植物)而獲得，并具有免疫(特別是免疫刺激)、抗癌和抗白血病的性質(zhì)。更具體而言，在嚴(yán)重的免疫病癥期間，生理學(xué)的淋巴母細(xì)胞(lymphoblast)增生，5-O-β-D-櫻草糖基-芫花素的價(jià)值在于它破壞所形成的淋巴母細(xì)胞。就此方面參見(jiàn)FR 2 510 580 A、FR 2597 751A以及Jer-Huei LIN等的文章，Yaowu shipin Fenxi，2001；9(1)，6-11。
喬松酮-5-葡糖苷(pinostrobin-5-glucoside)(是一種式I的化合物，其中，符號(hào)表示雙鍵，R是H，Z是H)是從Prunus cerasus的樹(shù)皮分離出來(lái)的，并被認(rèn)為是物種prunus cerasus的特征。就此方面參見(jiàn)Martin Geibel等的文章Phythochemistry，1991；30(5)，1519-1521。
櫻花甙(sakuranin)，別名櫻花素-5-葡糖苷(是一種式I的化合物，其中，符號(hào)表示單鍵，R是H，Z是H)是從Prunus yedoensis分離出來(lái)的，沒(méi)有研究其可能的化妝品或藥學(xué)性質(zhì)(特別是自由基清除(scavenging)性質(zhì))。就此方面參見(jiàn)出版物Merck Index，第12版，1996，Monograph No.8470，第1431-1432頁(yè)。
上述現(xiàn)有技術(shù)沒(méi)有描述或暗示根據(jù)本發(fā)明的式I化合物在以下方面具有有利的性質(zhì) -在化妝品或皮膚藥劑學(xué)方面作為用于改善皮膚肌理的物質(zhì)，和 -在人類或獸用治療方面(特別是溫血?jiǎng)游?作為自由基清除劑。


發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明第一方面，推薦了芫花素和櫻花素的糖衍生物的新用途，作為(a)化妝品或皮膚病學(xué)物質(zhì)，或(b)自由基清除物質(zhì)，分別用于(a)改善皮膚的肌理(texture)，或者，(b)治療或預(yù)防由自由基引起的病癥。
在這點(diǎn)上，一方面提供了(a)在化妝品或皮膚病學(xué)的新用途，或者另一方面提供了(b)在人類或獸用治療上的新用途，所述用途其特征在于使用選自以下的物質(zhì) (i)式I的芫花素或櫻花素的糖的衍生物
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，R表示H或糖殘基，特別是S1或S2的結(jié)構(gòu)
Z表示H或C1-C4烷基、C1-C5?；?、糖基或硫酸基，和(ii)它們的混合物， 作為(a)化妝品或皮膚病學(xué)活性成分，或者作為(b)自由基清除活性成分，用于獲得(a)用來(lái)改善皮膚肌理的化妝品或皮膚病學(xué)制劑，或者獲得(b)用來(lái)治療由自由基引起的病癥的藥物。
根據(jù)本發(fā)明第二方面，推薦其中R尤其是結(jié)構(gòu)S1的糖殘基的式I化合物以及其混合物作為新的工業(yè)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明第三方面，推薦一種用于制備式I化合物的方法，特別是用于制備所述新化合物的方法。



附圖涉及一些用式I產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)試的測(cè)試結(jié)果 圖1表示所測(cè)試的式I產(chǎn)物具有自由基清除性質(zhì)，以及 圖2和圖3顯示所測(cè)試的式I產(chǎn)物作為免疫抑制劑是有價(jià)值的。
發(fā)明詳述 本發(fā)明一方面涉及當(dāng)符號(hào)表示雙鍵時(shí)的芫花素的糖衍生物，另一方面涉及當(dāng)所述符號(hào)表示單鍵時(shí)的櫻花素的糖衍生物。
在Z的定義中，C1-C4烷基包括具有烴基鏈的線性或支鏈基團(tuán)，即，甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基；C1-C5?；ê?～5個(gè)碳原子、具有烴基鏈的線性或支鏈脂族基團(tuán)，即，CH3CO、CH3CH2CO、CH3CH2CH2CO、(CH3)2CHCO、CH3CH2CH2CH2CO、(CH3)2CHCH2CO、CH3CH2CH(CH3)CO和(CH3)3CCO基團(tuán)；硫酸基包括殘基SO3-，其主要在酸形式SO3H中遇到，適當(dāng)情況下在鹽形式如SO3NH4或SO3Na中遇到。最后，基團(tuán)Z可以表示糖殘基，特別是葡糖基、木糖基、硫代木糖基、果糖基、甘露糖基等殘基。
R定義中所包括的糖基可以是任何糖殘基，特別是以上為Z基團(tuán)所列舉的殘基中的。有利地，根據(jù)本發(fā)明的基團(tuán)R是結(jié)構(gòu)S1或S2，優(yōu)選結(jié)構(gòu)S1。
本發(fā)明的式I化合物中，有利地可以提及 ●式Ia的5-[O-6-(D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃葡糖基]氧基-2-(4-乙氧基苯基)-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮[其它命名4′-乙氧基-芫花素-5-(D-葡糖苷)-β-D-葡糖苷]
是本發(fā)明最有利的產(chǎn)物； ●上述式IIa的5-O-β-D-櫻草糖基-芫花素
●上述式IIIa的喬松酮-5-葡糖苷
●式Ib的2，3-二氫-5-[O-6-(D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃葡糖基]氧基-2-(4-乙氧基苯基)-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮[其它命名4′-乙氧基櫻花素-5-(D-葡糖苷)-β-D-葡糖苷
其為式Ia產(chǎn)物的同系物，用櫻花素代替芫花素， ●式IIb的5-O-β-D-櫻草糖基-櫻花素
及其衍生物，其中Z是硫酸基(優(yōu)選SO3H，或者適當(dāng)情況下是SO3Na或者甚至SO3NH4)。
根據(jù)本發(fā)明的新化合物中，更具體地可以提及式IV的產(chǎn)物
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，Z1具有與以上Z相同的定義，并有利地表示C1-C4烷基(優(yōu)選乙基)或硫酸基(優(yōu)選SO3H基團(tuán))。
式I的化合物可以通過(guò)本身已知的方法通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)機(jī)理和/或提取工藝而制得。例如(i)芫花素、櫻花素或它們的糖從屬于李屬(Prunus)、南香屬(Gnidia)和瑞香屬(Daphne)的合適的植物提取；(ii)苷元(aglycone)在5位被合適的糖所糖基化(osylated)(必要時(shí)，如果4′位的OH官能團(tuán)沒(méi)有被保護(hù)，則將其封閉(blocking)后進(jìn)行糖基化)，和/或(iii)將如上所述提取或制備的糖的4′-OH基團(tuán)(必要時(shí)，在使4′-OH基團(tuán)去保護(hù)后)醚化(特別是使用烷基碘化物，以不影響糖部分的OH基團(tuán))、酯化或硫酸化(sulfated)。
根據(jù)本發(fā)明推薦的用于制備式Ia化合物的方法的特征在于，其包括以下步驟 (1°)用CH2Cl2提取Daphne gnidium研碎的根； (2°)過(guò)濾以舍棄由此獲得的二氯甲烷溶液，并收集干燥的固體殘留物； (3°)用CH3OH提取由此獲得的所述干燥的固體殘留物； (4°)過(guò)濾以收集由此獲得的甲醇溶液，并舍棄所得的固體殘留物； (5°)在真空下，在小于或等于60℃的溫度下，蒸發(fā)干燥由此收集的甲醇溶液，從而獲得固體殘留物； (6°)在小于或等于60℃的溫度下，攪拌下用水洗滌在步驟(5°)中獲得的固體殘留物，并放置冷卻； (7°)除去洗滌水，然后用CH3OH吸收固體殘留物； (8°)重復(fù)步驟(5°)到(7°)的操作循環(huán)3到7次，直到最終的洗滌水是淺黃色并且澄清的； (9°)將所得的干燥殘留物吸收在25/2w/w的甲醇/水混合物中，干燥殘留物的量適合獲得密度為0.885g/mL的液體； (10°)使所述液體在2-4℃，優(yōu)選在3℃下靜置至少2天，優(yōu)選3天，并收集所形成的沉淀； (11°)用甲醇，然后用醚含量增加的甲醇/醚混合物相繼洗滌所述沉淀，直到上清液是無(wú)色的； (12°)濾出由此獲得的沉淀，并用醚洗滌幾次，直到洗滌醚是無(wú)色的； (13°)濾出并干燥所得的固體產(chǎn)物，其由式Ia、IIa和IIIa產(chǎn)物的混合物組成；和 (14°)必要時(shí)，分離所述混合物，以收集式Ia產(chǎn)物。
實(shí)際上，提取步驟(1°)在溫和條件(即，在30-35℃的溫度和大氣壓(≈105Pa)下，或者在適當(dāng)情況下，在較高溫度和減壓)下，在Kumagawa類型設(shè)備中進(jìn)行3-6天(優(yōu)選5天)；步驟(3°)的提取在溫和條件(特別是在45-55℃的溫度和常壓(≈105Pa)下，或者在適當(dāng)情況下，在較高溫度和減壓)下，在相同設(shè)備中進(jìn)行3-6天(優(yōu)選5天)。
對(duì)于上述優(yōu)選方式，在步驟(13°)后獲得重量比約10/85/5w/w的Ia/IIa/IIIa混合物。
通過(guò)色譜法進(jìn)行純化的作用，是在步驟(14°)后獲得以下結(jié)果 ●富集Ia的Ia/IIa混合物，特別是80/20w/w的Ia/IIa混合物，或者 ●基本上純的式Ia化合物(即，純度大于或等于98％)或更純的式Ia化合物(即，純度大于或等于99.5％)。
式I化合物，特別是式IV新化合物在化妝品或皮膚用藥物中用作改善皮膚肌理的試劑。
當(dāng)以溶液、洗液、凝膠或乳液形式進(jìn)行局部施用時(shí)，乳液情況下可以是多相乳液(例如O/L/O或L/O/L乳液)，式I或IV化合物具有 ●對(duì)于皮膚老化效果的良好作用，特別是用來(lái)減少皺紋并賦予皮膚希望的硬度(firmness)和柔軟性(suppleness)； ●抗老化效果，從而避免注入膠原質(zhì)(collagen)；和 ●調(diào)節(jié)皮膚潤(rùn)濕性的能力。
具體地，由于式I或IV的化合物易于水合形成I.xH2O或IV.xH2O(其中，x是整數(shù)或分?jǐn)?shù)，特別是0.3～5)，所以根據(jù)本發(fā)明，它們?cè)谄つw厚度中用作濕度調(diào)節(jié)劑，或者通過(guò)吸收過(guò)量水，或者特別是當(dāng)皮膚中水含量不足時(shí)通過(guò)提供水而實(shí)現(xiàn)。
除了上述化妝品或皮膚病學(xué)方面外，式I或IV的化合物由于它們的自由基清除性質(zhì)而用于人類或獸用治療，用于治療、尤其是預(yù)防由自由基引起的病癥。
所述病癥具體包括由于體內(nèi)過(guò)量產(chǎn)生或非受控性產(chǎn)生自由基而誘發(fā)的病理癥狀，例如髓細(xì)胞退化疾病(myelodegenerative disease)、燥狂抑郁綜合征(manic-depressive syndrome)和老年性癡呆(senile dementia)。在這些病理學(xué)成為不可逆之前用式I或IV的化合物對(duì)人進(jìn)行治療是特別有利的。
此外，所測(cè)試的所有式IV化合物在其免疫調(diào)節(jié)、抗動(dòng)脈粥樣化(antiatheroma)和抗癌性能方面證實(shí)是有效的。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的物質(zhì)，其由式Ia的產(chǎn)物或上述混合物Ia/IIa/IIIa(即，Daphne gnidium的提取物)和Ia/IIa，其對(duì)于某些急性癌癥和白血病(抑制生長(zhǎng)作用，即，破壞成白血球細(xì)胞(leukoblast))以及慢性髓細(xì)胞樣白血病)是特別活性的。
根據(jù)本發(fā)明，推薦一種化妝品(a)、皮膚藥物(b)或治療的(c)組合物，其特征在于 (a)所述化妝品組合物含有至少一種式I化合物，連同生理可接受的局部賦形劑； (b)所述皮膚藥物組合物含有至少一種式I化合物，連同生理可接受的并且特別是局部的賦形劑；或 (c)所述治療組合物含有至少一種式IV化合物作為免疫調(diào)節(jié)活性成分，特別是抗新近發(fā)作的多發(fā)性硬化(multiple sclerosis)，或者抗癌活性成分，特別是抗慢性髓細(xì)胞樣白血病(chronic myeloid leukemia)，連同生理可接受的并且特別是口服或可注射的賦形劑。
閱讀以下制備實(shí)施例和化妝學(xué)和藥學(xué)測(cè)試的結(jié)果，將更清楚地理解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)和特性。不必說(shuō)，這些數(shù)據(jù)絕非用于限定，而是用于說(shuō)明的目的。
實(shí)施例 幾種代表性的式I化合物與對(duì)比產(chǎn)物(CP.1和CP.2)一起列于表1中比較。 表I 根據(jù)本發(fā)明的代表性化合物 制備A -10/85/5w/w的Ia/IIa/IIIa混合物的制備(Ex.1)- 將11kg Daphne gnidium的根(來(lái)自Thymeleacea科的地中海盆地的植物)研碎，然后在30-35℃下，在Kumagawa類型設(shè)備中，連續(xù)用二氯甲烷處理5天。將由此獲得的液體溶液舍棄，收集并干燥固體殘留物。由此干燥的所述殘留物在所述Kumagawa類型設(shè)備中用熱甲醇(45-55℃)提取5天。舍棄固體殘留物后獲得的甲醇提取物以以下方式進(jìn)行處理在圓底燒瓶中，在低于60℃的溫度下，在減壓下蒸發(fā)至干燥；用熱水洗滌由此獲得的固體殘留物，同時(shí)搖動(dòng)，使得所述殘留物從燒瓶底部分開(kāi)；冷卻到室溫并除去洗滌水；并將殘留物吸收在甲醇中。連續(xù)重復(fù)該處理5到7次，這取決于根的來(lái)源，直到最終的洗滌水澄清并呈淺黃色；所得的殘留物吸收在含有8重量％水的溫?zé)峒状?45-55℃)中，其量足以獲得密度為0.885g/mL的液體。所得的溶液在3℃下靜置3天，然后通過(guò)離心回收所形成的沉淀。用甲醇，然后用醚逐漸增加的甲醇/二甲醚(或甲醇/二乙醚)混合物的連續(xù)級(jí)分(successive fraction)洗滌該沉淀。當(dāng)上清液最終實(shí)際上無(wú)色時(shí)，過(guò)濾出沉淀并用醚洗滌幾次，直到洗滌醚是無(wú)色的。獲得非常淺的米色(beige-colored)固體，并在減壓下干燥，然后研碎。
固體是重量比為10/85/5的Ia/IIa/IIIa混合物。產(chǎn)率約為2～3％，這取決于植物的來(lái)源以及收獲根時(shí)的季節(jié)。
分析 由于式Ia、IIa和IIIa的化合物具有相似結(jié)構(gòu)(黃酮類化合物部分和糖部分)，所以它們具有強(qiáng)的光譜相似性，特別是在紫外和紅外區(qū)。
UV譜(在80/20v/v的乙腈/水混合物中) 觀察到在331.7和261.7納米的兩個(gè)吸收帶(261.7nm處的帶強(qiáng)度約為331.7nm處的帶強(qiáng)度的一半)。
IR譜(在KBr片中) 觀察到以下帶 -在3374cm-1的強(qiáng)帶(糖部分的O-H)； -在1635cm-1的強(qiáng)帶(黃酮羰基的振動(dòng)帶)； -在1609cm-1的中等強(qiáng)度帶(黃酮烯屬雙鍵(flavone ethylenic double bond)的振動(dòng)帶)；和 -在1450和1360cm-1的中等強(qiáng)度帶(芳族部分的振動(dòng)帶)。
制備B -80/20w/w的Ia/IIa混合物的制備(Ex.4)- 對(duì)實(shí)施例1的產(chǎn)物進(jìn)行分離色譜(HPLC)，獲得80/20w/w的Ia/IIa混合物。
制備C -式Ia產(chǎn)物的制備(Ex.8)- 對(duì)實(shí)施例1或?qū)嵤├?的產(chǎn)物進(jìn)行更嚴(yán)格的分離色譜，獲得純度大于或等于98％，或者甚至純度大于或等于99.5％的式Ia的化合物。
分析 測(cè)定NMR譜(在250Mhz，作為氘代甲醇(deuterated methanol)中的溶液)和質(zhì)譜(通過(guò)FAB技術(shù))。獲得如下結(jié)果，其中，第一糖單元是連接黃酮骨架的單元，并且第2糖單元是結(jié)構(gòu)S1或S2的單元。
NMR譜 -中心在1.31ppm的三重峰(烯基取代的(alkylenated)苯基鏈的甲基CH3)， -中心在3.20ppm的四重峰(所述烷基鏈的甲醇基CH2)； -從3.27到4.39ppm未分辨的帶(兩個(gè)糖單元的質(zhì)子)[在600Mhz的COSY、HMQC和HMBC實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行詳細(xì)指認(rèn)，兩個(gè)糖單元的兩個(gè)異頭質(zhì)子(anomeric proton)，其分別在4.75ppm(雙峰)，屬于在5位連接黃酮的第一單元，和4.27ppm(雙峰)，屬于第二單元；在3.60(d)和3.93(d)ppm兩個(gè)糖單元之間的-CH2-O-橋；和在第二糖單元的5位上在3.32(d)和3.60(d)ppm的-CH2-；建立在相鄰質(zhì)子-質(zhì)子耦合基礎(chǔ)上的兩個(gè)糖單元的立體化學(xué)從異頭質(zhì)子開(kāi)始]； -3.87ppm(CH3-O-基團(tuán)的CH3)； -6.60ppm(黃酮部分的烯鍵(ethylenic)質(zhì)子)； -在6.91-6.94ppm未分辨的帶(4個(gè)芳族質(zhì)子)；和 -在7.82-7.86ppm未分辨的帶(2個(gè)芳族質(zhì)子)。
質(zhì)譜 分子量636.598(C30H36O15) 質(zhì)譜峰636；符合Na和K加成物。
質(zhì)譜方法也用于確認(rèn)所有O-H基團(tuán)(用乙酸酐/吡啶混合物)乙?；笫絀a、IIa和IIIa的結(jié)構(gòu)；乙?；a(chǎn)物在二氧化硅(silica)上層析純化(洗脫劑50/50v/v的水/乙腈)后通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行分析。
制備Ca -式IIa(Ex.2)和式IIIa(Ex.3)產(chǎn)物的制備- 對(duì)實(shí)施例1的產(chǎn)物進(jìn)行更嚴(yán)格的分離色譜，分離式IIa(Ex.2)和式IIIa(Ex.3)的產(chǎn)物，其純度大于或等于98％。
分析(如以上制備C所示進(jìn)行) Ex.2的NMR譜 式IIa(Ex.2)產(chǎn)物的NMR譜與式Ia(Ex.8)產(chǎn)物的NMR譜一致，但有以下差別 -沒(méi)有屬于乙基鏈的在1.31ppm的CH3信號(hào)和在3.20ppm的CH2信號(hào)； -屬于第二糖上5位中CH2的在3.32和3.60ppm的信號(hào)消失。
Ex.2的質(zhì)譜 分子量578.519(C27H30O14) 質(zhì)譜峰578；符合Na和K加成物。
Ex.3的NMR譜 式IIIa(Ex.3)產(chǎn)物的NMR譜與式Ia(Ex.8)產(chǎn)物的NMR譜一致，但有以下差別 -相應(yīng)于糖部分的質(zhì)子的未分辨的帶得到簡(jiǎn)化，只有一個(gè)異頭質(zhì)子在4.76ppm(d)。
Ex.3的質(zhì)譜 分子量446.404(C22H22O10) 質(zhì)譜峰446；符合Na和K加成物。
制備D -式Ib(Ex.5)產(chǎn)物的制備- 重復(fù)以上制備A和C的過(guò)程，從Prunus yedoensis的樹(shù)皮或根開(kāi)始，獲得式Ib的化合物。
制備E -式Ib產(chǎn)物的4′-硫酸酯(Ex.7)的制備- 根據(jù)本身已知的方法，通過(guò)使4′-OH基團(tuán)硫酸酯化(sulfatation)，獲得所希望的產(chǎn)物。
測(cè)試F 通過(guò)灼燒后再生皮膚組織來(lái)評(píng)價(jià)改善皮膚肌理的能力。
成年雄性大鼠的一部分后背被刮毛，并將加熱到130℃溫度的0.5cm2金屬板施加于該部分，產(chǎn)生校準(zhǔn)的灼傷區(qū)。將含有0(對(duì)照組)或1.5重量％的式I產(chǎn)物(治療組)的凝膠每天一次施用于鼠灼燒部位21天(每種測(cè)試產(chǎn)物8個(gè)動(dòng)物，10個(gè)動(dòng)物用于對(duì)照組)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在治療組(Ex.1到Ex.10)中，1個(gè)月內(nèi)獲得皮膚組織的再生；另一方面，在對(duì)照組中，所述再生在6到8周內(nèi)發(fā)生。
測(cè)試G 根據(jù)2003年10月22日提交的法國(guó)專利申請(qǐng)No.0312 351的主題，“測(cè)定自由基防御能力(determination of the free-radical defense potential”)方法，通過(guò)監(jiān)控由原位產(chǎn)生的自由基誘導(dǎo)的紅細(xì)胞(特別是羊紅細(xì)胞(sheeperythrocyte)；也可以采用全血或血漿)裂解的動(dòng)力學(xué)，在存在本發(fā)明的產(chǎn)物的條件下，其劑量從0mg/L(對(duì)照組)增加到100mg/L(治療組)，并使用酶的混合物(β-葡糖苷酶、硫酸酯酶和β-葡糖苷酸酶)水解反應(yīng)介質(zhì)，來(lái)研究本發(fā)明產(chǎn)物(Ex.1到Ex.10)的自由基清除性能。根據(jù)該方法，特別測(cè)量了(T1/2)時(shí)間，其相應(yīng)于裂解一半所研究的細(xì)胞，在此情況下是紅細(xì)胞，作為式I測(cè)試產(chǎn)物濃度(以mg/L表示)的函數(shù)。
所得的一部分結(jié)果列于以下圖1中，其中，曲線1對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物Ex.1；曲線2對(duì)應(yīng)于Ex.2；曲線3對(duì)應(yīng)于Ex.3；曲線4對(duì)應(yīng)于Ex.4。
圖1顯示Ex.4(即80/20w/w的Ia/IIa混合物)，其含有用化合物IIa(即Ex.2)″污染的″化合物Ia(即Ex.8)，作為自由基清除物質(zhì)比Ex.1、Ex.2和Ex.3活性更高。
測(cè)試H 用Ex.10及其成分(Ex.5、Ex.2和Ex.3)對(duì)人血細(xì)胞[由EFS(EtablissementsFrancais du Sang)提供]進(jìn)行其他測(cè)試。
這些是在Ficoll墊上分離并貯存在液氮蒸汽下的血細(xì)胞。解凍后，將所述細(xì)胞在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)，然后加入式I的測(cè)試產(chǎn)物。在37℃下再培養(yǎng)24小時(shí)或48小時(shí)后，分析細(xì)胞，以根據(jù)下表II評(píng)定明顯的膜標(biāo)記物(membranemarker)的任何表達(dá)。
表II 如表II所示，分析細(xì)胞上清液的白細(xì)胞介素2(IL-2)含量，這是一種誘發(fā)T淋巴細(xì)胞增殖的產(chǎn)物，添加或不添加活化劑，尤其是(i)植物凝血素(phytohematoglutinine)(PHA)，其是標(biāo)準(zhǔn)活化劑，和(ii)超抗原(superantigen)(SEB)，其誘導(dǎo)II類B淋巴細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞受體或TRC之間的相互作用，因此模仿抗原呈遞(antigen presentation)。
觀察到兩個(gè)主要的點(diǎn)，即 (1)Ex.10及其成分Ex.5、Ex.2和Ex.3沒(méi)有誘導(dǎo)免疫響應(yīng)的血細(xì)胞的增殖；和 (2)Ex.10、Ex.5、Ex.2和Ex.3對(duì)于這些細(xì)胞是活性的，并且干擾導(dǎo)致免疫響應(yīng)的信號(hào)的級(jí)聯(lián)；所觀察的作用看起來(lái)是免疫抑制劑，其在用PHA或SEB刺激后，使B淋巴細(xì)胞的抗體產(chǎn)生減少，使樹(shù)突細(xì)胞(dendritic cell)的II類MHCs減少并抑制IL-2產(chǎn)生(誘發(fā)淋巴細(xì)胞增殖的因子)。
圖2和3顯示產(chǎn)物Ex.10、Ex.5、Ex.2和Ex.3對(duì)分別為PHA誘導(dǎo)的(圖2)和SEB誘導(dǎo)的(圖3)的IL-2分泌的作用。具體地，一方面，圖3顯示與SEB(曲線11)、SEB+Ex.10(曲線12)、SEB+Ex.5(曲線13)、SEB+Ex.2(曲線14)和SEB+Ex.3(曲線15)的濃度(以pmol/mL表示)相關(guān)的IL-2的產(chǎn)生(以pg/mL表示)，另一方面，顯示產(chǎn)物Ex.10、Ex.5、Ex.2和Ex.3對(duì)免疫細(xì)胞刺激的作用。
總之，式IV化合物，特別是實(shí)施例1、4、8、9和10的產(chǎn)物在以下方面是特別有利的 ●它們的免疫調(diào)節(jié)作用，特別是對(duì)新近發(fā)作的多發(fā)性硬化； ●它們的免疫抑制作用，特別是通過(guò)抑制刺激物PHA和SEB對(duì)IL-2產(chǎn)生的活性而說(shuō)明的； ●它們的抑制成長(zhǎng)作用(antiblastic effect)(即，通過(guò)破壞成白血球細(xì)胞)，而且其用于治療慢性髓細(xì)胞樣白血病和急性白血病； ●它們的抗某些癌癥作用；和 ●當(dāng)局部、口服或注射給藥時(shí)，實(shí)際上沒(méi)有有害的副作用。
在成年人中，式I產(chǎn)物，和優(yōu)選式IV產(chǎn)物的推薦劑量約為口服50mg/kg。這些產(chǎn)物也可以以凝膠或油膏(pomade)；軟膏(ointment)或洗液的形式局部施用；在此情況下，局部形式可以含有相對(duì)于所述局部形式的重量的1～5重量％的式I、式IV的產(chǎn)物或其混合物。
權(quán)利要求
1.芫花素或櫻花素衍生物的用途，所述用途的特征在于，使用選自以下的物質(zhì)
(i)式I的芫花素或櫻花素的糖的衍生物
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，R表示H或糖殘基，尤其是結(jié)構(gòu)S1或S2的糖殘基
Z表示H或C1-C4烷基、C1-C5?；?、糖基或硫酸基，和
(ii)它們的混合物，
作為化妝品或皮膚病學(xué)活性成分，用于獲得用來(lái)改善皮膚肌理的化妝品或皮膚病學(xué)制劑。
2.芫花素或櫻花素衍生物的用途，所述用途的特征在于，使用選自以下的物質(zhì)
(i)式I的芫花素或櫻花素的糖的衍生物
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，R表示H或糖殘基，特別是結(jié)構(gòu)S1或S2的糖殘基
Z表示H或C1-C4烷基、C1-C5?；⑻腔蛄蛩峄?，和
(ii)它們的混合物，
作為自由基清除活性成分，用于獲得用來(lái)治療由自由基引起的病癥的藥物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述物質(zhì)選自
·式IV的化合物
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，Z1表示上述的H或C1-C4烷基、C1-C5酰基、糖基或硫酸基，并有利地為C1-C4烷基(優(yōu)選乙基)或硫酸基(優(yōu)選SO3H基團(tuán))，和
·其混合物。
4.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述物質(zhì)選自
·式Ia的5-[O-6-(D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃葡糖基]氧基-2-(4-乙氧基苯基)-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮
·式IIa的5-O-β-D-櫻草糖基-芫花素
·式IIIa的喬松酮-5-葡糖苷
·式Ib的2，3-二氫-5-[O-6-(D-吡喃葡糖基)-β-D-吡喃葡糖基]氧基-2-(4-乙氧基苯基)-7-甲氧基-4H-1-苯并吡喃-4-酮
·式IIb的5-O-β-D-櫻草糖基-櫻花素
·其衍生物，其中Z是硫酸基(優(yōu)選SO3H，或者適當(dāng)情況下是SO3Na或者甚至SO3NH4)，和
·其混合物。
5.芫花素或櫻花素的糖衍生物，其特征在于，其選自
·相應(yīng)于通式IV的化合物
其中，符號(hào)表示單鍵或雙鍵，Z1表示H或C1-C4烷基、C1-C5?；?、糖基或硫酸基，并有利地為C1-C4烷基(優(yōu)選乙基)或硫酸基(優(yōu)選SO3H基團(tuán))，和
·其混合物。
6.如權(quán)利要求5所述的芫花素的糖衍生物，其特征在于，所述衍生物是相應(yīng)于式Ia的化合物
7.一種制備如權(quán)利要求1或2所述的式I化合物的方法，所述方法特征在于包括以下步驟
(i)芫花素、櫻花素或它們的糖從屬于李屬(Prunus)、南香屬(Gnidia)和瑞香屬(Daphne)的合適植物提取；
(ii)苷元在5位被合適的糖所糖基化(必要時(shí)，如果4′位的OH官能團(tuán)沒(méi)有被保護(hù)，則將其封閉后進(jìn)行糖基化)，和/或
(iii)將如上所述提取或制備的糖的4′-OH基團(tuán)(必要時(shí)，在使4′-OH基團(tuán)去保護(hù)后)醚化(特別是使用烷基碘化物，以不影響糖部分的OH基團(tuán))、酯化或硫酸化。
8.所權(quán)利要求7所述的方法，用于制備如權(quán)利要求4或6所述的式Ia化合物，所述方法的特征在于包括以下步驟
(1°)用CH2Cl2提取Daphne gnidium研碎的根；
(2°)過(guò)濾以舍棄由此獲得的二氯甲烷溶液，并收集干燥的固體殘留物；
(3°)用CH3OH提取由此獲得的所述干燥的固體殘留物；
(4°)過(guò)濾以收集由此獲得的甲醇溶液，并舍棄所得的固體殘留物；
(5°)在真空下，在小于或等于60℃的溫度下，蒸發(fā)干燥由此收集的甲醇溶液，從而獲得固體殘留物；
(6°)在小于或等于60℃的溫度下，攪拌下用水洗滌在步驟(5°)中獲得的固體殘留物，并放置冷卻；
(7°)除去洗滌水，然后用CH3OH吸收固體殘留物；
(8°)重復(fù)步驟(5°)到(7°)的操作循環(huán)3到7次，直到最終的洗滌水是淺黃色并且澄清的；
(9°)將所得的干燥殘留物吸收在25/2 w/w的甲醇/水混合物中，干燥殘留物的量適合獲得密度為0.885g/mL的液體；
(10°)使所述液體在2-4℃，優(yōu)選在3℃下靜置至少2天，優(yōu)選3天，并收集所形成的沉淀；
(11°)用甲醇，然后用醚含量增加的甲醇/醚混合物相繼洗滌所述沉淀，直到上清液是無(wú)色的；
(12°)濾出由此獲得的沉淀，并用醚洗滌幾次，直到洗滌醚是無(wú)色的；
(13°)濾出并干燥所得的固體產(chǎn)物，其由式Ia、IIa和IIIa產(chǎn)物的混合物組成；和
(14°)必要時(shí)，分離所述混合物，以收集式Ia產(chǎn)物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(1°)中的提取在30-35℃的溫度和大氣壓下，或者在適當(dāng)情況下，在較高溫度和減壓下，在Kumagawa類型設(shè)備中進(jìn)行3-6天；并且還在于，步驟(3°)的提取在45-55℃的溫度和常壓下，或者在適當(dāng)情況下，在較高溫度和減壓下，在相同設(shè)備中進(jìn)行3-6天。
10.一種化妝品(a)、皮膚藥物(b)或治療的(c)組合物，其特征在于
(a)所述化妝品組合物含有至少一種式I化合物，連同生理可接受的局部賦形劑；
(b)所述皮膚藥物組合物含有至少一種式I化合物，連同生理可接受的并且特別是局部的賦形劑；或
(c)所述治療組合物含有至少一種式IV化合物作為免疫調(diào)節(jié)活性成分，特別是抗新近發(fā)作的多發(fā)性硬化，或者作為抗癌活性成分，特別是抗慢性髓細(xì)胞樣白血病，連同生理可接受的并且特別是口服或可注射的賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有式(I)的芫花素和櫻花素的糖衍生物在(a)化妝品或皮膚病學(xué)以及(b)治療方面的用途；(ii)具有式(I)的新衍生物作為工業(yè)產(chǎn)物的用途；以及(iii)它們的制備方法[式(I)]，其中符號(hào)[式(II)]表示表示單鍵或雙鍵，R表示H或糖殘基，特別是具有結(jié)構(gòu)S1或S2 [式(III)]的糖殘基，Z表示H或C1－C4烷基、C1－C5?；翁腔蛄蛩峄?。
文檔編號(hào)A61Q19/00GK1950390SQ200580014070
公開(kāi)日2007年4月18日 申請(qǐng)日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者邁克爾·普羅斯特, 杰奎琳·拉格特, 皮埃爾·圖貝瑞 申請(qǐng)人:邁克爾·普羅斯特, 杰奎琳·拉格特, 皮埃爾·圖貝瑞