行研究。本實(shí)施例所使用的疾病模式可代表周邊動脈閉塞疾病的小鼠后肢缺血模式，已 知美國約有一千萬人罹患該疾病。
[0112] 為了解人類間葉干細(xì)胞保留與透明質(zhì)酸分解之間的關(guān)聯(lián)性，將4X106人類間葉干 細(xì)胞與透明質(zhì)酸混合后，注入小鼠的缺血后肢。
[0113] 在三組治療組中，人類間葉干細(xì)胞所發(fā)散的熒光信號呈現(xiàn)相似的表達(dá)特性（圖 13)。特別是，相較于原始信號強(qiáng)度，在注射48小時(shí)內(nèi)，HA-1640的信號約下降7%，HA-800 的信號約下降20%，而HA-200的信號則下降約25%。該些結(jié)果指出移植的人類間葉干細(xì) 胞會因體循環(huán)或細(xì)胞凋亡而逐漸減少。
[0114] 圖13亦指出，在注入透明質(zhì)酸/人類間葉干細(xì)胞（HA/hMSC)組中，人類間葉干細(xì) 胞的熒光信號的減少會較為緩慢，且于注射后48小時(shí)達(dá)到最低，意指人類間葉干細(xì)胞會附 著于周邊的微環(huán)境。然而，72小時(shí)（3天后），熒光信號開始增加，其中又以HA-200/人類 間葉干細(xì)胞（HA-200/hMSC)組的增加最為顯著，而以HA-1640/人類間葉干細(xì)胞（HA-1640/ hMSC)組最為緩慢。由于在不同治療組別中，人類間葉干細(xì)胞的生長百分比約略相同（圖 14到圖15)，因此推測該差異并非因不同透明質(zhì)酸引發(fā)不同細(xì)胞生長速率所導(dǎo)致。如圖13 所示，HA-200/hMSC組中細(xì)胞的保留量約為HA-1640/hMSC組的3. 6倍，故熒光增加可能是 由注射48小時(shí)后保留的人類間葉干細(xì)胞比例所造成。同時(shí)亦檢測移植人類間葉干細(xì)胞的 凋亡比例，結(jié)果顯示合并治療組的熒光表達(dá)并非由不同分子量的透明質(zhì)酸所造成（圖16到 圖 17)。
[0115] 可觀察到在移植48小時(shí)內(nèi)，人類間葉干細(xì)胞的熒光強(qiáng)度改變是與透明質(zhì)酸的分 解特性相關(guān)。48小時(shí)后，人類間葉干細(xì)胞的熒光表達(dá)會開始增加，而透明質(zhì)酸的熒光表達(dá)則 會持續(xù)下降（圖18到圖20)。
[0116] 由HA-200/hMSC、HA-800/hMSC及HA-1640/hMSC治療組取得預(yù)損傷組織，并染色觀 察Ds-Red表達(dá)，據(jù)以分析保留于各組織的細(xì)胞百分比。由HA-200組的小鼠后肢可觀察到 最高量的人類間葉干細(xì)胞數(shù)，HA-800組則次之（圖21及圖22)。
[0117] 由該些結(jié)果可知，移植的人類間葉干細(xì)胞可能會經(jīng)歷三個階段：耗損、附著及增 生。在注射48小時(shí)內(nèi)，如熒光信號的減少所指，人類間葉干細(xì)胞會在透明質(zhì)酸中耗損。移 植后的48到72小時(shí)間，如穩(wěn)定的熒光信號所示，人類間葉干細(xì)胞會開始附著于周邊微環(huán)境 中。移植后72小時(shí)的最后階段，即使無透明質(zhì)酸，熒光信號依然會逐漸上升，意即細(xì)胞開始 增生。因此，在進(jìn)行成功的移植試驗(yàn)（例如干細(xì)胞移植）時(shí)，伴隨的生物性材料應(yīng)于活體系 統(tǒng)中維持至少48小時(shí)。否則，該材料無法適當(dāng)?shù)剌o助細(xì)胞維持停留于損傷位置。
[0118] 實(shí)施例5
[0119] 不同治療組的治療功效
[0120] 周邊動脈閉塞疾病的進(jìn)程往往會導(dǎo)致腿痛及嚴(yán)重的并發(fā)癥，例如截肢。減緩不舒 適并保留肢體為臨床治療的首要目的。本實(shí)施例將初步檢測小鼠在進(jìn)行左股動脈結(jié)扎手術(shù) 1天、2周及4周后，其遠(yuǎn)程大腿及小腿肌肉的狀態(tài)，藉以直接觀察肢體保留的程度。
[0121] 當(dāng)僅以人類間葉干細(xì)胞或透明質(zhì)酸治療缺血肢體時(shí)，并不會看到明顯的治療效 果；然而，若以透明質(zhì)酸/人類間葉干細(xì)胞進(jìn)行合并治療，則可觀察到缺血肢體顯著的改善 (圖23)。若能在注射48小時(shí)后保留大多數(shù)的人類間葉干細(xì)胞，則可改善治療結(jié)果；例如 HA-200/hMSC組僅會造成輕微的指甲損傷，而可成功地保留肢體。然而，若是人類間葉干細(xì) 胞保留量減少，雖可免除截肢，但卻無法保留數(shù)個腳趾（圖23,最右欄）。相較于以生理鹽 水治療的對照組，其它包含單獨(dú)投予人類間葉干細(xì)胞、單獨(dú)投予HA-200、單獨(dú)投予HA-800 及單獨(dú)投予HA-1640的治療組皆不具有明顯的治療效果，在該些組別中，小鼠的肢體由于 嚴(yán)重壞疽需進(jìn)行截肢處理。
[0122] 此外，亦利用缺血區(qū)域的血流恢復(fù)程度作為另一種用以評估治療功效的臨床 指標(biāo)。在注射后，利用錯射杜卜勒微流儀（laserDopplerflowmetry，moorLDI;Moor Instrument，英國）來觀察小鼠后肢每周的血流量，藉以比較不同治療組別的血流恢復(fù)程 度（圖24)。于以HA-200及人類間葉干細(xì)胞治療的小鼠可觀察到最高的血流恢復(fù)量，而于 投予HA-1640的小鼠則可觀察到較少的人類間葉干細(xì)胞保留量及最低的血量恢復(fù)量。更具 體來說，HA-200/hMSC組的血流會于第2周顯著的增加。相較之下，接受人類間葉干細(xì)胞或 透明質(zhì)酸單獨(dú)治療組別的小鼠，其血流恢復(fù)量則與生理鹽水治療組的小鼠無顯著差異。
[0123] 進(jìn)一步計(jì)算臨床分?jǐn)?shù)來證明各治療的功效。在以生理鹽水、單獨(dú)投予人類間葉干 細(xì)胞或單獨(dú)投予透明質(zhì)酸的組別可觀察到較高的臨床分?jǐn)?shù)，意即缺血后肢呈現(xiàn)包含嚴(yán)重截 肢等較差的狀況。相較之下，于HA/hMSC合并治療組則可觀察到較佳的治療功效，其中又以 HA-200/hMSC組具有最佳的治療效果（圖25)。此外，亦利用免疫組織化學(xué)染色來分析治療 功效的改善機(jī)制；結(jié)果顯示，HA-200/hMSC治療可藉由促進(jìn)血管新生（圖26及圖27)及動 脈新生（圖28及圖29)來增加小鼠缺血性后肢的組織修復(fù)。
[0124] 同時(shí)追蹤活體內(nèi)透明質(zhì)酸的分解特性及人類間葉干細(xì)胞的保留狀態(tài)可了解在特 定治療期間延長干細(xì)胞的保留時(shí)間能增加干細(xì)胞的治療功效?；铙w內(nèi)較高量的干細(xì)胞保留 可治療罹患后肢缺血的小鼠，藉由促進(jìn)血管生成來增加肢體的保留及血流量的恢復(fù)。干細(xì) 胞的保留時(shí)間是與適當(dāng)?shù)纳锓纸庑圆牧舷嚓P(guān)，其中該生物分解性材料的分解速率會因注 射位置及注射體積的不同而有所差異?？赏高^修飾材料、選用不同分子量的物質(zhì)或調(diào)整注 射體積使生物材料的分解速率最佳化，其中注射體積乃需經(jīng)過活體內(nèi)的特性分析方可進(jìn)一 步確認(rèn)。
[0125] 綜合上述，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)移植干細(xì)胞的保留時(shí)間是與生物材料緊密相關(guān)。本發(fā)明亦 發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的保留會影響治療功效。該些結(jié)果證實(shí)，具有低分解速率及高細(xì)胞保留特性的 低分子量透明質(zhì)酸可用以改善諸如移植人類干細(xì)胞等移植細(xì)胞的治療功效。此外，實(shí)施例5 的結(jié)果亦證明使用生物分解性材料來輔助遞送干細(xì)胞具有相加乘的功效，且在選擇最適當(dāng) 的生物材料時(shí)，應(yīng)注意考慮其于活體內(nèi)的保留時(shí)間。
[0126] 即使本揭示內(nèi)容是以特定的材料及疾病模式來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，本發(fā)明亦可由其它 材料及細(xì)胞或藥物傳遞系統(tǒng)來完成。此外，疾病模式可以衍伸至其它種缺血性疾病，舉例來 說，本發(fā)明方法亦可用以治療心肌梗塞及中風(fēng)等缺血性疾病。
[0127] 雖然上文實(shí)施方式中揭露了本發(fā)明的具體實(shí)施例，然其并非用以限定本發(fā)明，本 發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識者，在不悖離本發(fā)明的原理與精神的情形下，當(dāng)可對其 進(jìn)行各種更動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)以附隨權(quán)利要求書所界定者為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用以將一群治療細(xì)胞在有需要進(jìn)行細(xì)胞治療個體體內(nèi)的治療位置維持一段時(shí) 間的方法，包含： 對該治療位置投予治療有效量的治療細(xì)胞；以及 對該治療位置投予有效量的生物分解性材料，其包含透明質(zhì)酸化合物，其中該生物分 解性材料于活體內(nèi)的分解特性相似于分子量為20千道爾頓到2,OOO千道爾頓的透明質(zhì)酸 于活體內(nèi)的分解特性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該治療細(xì)胞為干細(xì)胞、誘導(dǎo)多功能細(xì)胞、功能分化 細(xì)胞或重組細(xì)胞。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該干細(xì)胞選自由胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì) 胞、神經(jīng)干細(xì)胞、血管干細(xì)胞、間葉干細(xì)胞、心臟干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞、肌肉干細(xì)胞、牙齒干細(xì) 胞、骨頭干細(xì)胞、軟骨干細(xì)胞、骨膜干細(xì)胞、乳腺干細(xì)胞、子宮干細(xì)胞、內(nèi)皮干細(xì)胞、皮膚干細(xì) 胞、胎盤干細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、卵黃囊干細(xì)胞及羊水干細(xì)胞所組成的群組。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，該功能分化細(xì)胞選自由纖維母細(xì)胞、軟骨 細(xì)胞、成骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、牙細(xì)胞、腎細(xì)胞、胰島 細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肌肉細(xì)胞及血球細(xì)胞所組成的群組。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該透明質(zhì)酸化合物至少是一種選自由透 明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸的部份酯類或全酯類、經(jīng)己二酸二酰肼修飾的透明質(zhì)酸、透明質(zhì)酸酰胺、 交聯(lián)透明質(zhì)酸、丁二酸的半酯、透明質(zhì)酸的重金屬鹽類、硫化透明質(zhì)酸、N-硫化透明質(zhì)酸、經(jīng) 氨基修飾的透明質(zhì)酸、經(jīng)雙氨修飾的透明質(zhì)酸及透明質(zhì)酸與絲的組合物所組成的群組的化 合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該透明質(zhì)酸的分子量為50千道爾頓到 1，600千道爾頓。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，該透明質(zhì)酸的分子量為200千道爾頓到 800千道爾頓。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該一段時(shí)間至少為7天。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該一段時(shí)間至少為28天。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物分解性材料于活體內(nèi)的半衰期為 4小時(shí)到28天。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該活體內(nèi)半衰期為8小時(shí)到7天。12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，該活體內(nèi)半衰期為1到3天。13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該生物分解性材料更包含至少一種選自 由膠原、明膠、藻酸鹽、幾丁聚糖、纖網(wǎng)蛋白及纖維蛋白膠所組成的群組的成份。14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在投予3到10天后位于該治療位置的該 群治療細(xì)胞會等于或大于起始投予的該群治療細(xì)胞。15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在投予該生物分解性材料之前或之后投 予該治療細(xì)胞。16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在投予該生物分解性材料的同時(shí)投予該 治療細(xì)胞。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，該治療細(xì)胞及該生物分解性材料配制 為單一組合物。18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，可分別或同時(shí)使用直接施予、以導(dǎo)管輔 助傳送、以內(nèi)視鏡輔助傳送、以機(jī)器輔助傳送、以儀器輔助傳送或以影像儀器引導(dǎo)傳送來投 予該治療細(xì)胞及該生物分解性材料。19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該治療有效量的治療細(xì)胞為該個體每公 斤體重IXIO4至IX10 8細(xì)胞。20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該有效量的透明質(zhì)酸為該個體每公斤體 重0.01到10毫克。
【專利摘要】本揭示內(nèi)容是關(guān)于一種用以將一群治療細(xì)胞在有需要進(jìn)行細(xì)胞治療個體體內(nèi)的治療位置維持一段時(shí)間的方法。該方法包含對該治療位置投予治療有效量的治療細(xì)胞及有效量的生物分解性材料。該分解性材料包含透明質(zhì)酸化合物，且具有與分子量為20千道爾頓到2,000千道爾頓的透明質(zhì)酸相似的活體內(nèi)分解特性。
【IPC分類】A61K31/728
【公開號】CN105228632
【申請?zhí)枴緾N201480008940
【發(fā)明人】謝清河, 賴佳昀
【申請人】謝清河
【公開日】2016年1月6日
【申請日】2014年2月14日
【公告號】EP2964237A2, WO2014127232A2, WO2014127232A3