15,16-二氫丹參酮Ⅰ在制備保護(hù)血管內(nèi)皮的藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及天然藥物領(lǐng)域，具體涉及一種化合物在制備血管內(nèi)皮保護(hù)藥物中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，我國(guó)人群心血管疾病的發(fā)病率和病死率在不斷增長(zhǎng)，目前估計(jì)有心血管 病患者約2. 9億人，且發(fā)病的年齡段提前?？梢?jiàn)，心血管疾病已嚴(yán)重威脅當(dāng)今人類生命健 康。心血管疾病包括動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等，病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，給治療帶來(lái)困難。 與西藥相比，傳統(tǒng)中藥具有確切的療效和較小的毒副作用，且有幾千年臨床經(jīng)驗(yàn)。從傳統(tǒng)中 藥中發(fā)現(xiàn)和制備前體藥物為心血管疾病新藥的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用開(kāi)辟了嶄新的道路。丹參為唇 形科鼠尾草屬植物（Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，具有祛瘀止痛、活血調(diào) 經(jīng)、養(yǎng)心除煩的功效。丹參被報(bào)道具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能，改善血液循環(huán)，有利于心血 管疾病的治療。丹參含有多種化學(xué)成分，其藥理活性各有側(cè)重，其中最主要的活性成分是水 溶性的丹參酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分。有文獻(xiàn)報(bào)道，丹參中脂溶性成分具有血 管內(nèi)皮保護(hù)作用（馬敏，丹參對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用，碩士論文，2001)。15, 16-二氫丹 參酮I就是其中的一種活性成分，但目前對(duì)它的單獨(dú)藥理活性研究較少。了解研究藥物保 護(hù)作用及機(jī)制對(duì)于新藥開(kāi)發(fā)和應(yīng)用具有巨大價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 申請(qǐng)人通過(guò)大量的試驗(yàn)篩選，意外發(fā)現(xiàn)15, 16-二氫丹參酮I對(duì)于血管內(nèi)皮具有 良好的保護(hù)作用，探究其保護(hù)機(jī)制有利于進(jìn)一步發(fā)掘丹參-作用靶點(diǎn)和功效，也有利于心 血管疾病新藥的發(fā)現(xiàn)。
[0004] 本申請(qǐng)的一個(gè)目的在于保護(hù)15, 16-二氫丹參酮I在制備保護(hù)血管內(nèi)皮的藥物中 的用途。所述保護(hù)血管內(nèi)皮的藥物用于治療心血管疾病，特別是用于預(yù)防或治療冠心病、 高血壓、腦出血、腦血栓等。所述保護(hù)血管內(nèi)皮的作用是通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2_ARE通路進(jìn)行的。
[0005] 本申請(qǐng)的另一個(gè)目的在于保護(hù)15, 16-二氫丹參酮I在制備抗氧化的藥物中的用 途。
[0006] 本發(fā)明對(duì)15, 16-二氫丹參酮I進(jìn)行了血管內(nèi)皮保護(hù)作用的活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)： 15, 16-二氫丹參酮I對(duì)ox-LDL刺激EA. hy926細(xì)胞造成的氧化損傷表現(xiàn)出明顯的保護(hù) 作用，并且呈現(xiàn)濃度依賴性。15, 16-二氫丹參酮I的預(yù)處理能升高ox-LDL刺激引起的 EA. hy926細(xì)胞中SOD酶活力的下降。將15, 16-二氫丹參酮I加入到轉(zhuǎn)染過(guò)質(zhì)粒的293T 細(xì)胞中，可以激活Nrf2下游的ARE元件，增強(qiáng)熒光酶活性的表達(dá)。該化合物能直接誘導(dǎo) EA. hy926細(xì)胞中的Nrf2表達(dá)，同時(shí)增加內(nèi)皮細(xì)胞中H0-1、NQ01、GCLC、GCLM基因的表達(dá)。 這說(shuō)明15, 16-二氫丹參酮I可能在激活Nrf2-ARE通路后，成功誘導(dǎo)了下游基因中二相解 毒酶的基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，從而推測(cè)15, 16-二氫丹參酮I保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞的作用是通過(guò)激活 Nrf2-ARE通路后誘導(dǎo)表達(dá)多種抗氧化酶而產(chǎn)生的。
【附圖說(shuō)明】
[0007] 圖1為15, 16-二氫丹參酮I對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的表型指標(biāo)檢測(cè)（MTT檢測(cè)存活 率）圖，橫坐標(biāo)為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活力。
[0008] 圖2為15, 16-二氫丹參酮I對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的表型指標(biāo)檢測(cè)（LDH檢測(cè)存活 率）圖，橫坐標(biāo)為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為L(zhǎng)DH指標(biāo)。
[0009] 圖3為15, 16-二氫丹參酮I對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的酶功能水平檢測(cè)（SOD)圖，橫 坐標(biāo)為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為SOD指標(biāo)。
[0010] 圖4為15, 16-二氫丹參酮I對(duì)激活A(yù)RE-相關(guān)熒光素酶活性檢測(cè)，橫坐標(biāo)為 15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為熒光素酶倍數(shù)值。
[0011] 圖5為15, 16-二氫丹參酮I對(duì)Nrf2、Η0-1、GCLC、GCLM的mRNA水平的影響，橫坐 標(biāo)為15, 16-二氫丹參酮I濃度（μ M)，縱坐標(biāo)為目的基因與內(nèi)參基因 GAPDH的比值。
【具體實(shí)施方式】：
[0012] 實(shí)施例1 :15, 16-二氫丹參酮I化合物的制備
[0013] 1材料與儀器
[0014] 柱層析硅膠（100~200目，200~300目）、薄層層析硅膠H購(gòu)自青島海洋化工有 限公司（化學(xué)純）。提取分離用試劑石油醚（無(wú)錫亞盛）、乙酸乙酯（南京化學(xué)試劑）、氯仿 (上海凌峰）、甲醇（江蘇漢邦）、丙酮（南京化學(xué)試劑）均為分析純，鑒定用試劑甲醇（江 蘇漢邦）、乙腈（默克）為色譜純。丹參酮提取物：購(gòu)買于山東華信制藥有限公司，丹參總 酮含量約8%。
[0015] AgilentllOO液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（Agilent公司）；中壓制備系統(tǒng)（瑞 士 _Β?:_〇?Ι 公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 Β?(:?Ι Rotavapor R-200(瑞士孩OCHI 公司）。
[0016] 2 方法
[0017] 2.1提取與分離
[0018] 取丹參酮粗提物500g，用適量的乙酸乙酯溶解，加500g 200~300目硅膠拌勻， 水浴上將乙酸乙酯揮干，過(guò)60目篩。采用干法裝硅膠柱，裝入約860g拌勻物，約含430g粗 提物。粗分后用中壓制備柱反復(fù)進(jìn)行細(xì)分純化，最后細(xì)分得到各化合物單體。分離過(guò)程中， 根據(jù)待分離化合物性質(zhì)的不同選用了不同的洗脫系統(tǒng)，包括：石油醚-乙酸乙酯，二氯甲 烷-甲醇，正己烷-乙酸乙酯。
[0019] 2. 2儀器分析條件
[0020] T0F/MS條件：電噴霧離子源參數(shù)：干燥氣流速（N2 Drying gas flow-rate): 10.0 L/min;干燥氣溫度（Drying gas temperature) :33〇°C ;霧化氣壓力（Nebulizer): 241kPa(35psig);毛細(xì)管電壓（Capillary voltage) :3000V;裂解電壓（Fragmentor): 120 ~420V ;skimmer voltage，60V ;octapole DC 1，37V ;octapole radio frequency，250VD 數(shù)據(jù)米集和分析分別由 Agilent MassHunter Acquisition 軟件 (Agilent，美國(guó)）和 Applied Biosystems/MDS-Sciex Analyst QS 軟件（Frankfurt，德國(guó)） 完成。
[0021] 3 結(jié)果
[0022] 15, 16-二氫丹參酮I為棕紅色針晶，mp 215~216°C，TOF MS顯示[M+H]+為m/ z 279. 1048, [M+Na]+為 m/z 301. 1，[2M+Na] + 為 m/z 579. 2,可鑒定該化合物分子式為： C18H14O3D
[0023] IH-匪R(300MHz，CDC13) δ :9. 29(1H，d，J = 8. 7Hz，H-1)，7. 57(1H，dd，J = 8.7Hz，H-2)，7.39(lH，d，J = 6.9Hz，H-3)，8.30(lH，d，J = 8.7Hz，H-6)，7.75(lH，d，J = 8. 7Hz，H-7)，4. 43 (1H，dd，J = 6. 3Hz，H-15)，4. 96 (1H，t，J = 9. 6Hz，H-15)，3. 65 (1H，M，H-16 )，I. 41 (3H，d，J = 6. 9Hz，Me-17)，2. 70 (3H，s，Me-18)，以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)（章敏·丹參中具有 醌還原酶誘導(dǎo)活性化合物的發(fā)現(xiàn)[D].浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010年）報(bào)道的15, 16-二 氫丹參酮I (15, 16-dihydrotanshinone I )數(shù)據(jù)一致，此化合物鑒定為15, 16-二氫丹參 酮I。其結(jié)構(gòu)式如下：
[0025] 將實(shí)施例1制備的15, 16-二氫丹參酮I，進(jìn)行了下述藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)。
[0026] 實(shí)驗(yàn)例2 :15, 16-二氫丹參酮I對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞作用的表型指標(biāo)檢測(cè)（MTT、LDH)
[0027] 1材料與儀器
[0028] EA. hy926細(xì)胞：購(gòu)自ATCC公司，由本實(shí)驗(yàn)室保存。DMEM高糖培養(yǎng)基（ATCC公 司），胎牛血清、〇· 25%胰酶、青霉素 lOkU/mL、鏈霉素10kU/mL(Invitrogen公司），PBS(北 京博奧森生物技術(shù)有限公司），RIPA裂解液、氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL)(北京協(xié)生生物 科技有限責(zé)任公司），PhosSTOP、complete ULTRA Tablets，MiniEASYpack(Roche 公司）， MTT(Bi〇Sharp公司），乳酸脫氫酶（LDH)試劑盒（南京建成生物工程研究所）。
[0029] 超凈臺(tái)（美國(guó) Thermo 公司，ThermoScientif ic 13〇ΟΑ2 型），酶標(biāo)儀（Biotek 公司， Synergy 2型），電熱恒溫水浴鍋（國(guó)華電器有限公司，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋），CO2培養(yǎng)箱 (美國(guó) Thermo 公司，series 2 Water Jacket)，離心機(jī)（美國(guó) Thermo 公司，F(xiàn)rescol7)，天 平（北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，BT 224S)，細(xì)胞培養(yǎng)耗材、微量移液器：美國(guó)Thermo 公司。
[0030] 2 方法
[0031] 2. I EA. hy926細(xì)胞的培養(yǎng)與傳代
[0032] EA.hy926 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，置飽和濕度、37 °C的5 % CO2培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)。EA. hy926細(xì)胞用含EDTA的0. 25 % 胰蛋白酶處