4,42,1080-1084。
[00引]HepG2細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞株）：ATCC，HB-8065。HCT-116細(xì)胞（人結(jié)腸癌細(xì)胞株）： ATCC，C化-247。011-145細(xì)胞（人前列腺癌細(xì)胞株）：4了撕，肌日-81。11址-7細(xì)胞（人肝癌細(xì)胞 株）：RIKEN Cell Bank，RCB1366。膜酶:北京索萊寶科技有限公司，T1300。
[0052] 甘草香豆素溶液的溶劑為DMS0。
[0053] 實施例1、甘草香豆素能夠抑制P服/TOPK蛋白的憐酸化
[0054] 本實施例中采用的表達(dá)PBK/T0PK的腫瘤細(xì)胞為H邱G2細(xì)胞、肥1'-116細(xì)胞、011-145 細(xì)胞或化h-7細(xì)胞，分別進(jìn)行如下操作：
[0055] 1、取對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，膜酶消化后用特定培養(yǎng)液制成濃度為3 X IO5個細(xì) 胞AiL的細(xì)胞懸液。胎pG2細(xì)胞采用的特定培養(yǎng)液為含10% (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 液?；痟-7細(xì)胞采用的特定培養(yǎng)液為含10 % (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。DU-145細(xì)胞采 用的特定培養(yǎng)液為含10% (體積比）胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液。HCT-116細(xì)胞采用的特定 培養(yǎng)液為含10%(體積比）胎牛血清的McCoy's 5 A培養(yǎng)液。
[0056] 2、取步驟1得到的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板(每孔2mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁且豐度 達(dá)到80 %。
[0057] 3、完成步驟2后，取所述6孔培養(yǎng)板，吸棄上清液，然后分組處理如下：
[0化引試驗組一:每孔加入2mL 25皿ol/L甘草香豆素溶液，培養(yǎng)24小時；
[0化9] 試驗組二:每孔加入2mL 50皿ol/L甘草香豆素溶液，培養(yǎng)24小時；
[0060] 試驗組每孔加入2mL 75WI101/L甘草香豆素溶液，培養(yǎng)24小時；
[0061 ] 對照組:每孔加入2mL DMSO，培養(yǎng)24小時；
[0062] 進(jìn)行=次重復(fù)試驗，每次重復(fù)試驗中每組設(shè)置6個重復(fù)處理。
[0063] 4、完成步驟3后，取細(xì)胞，提取總蛋白，然后進(jìn)行western blot檢測。western blot 檢測中，用于檢測P-P服/TOPK的一抗為抗P-P服/T0PK(CST，4941)，用于檢測e-actin的一抗 為抗0-曰。^11化51'，497〇)，二抗為兔二抗(18^458))。最后使用6化發(fā)光試劑盒(北京普瑞金 科技有限公司，E500)進(jìn)行顯影。
[0064] 結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，甘草香豆素處理后，P-P服/TOPK的水平顯著降低，且呈劑量 依賴效應(yīng)。
[0065] 實施例2、甘草香豆素能夠抑制P服/TOPK蛋白下游祀蛋白histone H3的憐酸化
[0066] 1、取化pG2細(xì)胞，膜酶消化后用含10 % (體積比）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮，得到 濃度為3 X IO5個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
[0067] 2、取步驟1得到的細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板(每孔2mL)，培養(yǎng)至細(xì)胞豐度達(dá)到 80%。
[0068] 3、完成步驟2后，取所述6孔培養(yǎng)板，吸棄上清液，然后分組處理如下：
[0069] 試驗組一:每孔加入2mL 25皿ol/L甘草香豆素溶液，培養(yǎng)24小時；
[0070] 試驗組二:每孔加入2mL 50皿ol/L甘草香豆素溶液，培養(yǎng)24小時；
[0071] 試驗組每孔加入2mL 75WI101/L甘草香豆素溶液，培養(yǎng)24小時；
[0072] 對照組:每孔加入2mL DMSO，培養(yǎng)24小時；
[0073] 進(jìn)行=次重復(fù)試驗，每次重復(fù)試驗中每組設(shè)置6個重復(fù)處理。
[0074] 4、完成步驟3后，取細(xì)胞，提取總蛋白，然后進(jìn)行western blot檢測。western blot 檢測中，用于檢測p-histone H3的一抗為抗p-histone冊（CST,3642S)，用于檢測0-actin 的一抗為抗護(hù)曰(3^11化51'，4970)，二抗為兔二抗(18^458))。最后使用6化發(fā)光試劑盒(北京 普瑞金科技有限公司，E500)進(jìn)行顯影。
[0075] 結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，甘草香豆素處理后，P-Mstone H3的水平顯著降低，且呈劑 量依賴效應(yīng)。
[0076] 實施例3、甘草香豆素能夠與P服/TOPK蛋白直接相互作用。
[0077] 一、甘草香豆素-Sepharose 4B珠子復(fù)合體的制備。
[007引 USepharose 4B(GE，17-0430-01)在ImM肥1水溶液中洗涂S次W使其充分溶脹， 然后置于含有IOmM甘草香豆素的解育液中4°C解育16小時。
[0079] 2、完成步驟1后，取Se地arose 4B，用解育液洗涂5次，然后在封閉液中4°C封閉16 小時。
[0080] 3、完成步驟2后，取Se地arose 4B，用洗液I洗涂3次，再用洗液n洗涂3次，然后重 懸于PBS緩沖液中，得到甘草香豆素-S巧harose 4B珠子復(fù)合體。
[0081 ] 解育液(P冊.3):含0.1M Na肥〇3和0.5M化Cl的水溶液。
[0082] 封閉液(P冊.0):0.1 M Tris-HCl水溶液。
[0083] 洗液I :pH4.0、0.1 M醋酸緩沖液。
[0084] 洗液n (P冊.0):含0.1 M Tris-HCl和0.5M NaCl的水溶液。
[00化]PBS緩沖液:北京索萊寶科技有限公司，P1020。
[00化]用等體積DMSO代替甘草香豆素，其他同步驟一，得到DMSO-Sepharose 4B珠子復(fù)合 體。
[0087] 二、TOPK蛋白的制備
[008引 TOPK蛋白如序列表的序列1所示，其編碼基因如序列表的序列2所示。
[0089] 1、將序列表的序列2自5'末端第389-1357(開放閱讀框)所示的雙鏈DNA分子插入 pET-46(祀T-46化/LIC kit中的組件，Novagen，USA)的多克隆位點，得到重組質(zhì)粒pEl'a46-WT-l'0PK。
[0090] 2、將步驟1得到的重組質(zhì)粒祀化46-WT-T0PK導(dǎo)入大腸桿菌化21，得到重組菌。
[0091] 3、在37°C條件下培養(yǎng)步驟2得到的重組菌，培養(yǎng)過程中加入IPTGW誘導(dǎo)目的蛋白 表達(dá)，誘導(dǎo)4h后收集菌體。
[0092] 4、取步驟3得到的菌體，超聲破碎，然后離屯、并收取上清液。
[OOW] 5、取步驟4得到的上清液，按25 : 1的比例加入Ni beads (NOvagen公司， 139280054)，4°C顛倒 16h。
[0094] 6、完成步驟5后，3000巧m離屯、1 Omin，收集Beads沉淀物。
[00巧]7、重復(fù)進(jìn)行S次如下步驟:取上一步驟得到的沉淀物，加40ml冰冷PNI20 washing buf f er (20mM憐酸鹽、0.5M化Cl、20mM咪挫，余量為水），懸浮(敲打），然后4°C顛倒5min，然 后SOOOrmp離屯、1 Omin，收集沉淀。
[0096] 8、取步驟 7 得到的沉淀物，用 40ml PNI40 washing buffe;r(20mM 憐酸鹽、0.5M NaCl、40mM咪挫，余量為水)漂洗3次，收集沉淀。
[0097] 9、取步驟8得到的沉淀物，用7.5ml PNI400 elution buffer(20mM憐酸鹽、0.5M NaCl、400mM咪挫，余量為水)懸浮，顛倒IOmin，3000巧m離屯、IOmin，取上清，即為TOPK蛋白溶 液。
[009引10、取步驟9得到的TOPK蛋白溶液，分裝，-80°c保存?zhèn)溆谩?br>[0099] S、體外 pull-down 實驗
[0100] 將珠子復(fù)合體（甘草香豆素 -Sepharose 4B珠子復(fù)合體或DMSO-Sepharose 4B珠子 復(fù)合體)進(jìn)行如下步驟：
[0101 ] 1、將珠子復(fù)合體與P服/TOPK純蛋白在反應(yīng)液中4°C解育16小時。
[0102] 反應(yīng)液：50mMTris(pH7.5)，5mM邸TA，150mM化Cl，lmMDTT，0.01%NP-40，化g/ ml牛血清白蛋白，0.02mM PMSF和lx protease inhibitors。
[0103] 2、完成步驟I后，取珠子復(fù)合體，用化is緩沖液洗涂5次，利用western blot方法檢 測甘草香豆素與PBK/T0PK蛋白的結(jié)合情況。
[0104] Tris緩沖液：50mM Tris(抑7.5)，5mM EDTA,250mM NaClJmM DTT，0