一種藥物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于新藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種藥物組合物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大腸癌是常見的惡性腫瘤之一，在歐美等發(fā)達國家為惡性腫瘤發(fā)病率第二位，在 世界范圍內(nèi)為第三位。隨著我國居民生活水平的不斷提高和飲食習慣的日益西方化，大腸 癌的發(fā)病率也逐年增高，已躍居第3-5位，特別在大城市增幅更快。目前，應(yīng)對大腸癌的治 療僅采用對腫瘤有治療效果的藥物進行治療，缺乏針對大腸癌的靶向治療藥物，使得大腸 癌治療效果不佳，這種局面亟待改進。
[0003] miR-150抑制大腸癌細胞增殖
[0004]利用miRNA芯片直接從大腸癌進展過程中不同階段（正常、腺瘤、腺癌）臨床樣 本中進行篩選分析，獲得起關(guān)鍵作用的分子miR-150,隨后利用臨床大規(guī)模樣本分析，發(fā)現(xiàn) 大腸癌患者中miR-150低表達水平與患者的生存期較短相關(guān)，同時此類病人對手術(shù)后化療 的敏感性較差；而miR-150高表達水平則與患者的生存期較長相關(guān)，且此類病人對手術(shù)后 化療的敏感性較好。在體外根據(jù)已知的miRNA序列構(gòu)建miR-150類似物（mimics)、抑制物 (inhibitor)的oligo序列以及類似物和抑制物的對照序列（mimicscontrol、inhibitor control)(四條序列參見表1)，這四條序列可以通過商業(yè)公司購買。通過細胞學實驗證實 外源導(dǎo)入的miR-150明顯抑制大腸癌細胞的增殖，并且誘導(dǎo)癌細胞的程序化死亡。因此，使 用化學合成和修飾的microRNA治療大腸癌開創(chuàng)了一種全新的治療方法，是一種不同于傳 統(tǒng)小分子或單克隆抗體藥物的新型藥物，作用機理明確，靶點清晰，又由于此類分子是體內(nèi) 的自有分子，在安全性方面有獨特優(yōu)勢。
[0005]表1
[0006]
[0007] 合成的miRNA對靶向基因表達的調(diào)控
[0008]MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼 RNA，通過對信使RNA的調(diào)節(jié)而調(diào)控目標蛋白質(zhì)的表達。通常運用化學合成的方法合成模擬 生物體內(nèi)源的miRNAmimics與miRNAinhibitor;化學合成的miRNAmimics能模擬細胞 中內(nèi)源性成熟miRNA的高水平表達，以增強內(nèi)源性miRNA的調(diào)控作用；而化學合成獲得的 miRNAinhibitors能特異地革E1向和降解特定的miRNA分子，可以削弱內(nèi)源miRNA的基因沉 默效應(yīng)，從而調(diào)節(jié)靶蛋白質(zhì)的表達量。
[0009] 用于體內(nèi)siRNA傳遞的組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽（HKP)
[0010] 組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽（HKP，Histidine-LysineCo-polymer)是一種帶正電 的分枝型聚合物（圖1)，其已經(jīng)成功用于質(zhì)粒DNA和siRNA的體內(nèi)傳導(dǎo)。我們已開展在各 種組織類型中將HKP用于核酸體內(nèi)導(dǎo)入，包括皮膚瘢痕、肝臟、肺臟、腫瘤、眼睛和大腦。但 是，siRNA和miRNA的分子性狀不同，因此，能否采用HKP將miRNA進行體內(nèi)導(dǎo)入，仍需研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠用于制備治療大腸癌的靶向藥物的 藥物組合物。
[0012] 為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案：
[0013] -種藥物組合物，其包括含化學修飾或不含化學修飾的微核酸分子microRNA、以 及適用于體內(nèi)導(dǎo)入的載體，所述的載體為組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽（HKP)或其修飾物。
[0014] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150,所述的miR-150的序列為 5 '-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'，通過臨床大規(guī)模樣本分析，miR-150的表達水平與大腸 癌預(yù)后有緊密聯(lián)系。
[0015] 具體地，所述的miR-150為根據(jù)體外已知miRNA序列構(gòu)建的miR-150類似物。
[0016] 具體地，所述的微核酸分子microRNA為單鏈，易于降解，進行化學修飾以提高穩(wěn) 定性。
[0017] 具體地，所述的化學修飾形成在所述的微核酸分子microRNA的單個核苷酸或多 個核苷酸或核苷酸和戊糖骨架上。
[0018] 具體地，所述的化學修飾的修飾基團為氟基或甲氧基。
[0019] 更具體地，所述的化學修飾在所述的微核酸分子microRNA單鏈的2'0H位進行全 堿基修飾。
[0020] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-143,所述的miR-143的序列為 5 '-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3'。
[0021] 更具體地，所述的miR-143為根據(jù)體外已知miRNA序列構(gòu)建的miR-143類似物。
[0022] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-195,所述的miR-195的序列為 5 <-UAGCAGCACAGAAAUAUUGGC-3,〇
[0023] 更具體地，所述的miR-195為根據(jù)體外已知miRNA序列構(gòu)建的miR-195類似物。
[0024] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150和miR-143,所述的miR-150 和所述的miR-143混合成雙靶點微核酸抑制劑用于增強其抗腫瘤作用。
[0025] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150和miR-195,所述的miR-150 和所述的miR-195混合成雙靶點微核酸抑制劑用于增強其抗腫瘤作用。
[0026] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-143和miR-195,所述的miR-143 和所述的miR-195混合成雙靶點微核酸抑制劑用于增強其抗腫瘤作用。
[0027] 具體地，所述的微核酸分子microRNA包括miR-150、miR-143和miR-195,所述的 miR-150、所述的miR-143和所述的miR-195混合成三靶點微核酸抑制劑用于增強其抗腫瘤 作用。
[0028] 具體地，所述的組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽（HKP)為帶正電的分枝型組氨酸-賴 氨酸聚合物，在各種組織類型中用于核酸傳導(dǎo)。
[0029] 具體地，所述的組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽的修飾物為增加一個組氨酸的分枝型 組氨酸-賴氨酸聚合物（HKP+H)，在各種組織類型中用于核酸傳導(dǎo)，并誘導(dǎo)產(chǎn)生極低的免疫 及炎癥反應(yīng)。
[0030] 具體地，所述的組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽采用H3K4b，其由三個賴氨酸核心和四 個分枝構(gòu)成，該四個分枝均包括大量重復(fù)的組氨酸、賴氨酸，其具體結(jié)構(gòu)參見圖1。
[0031] 具體地，所述的組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽的修飾物采用H3K(+H) 4b，其具體結(jié)構(gòu) 為在H3K4b的分支上增加一個組氨酸，即H3K(+H)4b的結(jié)構(gòu)為將圖1中的側(cè)鏈R采用R=KHHHKHHHKHHHHKHHHK進行替換。
[0032] 具體地，所述的載體與所述的微核酸分子microRNA的N:P質(zhì)量比例介于8:1到 1 :8之間。
[0033] 優(yōu)選地，所述的載體與所述的微核酸分子microRNA的N:P質(zhì)量比例大于等于 4:1〇
[0034] 具體地，所述的載體采用三組分載體系統(tǒng)RGD-PEG-HKP，所述的三組分載體系統(tǒng) RGD-PEG-HKP由所述的RGD和所述的HKP化學偶合在所述的PEG的兩端。RGD是7到12個 氨基酸組成的多肽，對新生血管內(nèi)皮細胞具有特異識別和附著作用，可作為微核酸導(dǎo)入系 統(tǒng)的靶向因子。
[0035] 三組分載體系統(tǒng)RGD-PEG-HKP的HKP端可以和微核酸通過電荷鍵結(jié)合形成納米級 顆粒（約150nM)，RGD處于納米顆粒外部行使細胞祀向功能。
[0036] 具體地，所述的微核酸分子microRNA的摩爾濃度大于等于InM。
[0037] 本發(fā)明的HKP委托外包公司API，按照本發(fā)明人擁有的專利技術(shù)合成。圖2詳述了 HKP合成的具體步驟。
[0038] -種所述的藥物組合物在制備治療大腸癌的靶向藥物中的應(yīng)用。
[0039] -種所述的藥物組合物和小分子化藥或單克隆抗體協(xié)同使用在制備治療大腸癌 的靶向藥物中的應(yīng)用。
[0040] 本發(fā)明所使用的四條miRNA單鏈，經(jīng)化學方法經(jīng)由單體核苷酸全合成，而且采用 化學修飾增加其穩(wěn)定性。修飾位置為RNA單鏈的全堿基2'-0_甲基化（2'-〇me)或者2'-F 代修飾（圖14)，然后通過體外細胞實驗中mimics的相對活性篩選并確定化學修飾類型。
[0041] 由于以上技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：
[0042] 本發(fā)明通過將微核酸分子microRNA和載體按不同比例混合時，會自動組裝成不 同粒徑的納米顆粒，該納米顆粒適用于體內(nèi)核酸導(dǎo)入，可以誘導(dǎo)大腸癌細胞的程序化死亡， 從而抑制大腸癌的腫瘤生長，對大腸癌具有顯著藥效。
【附圖說明】
[0043] 附圖1為組氨酸-賴氨酸分枝狀多肽以及側(cè)鏈增加一個組氨酸修飾的結(jié)構(gòu)示意 圖，其中，R表示四個分支側(cè)鏈的氨基酸順序。
[0044] 附圖2為HKP的合成步驟圖。
[0045] 附圖3為瓊脂糖凝膠電泳定性檢測不同質(zhì)量的HKP包載microRNA的能力。micro 尺熟統(tǒng)一為1耶，!1即與1^1?熟質(zhì)量比分別為1:1、2:1、4:1、6:1、8:1;) ;]\1:]\&^1?^。
[0046] 附圖4為瓊脂糖凝膠電泳定性檢測不同質(zhì)量的HKP包載microRNA的能力。micro RNA統(tǒng)一為lug，HKP與miRNA質(zhì)量比分別為 2:1、2· 5:1、3:1、3· 5:1、4:1;M:Marker。
[0047] 附圖5為RiboGreen染色miRNA的熒光-濃度標準曲線。
[0048] 附圖6為HKP與miR-150不同氮磷質(zhì)量比（N/P)下游離miRNA占初始miRNA的比 例，即不同氮磷質(zhì)量比（N/P)下，HKP對miRNA的包封能力。
[0049]