抑制pcsk9靶點的中藥單體成分藥物及虎杖苷在制備pcsk9靶點抑制藥物中的應用
【專利說明】抑制PCSK9卽點的中藥單體成分藥物及虎杖昔在制備PCSK9革田 點抑制藥物中的應用
[技術(shù)領(lǐng)域]
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種能相對特異性影響前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)祀點、改善 膜島素抵抗的中藥單體成分藥物，W及該藥物特別是虎杖巧在制備前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌 素9(PCSK9)祀點抑制藥物中的應用。
[【背景技術(shù)】]
[0002] 糖尿病是全球范圍內(nèi)發(fā)病率增長最快的疾病之一，是繼屯、血管疾病、腫瘤之后第 =大高死亡率疾病。世界衛(wèi)生組織估計，到2030年，全球糖尿病患者數(shù)可能超過3.6億人，其 中90%~95%為2型糖尿病。中國為世界第二大糖尿病國家，國際權(quán)威期刊《新英格蘭醫(yī)學 雜志》2010年發(fā)布的"中國人口糖尿病流行狀況"表明，中國年齡標準化的糖尿病發(fā)病率為 9.7% (男10.6%，女8.8%);糖尿病的發(fā)病率隨年齡增長，20~39歲、40~59歲和超過60歲 的人口，糖尿病發(fā)病率分別為3.2 %、11.5 %和20.4 %。城市人口的發(fā)病率高于農(nóng)村人口 (11.4%vs.8.2%)。令人憂慮的是，糖尿病不再只是中老年人病，有向青少年擴大的趨勢。 隨著膜島素等藥物的使用，糖尿病合并酬癥酸中毒等糖尿病急性并發(fā)癥的發(fā)病率大幅下 降，而糖尿病合并慢性血管并發(fā)癥等成為糖尿病的主要并發(fā)癥，是糖尿病致殘率、死亡率升 高的主要原因。
[0003] W膜島素抵抗為主要特征的2型糖尿病占所有糖尿病患者的90%~95%?；颊哐?糖呈現(xiàn)不同程度的升高，且常伴隨有脂質(zhì)代謝素亂、高膜島素血癥或肥胖等代謝素亂綜合 癥。膜島素抵抗、糖脂代謝素亂是糖尿病合并慢性血管并發(fā)癥的基礎(chǔ)病變，危害嚴重，治療 棘手?，F(xiàn)有改善膜島素抵抗的藥物常用化格列酬等膜島素增敏劑與雙脈類，運些藥物的臨 床效果有待進一步提高，同時膜島素增敏劑導致的屯、血管事件的不良反應、雙脈類藥物較 普遍的消化道副反應，使它們對于膜島素抵抗調(diào)節(jié)運用也受到一定限制。故積極探索新作 用祀點的膜島素抵抗調(diào)節(jié)藥物具有重要意義。
[0004] 前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(PCSK9)屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族(PC)蛋白酶K亞家族， 主要在人肝臟、小腸和腎表達。在肝細胞中表達產(chǎn)生的PCSK9酶原(ap〇-PCSK9)首先在內(nèi)質(zhì) 網(wǎng)發(fā)生自催化裂解生成成熟的蛋白酶PCSK9并被分泌入血。大量研究證實:PCSK9在低密度 脂蛋白受體化化R)的降解中起著舉足輕重的作用。PCSK9的蛋白分子可W與LDLR結(jié)合，通過 受體介導的內(nèi)吞作用導致細胞表面LDL啡華解增加，細胞攝取血漿中低密度脂蛋白膽固醇的 能力下降，進而使得血漿中〇)心(：水平升高，因此PCSK9對于維持體內(nèi)膽固醇穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著關(guān) 鍵的調(diào)節(jié)作用。實驗與臨床研究表明PCSK9與糖代謝異常亦有密切相關(guān)性。阻斷肝臟PCSK9 與LDkC的結(jié)合，將有利于增強肝臟清除膽固醇的能力、改善膜島素抵抗，從而有效調(diào)節(jié)糖 脂等代謝素亂。
[0005] PCSK9是影響膜島素抵抗、改善脂代謝與糖代謝素亂的重要祀點，WPCSK9為祀點 研發(fā)代謝性疾病的調(diào)節(jié)藥物正受到國內(nèi)外高度關(guān)注。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明目的在于提供一種通過相對特異性影響PCSK9祀點，改善膜島素抵抗綜合 癥的中藥單體藥物。
[0007] 1、運種中藥單體藥物是從中藥虎杖中提取的巧類化合物虎杖巧，即徑基二苯乙締 類化合物，化學名為3，4 '，5-S徑基巧-3-0-D-葡萄糖巧。
[000引2、虎杖巧能通過相對特異性的抑制膜島素抵抗的肝細胞中PCSK9的表達與活性， 改善膜島素抵抗的代謝素亂。
[0009] 3、虎杖巧分子能結(jié)合于PCSK9晶體結(jié)構(gòu)的活性口袋，并與多個氨基酸殘基形成穩(wěn) 定的氨鍵。
[【附圖說明】]
[0011]圖1:棟桐酸誘導的膜島素抵抗化pG2細胞模型中LDLR、GCKW及PCSK9蛋白表達。 [0012]虎杖巧可W劑量時間依賴性地增加膜島素抵抗胎pG2細胞LDLR，GCK蛋白表達，同 時減少PCSK9分泌。
[0013] 棟桐酸誘導的膜島素抵抗化pG2細胞模型中LDLR、GCKW及PCSK9蛋白表達?；⒄惹?可W劑量、時間依賴性地增力陽epG2細胞LDLR W及GCK蛋白表達，在20咖，24h是作用最明顯， 用于后續(xù)試驗（圖l.A、B、C、D)。檢測PCSK9蛋白時發(fā)現(xiàn)，在膜島素抵抗模型中，PCSK9蛋白表 達上調(diào)，加入虎杖巧后抑制其表達（圖1.E)。蛋白免疫共沉淀結(jié)果證明：虎杖巧可W減少膜 島素抵抗狀態(tài)下PCSK9對活性LDLR(160KD)的結(jié)合（圖1.F)。實驗采用0.25mM棟桐酸(PA)處 理24h誘導產(chǎn)生膜島素抵抗，藥物干預試驗均采用虎杖巧預處理2hD*p<0.05，**p< 0.01and***p<0.OOlvs Con。
[0014] 圖2:干預PCSK9祀點、虎杖巧對膜島素抵抗化pG2細胞內(nèi)LDLR和GCK蛋白水平的影 響。
[0015] 敲低和過表達PCSK9對LDLR和GCK蛋白表達的影響。首先對PCSK9的S條干擾序列 (吉瑪基因）進行篩選，sill53序列干擾效率最高，用于后續(xù)試驗（圖2. A)。后=組干擾掉 PCSK9后LDLR蛋白表達均上調(diào)，且取消了虎杖巧對膜島素抵抗狀態(tài)下LDLR的上調(diào)作用（圖 2.B)。而干擾PCSK9后對GCK蛋白的表達沒有明顯上調(diào)作用，但是卻一樣取消了虎杖巧對膜 島素抵抗狀態(tài)下GCK的上調(diào)作用（圖2.C)。過表達PCSK9野生型質(zhì)粒，U)LR水平下降，并且PA+ PCSK9過表達組LDLR的下調(diào)更明顯，而給予虎杖巧后逆轉(zhuǎn)該趨勢（圖2. D)，而對于GCK，PA+ PCSK9過表達組其水平明顯下調(diào)，低于單純PA介導的膜島素抵抗組，加入虎杖巧后明顯使其 表達上調(diào)接近正常水平（圖2. E)，提示虎杖巧通過PCSK9祀點調(diào)節(jié)LDLR和GCK的表達。
[0016] 畫pi<0.0 Olvs Con ;**p<0.01and***p<0.0 Olvs正常組LDLR表達；~ ~p<0.0 land p <0.0 Olvs正常組PCSK9表達。
[0017] 圖3:虎杖巧能明顯改善膜島素抵抗化Mb小鼠糖脂代謝素亂。
[0018] 虎杖巧有效調(diào)節(jié)化/化鼠糖脂代謝素亂，減少肝臟病理損傷。虎杖巧（lOOmg/kg)給 藥4周明顯降低化Mb鼠血糖，與陽性藥化格列酬效果相當（圖3.A)。虎杖巧明顯增加肝臟糖 原含量（圖3.B)，減少肝臟TC、TG含量（圖3.C、D)。皿和油紅0染色結(jié)果進一步說明虎杖巧可 W減少肝臟脂肪沉積，明顯減少肝臟病理損傷（圖3 .E)。**卸<0.001VSC57;祁<0.05，#祁< 0.01and###p<0.001vsdb/db.
[0019] 圖4:虎杖巧可W降低膜島素抵抗db/db小鼠肝臟PCSK9mRNAW及蛋白水平，同時升 高化/化鼠肝臟LDLR、GCK表達。
[0020] 虎杖巧明顯增加化Mb鼠肝臟LDLR、GCK表達同時抑制PCS腳水平?；⒄惹商幚斫M可 W明顯增加化/化鼠肝臟LDLR(圖4.C)和GCK蛋白表達（圖4.E)，但對肝臟LDLR的mRNA水平無 影響（圖4. A)。同時，虎杖巧可W同時抑制肝臟PCSK9的mRNA和蛋白水平（圖4. B、D)，提示虎 杖巧可能參與了PCSK9對LDLR的轉(zhuǎn)錄后降解過程。*p<0.05，**p<0.01and***p<0.0 OlVS化/ dbo
[0021] 圖5.虎杖巧通過抑制PCSK9的表達升高化Mb鼠肝臟LDLR水平。
[0022] 免疫組織化學結(jié)果顯示化Mb鼠肝臟LDLR水平較低同時伴隨PCS腳水平的增多，虎 杖巧干預組相比模型組，PCSK9水平明顯下調(diào)伴隨LDLR水平的增加（圖5.A)。進一步的免疫 雙巧光結(jié)果與免疫組織化學結(jié)果一致，并且可W觀察到肝臟內(nèi)PCSK9和LDLR存在一定的共 定位(細胞膜)（圖5.B)。
[0023] 圖6:虎杖巧分子與PCSK9的晶體結(jié)構(gòu)的分子對接。
[0024] 利用專業(yè)藥物輔助設(shè)計軟件sybyl的SU計Iexdock模塊，分析虎杖巧分子（圖6. A) 與PCSK9晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:2p4e)的相互作用。發(fā)現(xiàn)虎杖巧可W很好地結(jié)合于PCSK9的活 性口袋（圖6.B)，并與358位半脫氨酸（Cys358)，435位鄉(xiāng)氨酸（Val435)，439位天冬酷胺 (Asn439)，461位色氨酸(T巧461)^及651位天冬氨酸(439651)等多個氨基酸殘基形成穩(wěn)定 的氨鍵(圖6.C)。
[0025] 圖7.虎杖巧與人重組PCSK9蛋白的結(jié)合反應。
[0026] 結(jié)合反應信號值的變化WRU記錄，依據(jù)動力學參數(shù)W及解離結(jié)合常數(shù)KD值用 ProtenOn software 2.1.1分