一種治療再生障礙性貧血的干細(xì)胞制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種治療再生障礙性貧血的干細(xì)胞制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA，簡(jiǎn)稱再障)是一種常見(jiàn)的自身免疫性血液系統(tǒng)疾病，是造血干細(xì)胞減少導(dǎo)致的外周血全血細(xì)胞減少及骨髓增生不良為主要特征的一組疾病，其發(fā)病機(jī)制涉及造血微環(huán)境異常、造血干/祖細(xì)胞缺陷和免疫功能紊亂。具體表現(xiàn)為外周血全血細(xì)胞減少，骨髓穿刺檢查中亦有造血細(xì)胞三系減少:中性粒細(xì)胞< 0.5父109/1，血小板< 20父109/1，網(wǎng)織紅細(xì)胞< 1%，非造血細(xì)胞增多，患者表達(dá)增高的細(xì)胞因子包括IFN — γ ,IL-2,TNF- α等。AA病情重，危害大，療效差，死亡率高，是一種難治性疾病。
[0003]同時(shí)，目前研究者還普遍認(rèn)為再生障礙性貧血是一種獲得性骨髓造血功能衰竭癥，再生障礙性貧血的發(fā)生、發(fā)展與T細(xì)胞功能亢進(jìn)引起的造血組織損傷密切相關(guān)。
[0004]目前再障的主要治療手段有:造血干細(xì)胞移植(HSCT)和免疫抑制劑(1ST)治療。其中造血干細(xì)胞移植應(yīng)綜合考慮患者年齡、人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)與供者間配型符合程度、有無(wú)感染及反復(fù)輸血史等因素，是目前最為可行的方法，但供者來(lái)源有限，費(fèi)用高，病死率高，且5%-15%的患者因?yàn)槁砸浦参锟顾拗鞑?GvHD)影響療效和生活質(zhì)量。免疫抑制治療適用于急性再生障礙性貧血(SAA)患者。1ST的治療反應(yīng)率為60%-80%，5年生存率與HSCT相當(dāng)，但大多數(shù)患者無(wú)法痊愈，血細(xì)胞數(shù)不能恢復(fù)到正常狀態(tài)，5年復(fù)發(fā)率約為30%。因此HSCT后的并發(fā)癥和1ST后的復(fù)發(fā)危險(xiǎn)仍舊困擾著當(dāng)今的臨床醫(yī)生及醫(yī)學(xué)研究者，尚需進(jìn)一步探索能提高療效，減輕不良反應(yīng)的治療途徑。
[0005]間充質(zhì)干細(xì)胞是一群中胚層來(lái)源的具有自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，不僅具有造血支持作用，同時(shí)還具有免疫抑制作用，且具有多向分化、組織修復(fù)、異體輸注無(wú)毒副作用、可移植性和來(lái)源廣泛的特點(diǎn)。
[0006]間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能如下:間充質(zhì)干細(xì)胞抑制了 T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的功能，也影響了樹(shù)突狀細(xì)胞(DC細(xì)胞)的活性。此外，間充質(zhì)干細(xì)胞還能夠產(chǎn)生多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子以及可能在細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)或迀移過(guò)程中起關(guān)鍵作用的蛋白酶形成免疫抑制。間充質(zhì)干細(xì)胞在體外有抑制T淋巴細(xì)胞增殖的作用，而且這種抑制作用不依賴于間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源。
[0007]同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用呈劑量依賴性，隨著間充質(zhì)干細(xì)胞劑量的增加，抑制作用增強(qiáng)。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞用的免疫抑制療法需要較大的細(xì)胞量才能起到作用，但干細(xì)胞移植數(shù)量的增加會(huì)引起血管栓塞、發(fā)熱等副作用；所以，如果提高單個(gè)細(xì)胞的免疫抑制能力，在較少細(xì)胞量的情況下，移植較少細(xì)胞量即可充分起到免疫抑制作用，提高細(xì)胞治療效力，保證最大的臨床移植效果，同時(shí)最大限度的減少不良反應(yīng)，而且降低了治療成本，具有重要的意義，為自身免疫性疾病患者特別是再障患者帶來(lái)了福音。
[0008]雖然將間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床再生障礙性貧血治療，不少病例也取得了一定效果。然而間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于治療再障仍處于探索期，還有許多問(wèn)題有待于進(jìn)一步的解決，如間充質(zhì)干細(xì)胞的具體輸注劑量，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌能力、分化潛能對(duì)于造血干細(xì)胞的具體影響如何等，仍未獲得一種針對(duì)再生障礙性貧血的干細(xì)胞制劑。相信隨著對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞及干細(xì)胞與臨床轉(zhuǎn)化研究的不斷深入，在不久的未來(lái)，間充質(zhì)干細(xì)胞會(huì)成為治療再障的又一種有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，解決現(xiàn)有技術(shù)中針對(duì)治療再障患者的間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力較低，及治療再障的干細(xì)胞制劑及其制備方法的缺陷形成的具體輸注劑量，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌能力、分化潛能對(duì)于造血干細(xì)胞的具體影響等，本發(fā)明提供了一種治療再生障礙性貧血的干細(xì)胞制劑的制備方法，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，降低移植抗宿主病發(fā)生率，在較短時(shí)間內(nèi)獲得更多的具有較強(qiáng)免疫抑制功能的間充質(zhì)干細(xì)胞，滿足臨床需求，為間充質(zhì)干細(xì)胞的移植功效提供了新的思路，發(fā)揮重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0010]為了解決間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力用于治療再障，本發(fā)明還提供了一種用于治療再生障礙性貧血的干細(xì)胞制備方法，該方法用特殊方法誘導(dǎo)和培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，可以有效地提高和增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制能力，可進(jìn)一步制備成治療再生障礙性貧血的干細(xì)胞制劑。
[0011]本發(fā)明是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的:
一種治療再生障礙性貧血的干細(xì)胞制劑的制備方法，所述的干細(xì)胞制劑中的干細(xì)胞是通過(guò)以下方法制備的，具體步驟如下:
(1)取P3~P6代的間充質(zhì)干細(xì)胞，首先進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定，標(biāo)記物⑶29、⑶44、⑶90、CD105、CD166表達(dá)在90%以上；不表達(dá)CD34、CD45，在5%以下；
(2)將其以2X104個(gè)/ml的濃度混勻于培養(yǎng)基A中，置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)第2天換液，以后每2天換液I次；
(3)當(dāng)上述細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%-90%時(shí)，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37°C條件下消化3~4分鐘，制備成細(xì)胞懸液，以2X 14個(gè)/ml的濃度混勻于培養(yǎng)基B中，置于37°C、5%C02、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，培養(yǎng)第2天換液，以后每2天換液I次；
(4)當(dāng)上述細(xì)胞培養(yǎng)融合至80%-90%時(shí)，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37°C條件下消化3-4分鐘，制備成細(xì)胞懸液，以5 X 15個(gè)/ml的濃度混勻于培養(yǎng)基C中，置于37°C、5%C0 2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)48~72h，培養(yǎng)第2天換液；
(5)將上述步驟(4)特殊培養(yǎng)后的干細(xì)胞，以0.025%胰蛋白酶-EDTA在37°C條件下消化3~4分鐘，制備成細(xì)胞懸液，以1000r/min離心10分鐘，棄去上清液并以生理鹽水重懸，以lOOOr/min離心10分鐘后棄去上清液，收集沉淀的干細(xì)胞備用；
其中:所述的步驟(2)中培養(yǎng)基A的組成是:含10%胎牛血清、I X雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基;
所述的步驟(3)中培養(yǎng)基B的組成是:含75yg/L γ干擾素(INF-γ )，75 μ g/L腫瘤壞死因子-a(TNF-a ),15 mg/L堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、15 mg/L表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、5 g/L牛血清白蛋白(BSA)、1.5 mg/L還原型谷胱甘肽、I X胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-砸-乙醇胺添加劑、0.05 mmol/L β -巰基乙醇、10 mg/L氫化可的松、100nmol/L地塞米松和1%非必須氨基酸的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基；
所述的步驟(4)中培養(yǎng)基C的組成是:含質(zhì)量體積比為(1~5)%的人血白蛋白、質(zhì)量體積比為0.5%的低分子肝素|丐、質(zhì)量體積比為(1~20) %的復(fù)方氨基酸、質(zhì)量體積比為(0.3-0.7)%的維生素C、20ng/ml的白介素3 (IL_3)、20ng/ml的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、30ng/ml的白介素11 (IL_ll)、3U/ml的促紅細(xì)胞生成素(EP0)、50ng/ml的干細(xì)胞因子(SCF)和3U/ml的人促血液血管生長(zhǎng)素(HAPO)以及(60-90) ymol/L的氯化鈷(CoCl2)的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0012]進(jìn)一步的，所述的步驟(4)中培養(yǎng)基C的優(yōu)選組成是含質(zhì)量體積比為5%的人血白蛋白、質(zhì)量體積比為0.5%的低分子肝素鈣、質(zhì)量體積比為10%的復(fù)方氨基酸，質(zhì)量體積比為0.5%的維生素C、20ng/ml的