物，提取物中槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量為提取物的60-65% ;
[0041](6)上述粉末經(jīng)蒸餾水溶解，離心后用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行分離制備，以乙腈-水為流動(dòng)相，流速為10-30mL/min，揮干溶劑、真空干燥，得到組合物，組合物中黃酮的重量含量為90-98%，組合物中槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量為81-96% ;
[0042]步驟2所述大孔吸附樹脂包括非極性大孔吸附樹脂，LX-60和Χ_5 ;弱極性大孔吸附樹脂，HPD722和LX-5 ；
[0043]中極性大孔吸附樹脂，HPD750和ΑΒ-8 ；
[0044]荷葉黃酮組合物中含有槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷；
[0045]步驟5中的提取物，屬于荷葉黃酮的組合物。
[0046]步驟5中荷葉黃酮的組合物經(jīng)HPLC液相分析，色譜圖上有兩個(gè)特征峰，22_23min出現(xiàn)的為主峰槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷，23-24min出現(xiàn)另一色譜峰，主峰與另一色譜峰的峰面積之比為12: 1 ;HPLC液相分析的條件是:檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速
0.4-1.0mL/min,乙臆_水:20-80體積比等度洗脫。
[0047]本發(fā)明的流動(dòng)相包含:
[0048]乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.14%甲酸水、乙腈-0.2%甲酸水、乙腈-0.24%甲酸水、乙腈-0.3%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、甲醇-水；
[0049]優(yōu)選:乙腈-0.1 %甲酸水(10-90體積比)、乙腈-水(20-80體積比)等度洗脫。
[0050]一種荷葉黃酮的提取方法，其特征在于:粉末的提取條件的選擇與優(yōu)化。本發(fā)明比較了以熱水、堿液、乙醇為提取劑的提取效果。
[0051]本發(fā)明以乙醇的提取效果最佳。提取率為:87%-95%
[0052]本發(fā)明以30 %，40 %，50 %，60 %，70 %，80 % 6個(gè)濃度的乙醇水溶液對(duì)荷葉中的黃酮類化合物進(jìn)行提取，50 %的乙醇水溶液的提取率最高。
[0053]—種荷葉黃酮的提取方法，其特征在于:藥材提取液、15-25%、30-40%、40-50%乙醇洗脫液分別經(jīng)HPLC分析，色譜圖如下圖1-4。
[0054]洗脫條件:檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速0.4-1.0mL/min，20 %乙腈等度洗脫。對(duì)照品為純度98%以上的懈皮素-3_0_β -D-葡萄糖酸酸苷標(biāo)準(zhǔn)品。
[0055]高效制備液相色譜條件的選擇與優(yōu)化
[0056]流動(dòng)相的選擇與優(yōu)化:本發(fā)明比較了乙腈-0.1 %甲酸水、甲醇-0.1 %甲酸水、乙腈-水、甲醇-水四種流動(dòng)相對(duì)色譜峰的分離效果。
[0057]梯度洗脫程序:本發(fā)明通過改變流速、逐步調(diào)整流動(dòng)相中有機(jī)相比例，逐級(jí)細(xì)分，
[0058]優(yōu)選檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速10_30mL/min，20 %乙腈等度洗脫的色譜分離條件。對(duì)照品純度98%以上的槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷標(biāo)準(zhǔn)品。
[0059]不同梯度洗脫程序色譜圖如圖5-7。
[0060]流動(dòng)相水相中甲酸濃度對(duì)色譜峰分離度有較大影響，加入甲酸比不加甲酸可獲得較好的分離度；有機(jī)相比例對(duì)保留時(shí)間有較大影響，有機(jī)相所占比例越大，保留時(shí)間越短，分離度越差；柱溫對(duì)分離度也有較大影響，過高過低分離度均較差；
[0061]故選擇檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速10_30mL/min，
[0062]故優(yōu)選乙腈-0.1 %甲酸水(15: 85體積比)、或乙腈-水(20-80體積比)等度洗脫為色譜分離條件。
[0063]—種荷葉黃酮的組合物經(jīng)HPLC液相分析，22-23min出現(xiàn)的為主峰槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷，23-24min出現(xiàn)另一色譜峰，主峰與另一色譜峰的峰面積之比為12: 1HPLC液相分析的條件是:檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速0.4-1.0mL/min,20%
乙腈等度洗脫。
[0064]—種荷葉黃酮的組合物，黃酮重量含量的計(jì)算方法:
[0065]ff = F!*A樣 *V樣 *(1+1/12) *100% /m組，其中 F1= C 對(duì) /A對(duì)
[0066]W、A樣、V樣、ms、C對(duì)、A對(duì)的定義如下:
[0067]W為重量含量百分比
[0068]為樣品液中槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的峰面積
[0069]V#為樣品液體積
[0070]1%為組合物質(zhì)量
[0071]C#為對(duì)照品濃度
[0072]A#為對(duì)照品峰面積
[0073]—種荷葉黃酮的組合物，
[0074]槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量的計(jì)算方法:
[0075]ff = F!*A樣 *V樣 *100 % /m組，其中 F! = C 對(duì) /A對(duì)
[0076]W、A樣、V樣、m組、C對(duì)、A對(duì)的定義如下:
[0077]W為重量含量百分比
[0078]為樣品液中槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的峰面積
[0079]V#為樣品液體積
[0080]1%為組合物質(zhì)量
[0081]C#為對(duì)照品濃度
[0082]A#為對(duì)照品峰面積
[0083]荷葉中槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的鑒定見(圖8、9)核磁數(shù)據(jù)和(圖10)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。
[0084]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是:
[0085](1)本發(fā)明采用價(jià)格低廉、來源廣泛的荷葉為原料分離純化一種荷葉中的黃酮。所獲得的化合物純度高，且工藝較為簡(jiǎn)單，設(shè)備等投資較小，容易放大，較適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生廣等。
[0086](2)本發(fā)明能大幅提高組合物中槲皮素-3-0-13_D-葡萄糖醛酸苷的重量含量，其重量含量可由藥材提取物中的3-5%提高至60-65%，經(jīng)過制備高效液相制備后提高至90-98%。
【附圖說明】
[0087]圖1:藥材提取液的HPLC色譜圖
[0088]圖2:15-25%洗脫液的HPLC色譜圖
[0089]圖3:30-40 %洗脫液的HPLC色譜圖
[0090]圖4:40-60 %乙醇洗脫液的HPLC色譜圖
[0091]圖5:檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速25mL/min，25%乙腈-水等度洗脫的HPLC
色譜圖
[0092]圖6:檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速25mL/min，23%乙腈-水等度洗脫的HPLC
色譜圖
[0093]圖7:檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，流速25mL/min，流動(dòng)相為乙腈-0.3%甲酸水，22%等度洗脫的HPLC色譜圖
[0094]圖8:槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的氫譜
[0095]圖9:槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的碳譜
[0096]圖10:槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的質(zhì)譜
【具體實(shí)施方式】
[0097]本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)一步詳述。
[0098]實(shí)施例1
[0099]本發(fā)明所涉及的采用大孔吸附樹脂分離純化一種荷葉黃酮的方法步驟如下:
[0100](1)將荷葉烘干、粉碎，得到荷葉粗粉；
[0101](2)稱取300g荷葉粗粉，采用1: 30 (W/V)的料液比向該荷葉粉中加入9升50%乙醇溶液，90°C熱回流提取時(shí)間3h，重復(fù)浸提3次，提取液合并后濃縮干燥得到提取物，提取物中黃酮重量含量為3%;上述提取物經(jīng)蒸餾水超聲溶解后動(dòng)態(tài)上樣大孔吸附樹脂LX-60進(jìn)行純化；
[0102](3)分別采用10倍柱床體積的蒸餾水和25%乙醇進(jìn)行洗脫，充分洗凈多糖、蛋白等大量水溶性雜質(zhì)；
[0103](4)采用35%乙醇對(duì)大孔樹脂進(jìn)行洗脫；
[0104](5) 35%乙醇洗脫液經(jīng)濃縮、真空減壓干燥、粉碎、混合均勻后，得到粉末，粉末中的槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量為60%。
[0105](6)上述粉末經(jīng)蒸餾水超聲溶解離心后采用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，流速為16mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，乙腈-水(20-80體積比)等度洗脫，即得到黃色晶體，該晶體中槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量為98%。
[0106]實(shí)施例2
[0107](1)將荷葉烘干、粉碎，得到荷葉粗粉；
[0108](2)稱取200g荷葉粗粉，采用1: 40的料液比(W/V)向該荷葉粗粉中加入8升70%乙醇溶液，80°C熱回流提取時(shí)間4h，重復(fù)浸提2次，提取液合并后濃縮干燥得到提取物，提取物中黃酮重量含量為3%。上述提取物經(jīng)蒸餾水超聲溶解后采用大孔吸附樹脂LX-5動(dòng)態(tài)上樣進(jìn)行純化；
[0109](3)分別采用8倍柱床體積的蒸餾水和18%乙醇洗脫，充分洗凈多糖、蛋白等大量水溶性雜質(zhì)；
[0110](4)采用30%乙醇對(duì)大孔樹脂進(jìn)行洗脫；
[0111](5)將30%乙醇洗脫液經(jīng)濃縮、冷凍干燥、粉碎、混合均勻后得到粉末，粉末中槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量為62%。
[0112](6)上述粉末經(jīng)蒸餾水超聲溶解，混懸液離心后，采用制備型高效液相色譜儀進(jìn)行分離純化，流速為20mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)360nm，柱溫25°C，乙腈-水(25-75體積比)等度洗脫，即得到黃色晶體，該晶體中槲皮素-3-0-β -D-葡萄糖醛酸苷的重量含量為95%。
[0113]實(shí)施例3
[0114](1)將荷葉烘干、粉碎，形成荷葉粗粉；
[0115](2)稱取400g荷葉粗粉，采用1: 20的料液比(W/V)向該荷葉粗粉中加入8升60%乙醇溶液，70°C熱回流提取時(shí)間2h，重復(fù)浸提