環(huán)炔衍生化的糖的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及糖衍生物、包含糖的綴合物和用于產(chǎn)生糖衍生物和綴合物的方法的領(lǐng) 域。所述綴合物可用于免疫。
[0002] 發(fā)明背景 細(xì)菌的莢膜糖已經(jīng)多年用于針對(duì)有莢膜細(xì)菌的疫苗中。然而，由于糖是T-非依賴性的 抗原，所以它們免疫原性弱。與載體的綴合可將T-非依賴性抗原轉(zhuǎn)化成T-依賴性抗原，從 而增強(qiáng)記憶應(yīng)答，且允許產(chǎn)生保護(hù)性免疫。
[0003] 盡管用于綴合的經(jīng)典程序（還原性胺化，酰胺鍵形成等）依賴于多糖與載體蛋白 的胺的隨機(jī)反應(yīng)，但使得配體能夠位點(diǎn)特異性安裝至蛋白上的新穎綴合方法正在出現(xiàn)[1]。 位點(diǎn)特異性綴合，除了提供更均質(zhì)的生物分子作為疫苗候選物，還可以有助于保持蛋白的 免疫原性。
[0004] 點(diǎn)擊化學(xué)方法已被描述為用于通過(guò)以模塊化方式將小亞基接合在一起而形成復(fù) 雜物質(zhì)的方法[2,3]。各種形式的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)是本領(lǐng)域已知的，諸如Huisgen1，3_偶極 環(huán)加成銅催化的反應(yīng)[4]，這經(jīng)常被稱為"點(diǎn)擊反應(yīng)"。其他替代方案包括環(huán)化加成反應(yīng)，諸 如Diels-Alder，親核取代反應(yīng)（尤其對(duì)于小張力環(huán)如環(huán)氧基和氮雜環(huán)丙烷化合物），脲化 合物的羰基化學(xué)形成和涉及碳-碳雙鍵的反應(yīng)，諸如硫醇-炔反應(yīng)中的炔烴。
[0005] 疊氮化物-炔經(jīng)Huisgen環(huán)化加成反應(yīng)在還原劑存在的情況下使用銅催化劑以催 化結(jié)合至第一分子的末端炔基的反應(yīng)。在含疊氮化物部分的第二分子存在的情況下，疊氮 化物與活化炔反應(yīng)，以形成1，4-二-取代的1，2, 3-三唑。銅催化的反應(yīng)在室溫進(jìn)行，并且 足夠特異性，使得經(jīng)常不需要反應(yīng)產(chǎn)物的純化[5]。疊氮化物和炔官能團(tuán)對(duì)于水性介質(zhì)中的 生物分子主要是惰性的，允許反應(yīng)發(fā)生在復(fù)雜溶液中。形成的三唑是化學(xué)穩(wěn)定的，且不經(jīng)受 酶促裂解，使點(diǎn)擊化學(xué)產(chǎn)物在生物系統(tǒng)中高度穩(wěn)定。然而，銅催化劑對(duì)于活細(xì)胞是有毒的， 排除了生物應(yīng)用。
[0006] 已經(jīng)提出不含銅的點(diǎn)擊反應(yīng)[6]，其使用環(huán)張力（strain)(在環(huán)辛炔環(huán)中）代替銅 催化劑以促進(jìn)[3 + 2]疊氮化物-炔環(huán)化加成反應(yīng)。閉合的環(huán)結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)乙炔的實(shí)質(zhì)鍵角變 形，這與疊氮基團(tuán)高度反應(yīng)，以形成三唑。
[0007] 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供用于將糖衍生化的進(jìn)一步且改進(jìn)的方法。本發(fā)明的另一 個(gè)目標(biāo)是提供用于將糖綴合至各種部分（諸如載體蛋白）的進(jìn)一步且改進(jìn)的方法。本發(fā)明 的還有一個(gè)目標(biāo)是提供得到具有更均勻結(jié)構(gòu)的綴合物的綴合方法。本發(fā)明的還有一個(gè)目標(biāo) 是提供具有改善的免疫原性特性的綴合物。
[0008] 發(fā)明概述 本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于將糖衍生化和用于將此類糖衍生物綴合至其他部分的新方 法。本發(fā)明人還已經(jīng)產(chǎn)生了相對(duì)于本領(lǐng)域已知的糖衍生物和綴合物具有改善特性的新穎糖 衍生物和綴合物。具體而言，本發(fā)明的綴合物可具有改善的免疫學(xué)特性。
[0009] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將糖衍生化的方法，其包括將八元環(huán)炔基連接至糖。本 發(fā)明還提供了包含八元環(huán)炔基的糖衍生物。包含八元環(huán)炔基的糖衍生物可以通過(guò)所述將糖 衍生化的方法獲得或可獲得。
[0010] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了將糖衍生物綴合至含疊氮化物部分的方法，其包括 使八元環(huán)炔基與疊氮化物反應(yīng)以形成三唑鍵。本發(fā)明還提供了糖衍生物和含疊氮化物部分 的綴合物，其中所述綴合物具有式R-S-T，其中R包含糖衍生物的殘基，S是稠合至八元環(huán)烷 基的三唑基，且T包含部分含疊氮化物部分的殘基。
[0011] 綴合物可以通過(guò)本發(fā)明的將糖衍生物綴合至含疊氮化物部分的方法獲得或可獲 得。
[0012] 本發(fā)明也涉及包含與藥學(xué)上可接受的載體組合的本發(fā)明的綴合物的藥物組合物。
[0013] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及在哺乳動(dòng)物中引起免疫應(yīng)答的方法，其包括將本發(fā)明的綴合物 或藥物組合物施用于所述哺乳動(dòng)物。
[0014] 附圖簡(jiǎn)述 圖1顯示三種含環(huán)辛炔化合物。
[0015] 圖2顯示用于將環(huán)辛炔基團(tuán)連接至GBS血清型II糖的通用反應(yīng)方案。
[0016] 圖3顯示具有連接的環(huán)辛炔基團(tuán)的GBS血清型V糖（I)的結(jié)構(gòu)。
[0017] 圖4顯示具有連接的環(huán)辛炔基團(tuán)的GBS血清型II糖（II)的結(jié)構(gòu)。
[0018] 圖5顯示用于經(jīng)由酪氨酸殘基將糖衍生物（II)綴合至GBS80載體蛋白的通用反 應(yīng)方案。
[0019] 圖 6 顯示綴合物A的SDS-PAGE表征的結(jié)果（l=Mff，2=GBS80-Y-N3, 3=GBS80-Y-N3/ PSV，純化后）。
[0020] 圖 7 顯示綴合物B的SDS-PAGE表征的結(jié)果（l=Mff，2=GBS80-Y-N3, 3=GBS80-Y-N3/ PSII，純化后）。
[0021] 圖 8 顯示綴合物C的SDS-PAGE表征的結(jié)果（l=Mff，2=GBS67-Y-N3, 3=GBS67-Y-N3/ PSII，純化后，4=GBS67-Y-N3/PSII，純化后）。
[0022] 圖 9 顯示綴合物D的SDS-PAGE表征的結(jié)果（l=Mff，2=GBS67-Y-N3, 3=GBS67-Y-N3/ PSII，純化后，4=GBS67-Y-N3/PSII，純化后）。
[0023] 圖10顯示具有連接的環(huán)辛炔基團(tuán)的MenY糖（III)的結(jié)構(gòu)。
[0024] 圖 11 顯示綴合物E的SDS-PAGE表征的結(jié)果2=CRM197-Y-N3, 3=CRM197-Y-N3/ MenY)。
[0025] 圖12顯示用于測(cè)定針對(duì)GBS血清型II糖抗原（對(duì)于1· 0Pg碳水化合物劑量） 的IgG滴度的ELISA免疫測(cè)定結(jié)果。
[0026] 圖13顯示用于測(cè)定針對(duì)GBS血清型II糖抗原（對(duì)于0· 5Pg碳水化合物劑量） 的IgG滴度的ELISA免疫測(cè)定結(jié)果。
[0027] 圖14顯示用于測(cè)定針對(duì)GBS血清型II糖抗原（對(duì)于1. 0Pg蛋白劑量）的IgG 滴度的ELISA免疫測(cè)定結(jié)果。
[0028] 圖15顯不使用GBS囷株的調(diào)理吞卩策測(cè)定結(jié)果。
[0029] 圖16顯示各種抗原針對(duì)GBS血清型II糖的免疫應(yīng)答。
[0030] 圖17顯示各種抗原針對(duì)GBS80的免疫應(yīng)答。
[0031] 圖18顯示經(jīng)由MenY二聚體與CRM197的酪氨酸選擇性綴合制備的構(gòu)建體的結(jié) 構(gòu)。
[0032] 發(fā)明詳述 本發(fā)明涉及將糖衍生化的方法和將糖衍生物綴合至含疊氮化物部分的方法。本發(fā)明還 涉及新穎的糖衍生物和綴合物。下面詳細(xì)描述這些方法、糖衍生物和綴合物的特征。
[0033] 將糖衍生化的方法 本發(fā)明基于新穎的糖衍生物和產(chǎn)生此類糖衍生物的方法。
[0034] 磨 本發(fā)明的方法中使用的糖可以是任何糖，特別是來(lái)自病原生物體的糖。用于本發(fā)明的 方法中使用的示例性糖如下述。具體而言，糖可以是細(xì)菌糖，例如，細(xì)菌莢膜糖。
[0035] 可以使用寡糖形式的糖。這些通過(guò)以下方便地形成：對(duì)純化的多糖進(jìn)行片段化 (例如通過(guò)水解），隨后通常純化期望大小的片段。可以從天然來(lái)源純化糖。作為純化的替 代方案，可以通過(guò)完全或部分合成獲得糖。
[0036] 無(wú)乳鏈球菌莢膜糖 優(yōu)選的細(xì)菌莢膜糖包括來(lái)自無(wú)乳鏈球菌( "GBS"）的那 些。所述莢膜糖共價(jià)連接至GBS的肽聚糖骨架，并且與B群抗原不同，所述B群抗原是連接 至肽聚糖骨架的另一種糖。
[0037] GBS是新生兒生命的前3月中的嚴(yán)重細(xì)菌感染和母親中的敗血發(fā)病率的主要原因 [7]。GBS也是未懷孕成人中、特別是老人和具有基本醫(yī)療條件的成人中的發(fā)病率和死亡率 的重要原因。所有GBS菌株都在其表面上具有莢膜多糖（CPS)，這是主要的致病因子。已經(jīng) 表征了十種不同的CPS血清型（Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX)，其中五種（Ia、 Ib、II、III、V)是北美和歐洲的大部分新生兒疾病的原因。已經(jīng)制備了針對(duì)血清型Ia、Ib、 II、III、IV、V、VI、VII，VIII的單價(jià)綴合物疫苗，并且在動(dòng)物模型中證明了有效性3。最 近，已經(jīng)證明，GBS菌毛蛋白，除了是細(xì)菌粘附和侵入中的重要結(jié)構(gòu)以外，似乎比其他革蘭氏 陽(yáng)性菌的那些更保守[8]。
[0038] GBS莢膜糖化學(xué)上相關(guān)，但抗原性上非常不同。所有GBS莢膜糖共有以下三糖核 心： β-D-Glc/?NAc(1 - 3)β-D-Gal/?(1 - 4)β-D-Glc/7 各種GBS血清型的區(qū)別在于修飾其核心的方式。
[0039] GBS-相關(guān)疾病主要是由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII引起，其中 超過(guò)85%由五種血清型引起：1a、Ib、III和V。本發(fā)明可以使用來(lái)自任何血清型（特別是 血清型Ia、Ib、II、III和V)的糖。
[0040] 用于本發(fā)明的方法中的糖可以是其天然形式，或可已經(jīng)被修飾。例如，糖可以比天 然莢膜糖更短，或可被化學(xué)修飾。具體而言，本發(fā)明中使用的血清型V莢膜糖可以如參考文 獻(xiàn)9和10中所述進(jìn)行修飾。例如，已經(jīng)基本上脫唾液酸化的血清型V莢膜糖。脫唾液酸化 的GBS血清型V莢膜糖可通過(guò)以下制備：在溫和酸性條件下（例如0. 1M硫酸，80°C持續(xù)60 分鐘）處理純化的GBS血清型V莢膜糖或者通過(guò)用神經(jīng)氨酸酶處理，如參考文獻(xiàn)9中所述。 根據(jù)本發(fā)明使用的糖可以是如天然中發(fā)現(xiàn)的基本全長(zhǎng)莢膜多糖，或可短于天然長(zhǎng)度?？山?聚全長(zhǎng)多糖以提供用于本發(fā)明的較短片段，例如，通過(guò)在溫和酸中水解、通過(guò)加熱、通過(guò)大 小層析等。具體而言，本發(fā)明中使用的血清型II和/或III莢膜糖可以如參考文獻(xiàn)11和 12中所述進(jìn)行解聚。
[0041] 所述糖可以相對(duì)于自然中發(fā)現(xiàn)的莢膜糖進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，糖可被去-0-乙酰 化（部分或全部）、去-Ν-乙?；ú糠只蛉浚?、Ν-丙酸化（N-propionated)(部分或全 部）等?？稍诰Y合之前、期間或之后進(jìn)行去乙?；?，但優(yōu)選在綴合之前進(jìn)行。根據(jù)具體糖， 去乙酰化可影響或不影響免疫原性。參考文獻(xiàn)13討論了各種血清型中的GBS糖上的0-乙 ?；年P(guān)聯(lián)，且在一些實(shí)施方案中，位置7、8和/或9的唾液酸殘基的0-乙酰化在綴合之 前、期間和之后得到保留，例如通過(guò)保護(hù)/去保護(hù)、通過(guò)再乙?；?。然而，本發(fā)明中使用的 GBS糖通常在位置7、8和/或9基本上沒(méi)有唾液酸殘基的0-乙酰化。具體而言，當(dāng)所述GBS 糖通過(guò)如下所述的堿提取純化時(shí)，則通常喪失0-乙酰化。可通過(guò)常規(guī)測(cè)定評(píng)價(jià)去乙?；?的效果。
[0042] 可以通過(guò)已知技術(shù)純化莢膜糖，如參考文獻(xiàn)14中所述。典型的方法涉及堿提取、 離心、過(guò)濾、RNA酶/DNA酶處理、蛋白酶處理、濃縮、大小排阻層析、超濾、陰離子交換層析和 進(jìn)一步超濾。用酶變?nèi)芫靥幚鞧BS細(xì)胞（所述酶變?nèi)芫亓呀饧?xì)菌細(xì)胞壁以釋放細(xì)胞壁 組分）也是可用的。
[0043] 作為替代方案，可使用參考文獻(xiàn)15中描述的純化方法。這涉及堿提取、乙醇/CaCl2 處理、CTAB沉淀和再溶。參考文獻(xiàn)16中描述了進(jìn)一步替代方法。
[0044] 腦膜炎奈瑟氏菌莢膜糖 糖可以是細(xì)菌莢膜糖。示例性細(xì)菌莢膜糖包含來(lái)自腦膜炎奈瑟氏菌（I的那些?；谏矬w的莢膜多糖，已經(jīng)鑒定了腦膜炎奈瑟氏菌的各種血清群，包括A、B、C、 H、I、K、L、29E、W135、X、Y和Z。本發(fā)明中的糖可以來(lái)自任何這些血清群。糖通常來(lái)自以下 腦膜炎球菌血清群之一：A、C、W135和Y。
[0045] 通常使用寡糖形式的莢膜糖。這些通過(guò)以下方便地形成：對(duì)純化的莢膜多糖進(jìn)行 片段化（例如通過(guò)水解），隨后通常純化期望大小的片段。
[0046] 通常進(jìn)行多糖的片段化，以使寡糖的最終平均聚合度（DP)小于30 (例如，對(duì)于血 清群Α，10至20,優(yōu)選約10 ;對(duì)于血清群W135和Υ，15至25,優(yōu)選約15-20 ;對(duì)于血清群C， 12至22 ;等）。DP可通過(guò)離子交換層析或通過(guò)比色測(cè)定方便地測(cè)量[17]。
[0047] 如果進(jìn)行水解，則通常對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行篩分，以去除短長(zhǎng)度寡糖[18]。這可以各 種方式諸如超濾和隨后離子交換層析實(shí)現(xiàn)。對(duì)于血清群Α，優(yōu)選去除聚合度小于或等于約6 的寡糖；對(duì)于血清群W135和Υ，優(yōu)選去除聚合度小于約4的寡糖。
[0048] 糖的化學(xué)水解通常涉及在本領(lǐng)域中標(biāo)準(zhǔn)的條件下用酸或堿處理。用于將莢膜糖解 聚為它們的組分單糖的條件是本領(lǐng)域已知的。一種解聚方法涉及使用過(guò)氧化氫[19]。將過(guò) 氧化氫添加至糖（例如，使最終Η202濃度為1 % )，然后孵育混合物（例如在約55°C)，直到 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)期望的鏈長(zhǎng)降低。隨著時(shí)間降低隨后可以從混合物移取樣品，然后測(cè)量樣品中糖 的（平均）分子大小。然后可以通過(guò)一旦已經(jīng)達(dá)到期望的鏈長(zhǎng)就快速冷卻而停止解聚。
[0049] 血清群C、W135 和Y 用于從腦膜炎球菌制備莢膜多糖的技術(shù)已知多年，并且通常涉及包括多糖沉淀（例 如，使用陽(yáng)離子去污劑）、乙醇分餾、冷苯酚提?。ㄒ匀コ鞍祝┖统匐x心（以去除LPS) 的步驟的方法[例如，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)20]。
[0050] 更優(yōu)選的方法[21]涉及多糖沉淀和隨后使用低級(jí)醇溶解沉淀的多糖?？梢允?用陽(yáng)離子去污劑諸如四丁基銨和十六烷基三甲基銨鹽（例如，溴化物鹽），或海美溴銨 (hexadimethrinebromide)和肉豆蔻基三甲基銨鹽實(shí)現(xiàn)沉淀。特別優(yōu)選十六烷基三甲基 溴化銨（'CTAB'）[22]。使用低級(jí)醇諸如甲醇、丙-1-醇、丙-2-醇、丁-1-醇、丁-2-醇、 2-甲基-丙-1-醇、2-甲基-丙-2-醇、二元醇等實(shí)現(xiàn)沉淀物質(zhì)的溶解，但是乙醇特別適于 溶解CTAB多糖復(fù)合物。可以向沉淀的多糖添加乙醇以得到50%至95%的最終乙醇濃度 (基于乙醇和水的總含量）。
[0051] 再溶解后，可進(jìn)一步處理多糖以去除污染物。這在甚至較少的污染也不可接受 (例如對(duì)于人疫苗生產(chǎn)）的情況下特別重要。這通常涉及一個(gè)或兩個(gè)過(guò)濾步驟，例如深度過(guò) 濾（可以使用通過(guò)活性炭過(guò)濾）、大小過(guò)濾和/或超濾。
[0052] -旦過(guò)濾去除污染物，可以沉淀多糖用于進(jìn)一步處理和/或加工。這可以通過(guò)交 換陽(yáng)離子來(lái)方便地實(shí)現(xiàn)（例如通過(guò)添加鈣鹽或鈉鹽）。
[0053] 用于純化腦膜炎球菌糖的其他和替代方法公開(kāi)于參考文獻(xiàn)19和23。
[0054] 作為純化的替代方案，本發(fā)明的莢膜糖可以通過(guò)完全或部分合成獲得，例如Hib 合成公開(kāi)于參考文獻(xiàn)24,MenA合成公開(kāi)于參考文獻(xiàn)25。
[0055] 糖可以化學(xué)修飾，例如其可以被0-乙?；蛉?0-乙酰化。任何此類去-0-乙酰 化或超-乙?；梢栽谔侵械奶囟ㄎ恢谩＠纾蠖鄶?shù)血清群C菌株在唾液酸殘基的位置 C-7和/或C-8具有0-乙酰基，但約15%的臨床分離株缺乏這些0-乙酰基[26, 27]。乙酰 化似乎不影響保護(hù)效力（例如，與Menjugate?產(chǎn)品不同，NeisVac-C?產(chǎn)品使用去-0-乙酰 化的糖，但兩種疫苗都是有效的）。血清群W135糖是唾液酸-半乳糖二糖單元的聚合物。 血清群Y糖類似于血清群W135糖，除了二糖重復(fù)單元包括葡萄糖代替半乳糖。像血清群C 糖，MenW135和MenY糖具有可變的0-乙酰化，但在唾液酸7和9位置[28]。
[0056] 血清群A 所述方法可以包括血清群A莢膜糖抗原?？梢耘c用于血清群C、W135和Y(參見(jiàn)上文） 相同的方式純化或綴合糖，盡管其在結(jié)構(gòu)上不同一然而血清群C、W135和Y的莢膜基于唾液 酸乙?；?神經(jīng)氨酸，NeuAc)，而血清群A的莢膜基于，乙?；?甘露糖胺，其是唾液 酸的天然前體。血清群A糖特別易于水解，并且其在水性介質(zhì)中的不穩(wěn)定性意指（a)針對(duì) 血清群A的液體疫苗的免疫原性隨著時(shí)間下降，以及（b)由于糖水解產(chǎn)物釋放至疫苗中，質(zhì) 量控制更困難。
[0057] 天然MenA莢膜糖是（α1 - 6)-連接的，乙酰基-D-甘露糖胺-1-磷酸酯的均 聚物，其在C3和C4具有部分0-乙?；?。主要糖苷鍵是涉及D-甘露糖胺的C1的半縮醛 基和C6的醇基的1-6磷酸二酯鍵。平均鏈長(zhǎng)為93個(gè)單體。其具有下式：
已經(jīng)制備修飾的糖抗原，其保留天然血清群A糖的免疫活性，但在水中穩(wěn)定得多。由保 護(hù)基團(tuán)（blockinggroup)替代在單糖單元的碳3和4連接的羥基[參考文獻(xiàn)29和30]。
[0058] 具有保護(hù)基團(tuán)替代羥基的單糖單元的數(shù)量可以變化。例如，所有或基本上所有的 單糖單元可具有保護(hù)基團(tuán)。或者，至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或 90%的單糖單元可具有保護(hù)基團(tuán)。至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)單糖單元可具有保護(hù)基團(tuán)。
[0059] 類似地