用于修復卵巢功能的細胞制劑的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及細胞工程技術領域，特別設及一種用于修復卵巢功能的細胞制劑。
【背景技術】
[0002] 卵巢功能減退是指卵巢產生卵子能力減弱，卵泡質量下降，導致女性生育能力下 降及性激素缺乏。卵巢功能減退會進一步發(fā)展導致卵巢功能衰竭，其中卵巢早衰是指婦女 在40歲W前因某種原因引起的閉經、不育、雌激素缺乏W及促性腺激素水平升高為特征的 一種疾病。目前為止，除年齡因素引起的生理性卵巢功能減退外，大多數(shù)病理性卵巢減退的 病因仍不明確。臨床上治療效果不佳，輔助生殖治療成功率也較低。
[0003] 目前有研究表明，采用干細胞制成的單一制劑能夠促進卵巢細胞修復卵巢，但干 細胞只能在一定時間內恢復卵巢激素平衡，無法從根本上解決卵巢功能衰退或持續(xù)保持卵 巢激素平衡的問題。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對現(xiàn)有技術中采用單一細胞制劑修復卵巢存在 修復不穩(wěn)定、不徹底等缺陷，提供一種能夠徹底修復卵巢功能的混合干細胞制劑。
[0005] 本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:提供一種用于修復卵巢功能的細胞 制劑，包括羊膜間充質干細胞和卵巢細胞。
[0006] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述細胞制劑中，所述羊膜間 充質干細胞的濃度為(1~5) X IO5個/ml，所述卵巢細胞的濃度為(4~8) X IO5個/ml。
[0007] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述細胞制劑還包括肝素鋼、 白介素-6、白介素-3、干細胞因子、FMS樣酪氨酸激酶3配體、血紅蛋白、成纖維細胞生長因 子。
[000引在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述細胞制劑中，肝素鋼的濃 度為15-20ng/ml，白介素-6的濃度為10-20ng/ml、白介素-3的濃度為10-20ng/ml、干細胞因 子的濃度為30~70ng/ml、FMS樣酪氨酸激酶3配體的濃度為10-150ng/ml、血紅蛋白的質量 分數(shù)為1 %~5 %和成纖維細胞生長因子的濃度為1-lOng/ml。
[0009] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述細胞制劑還包括殼聚糖、 青霉素和鏈霉素。
[0010] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述羊膜間充質干細胞的來源 過程包括W下步驟：
[0011] 無菌環(huán)境下取羊膜，清洗后加入膜酶細胞消化液，水浴處理，離屯、后棄上清，獲得 羊膜上皮細胞;用標準培養(yǎng)基重懸羊膜上皮細胞后進行培養(yǎng)，每周換液1~3次;經膜酶細胞 消化液消化后清洗并濾干，再次消化，離屯、并用所述標準培養(yǎng)基重懸細胞后進行培養(yǎng)，每周 換液1~3次，當細胞融合度達到70% W上時，進行傳代培養(yǎng)。
[0012] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述標準培養(yǎng)基為含有5~ 20 %體積分數(shù)的FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基。
[0013] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述卵巢細胞的來源過程包括 W下步驟：
[0014] 取卵巢組織去除紅細胞，加入膠原酶消化，吹打至組織塊充分溶解，加入培養(yǎng)基A 充分混勻，離屯、棄上清，重懸細胞后過濾，對濾液再次離屯、棄上清，加入培養(yǎng)基B進行培養(yǎng)， 每2~3天換液一次，待細胞融合度至80 % W上時，停止傳代，棄除培養(yǎng)基，清洗細胞，加入膜 酶消化，待細胞變圓變亮后，加入培養(yǎng)基A停止消化，并獲得細胞懸液，離屯、棄上清，重懸細 胞后，加入培養(yǎng)基B進行傳代培養(yǎng)。
[0015] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述培養(yǎng)基A中添加有胎牛血 清、青霉素和鏈霉素。
[0016] 在本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑中，所述培養(yǎng)基B中添加有血清替 代物、非必需氨基酸、谷氨酷胺、e-二硫基乙醇、e-FGFW及青霉素和鏈霉素。
[0017] 實施本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑，可W達到W下有益效果:通過 采用羊膜間充質干細胞結合卵巢細胞共同制成細胞制劑，W及用于防止羊膜間充質干細胞 多向分化和促進羊膜間充質干細胞和卵巢細胞活性和正常生長增殖的輔助性成分，同時， 結合卵巢細胞，使得羊膜間充質干細胞能夠長期維持其干細胞特性，進而通過其分泌的細 胞因子結合卵巢細胞共同作用于卵巢，W達到即時、徹底修復卵巢功能的目的;避免單一細 胞制成的細胞制劑中，細胞性質不穩(wěn)定，造成卵巢功能修復效果不穩(wěn)定，修復效果差，無法 徹底修復卵巢等缺陷。
【具體實施方式】
[0018] 為解決現(xiàn)有技術中采用含有單一細胞的制劑修復卵巢存在修復效果不穩(wěn)定，無法 達到持續(xù)性修復等缺陷，本發(fā)明的創(chuàng)新點在于提供一種含有兩種細胞制成的混合細胞制 劑，不僅能夠提高卵巢修復效率，而且使得修復后的卵巢功能較持久，避免了單一細胞制劑 存在的修復不穩(wěn)定，不徹底等問題，從而實現(xiàn)徹底修復卵巢功能的目的。
[0019] 具體地，本發(fā)明提供的用于修復卵巢功能的細胞制劑，包括羊膜間充質干細胞和 卵巢細胞;且優(yōu)選地，在細胞制劑中，羊膜間充質干細胞的濃度為（1~5) X IO5個/ml,卵巢 細胞的濃度為(4~8) X IO5個/ml。
[0020] 其中，羊膜間充質干細胞具有強大的分泌潛能，能夠分泌大量的趨化因子、細胞生 長與營養(yǎng)類因子、細胞因子受體、血管生成因子、促炎癥反應因子W及抗炎癥反應因子;運 些高分泌的細胞因子間相互作用相互關聯(lián)，形成復雜的關系網絡，其中包括了與卵母細胞 發(fā)育高度相關的HGF化epatoc}fte growth factor,肝細胞生長因子）、抓NF(brain derived neurohophic factor,腦源性神經營養(yǎng)因子）、EGF化pidermal Growth Factor,表皮細胞 生長因子）、IGF-l(insulin-like growth factors-1，促生長因子）等，而高表達的細胞因 子在正常情況下參與卵泡的發(fā)生及發(fā)育成熟調控，如HGFJGF-I、SCF、BDNF等，能夠營養(yǎng)支 持卵巢組織抗調亡、促進細胞增殖和更新；促炎因子IL-6(白介素-6)、IL-8(白介素-8)、 TNF-a(Tumor化crosis F'actor，腫瘤壞死因子-a)，抑炎因子]X-l〇(白介素-10)、TNF-0(月中 瘤壞死因子-e)、IL-13(白介素-13)、基質金屬蛋白酶MMPl及抑制劑可能調控卵巢局部血管 再生，改善卵巢血供，從而改善卵巢功能。另外，羊膜間充質干細胞達到卵巢內能夠表達 FSHR基因，并且FSHR能對F細產生反應，從而恢復卵泡的成熟發(fā)育和類固醇激素的生成途 徑;除此之外，羊膜間充質干細胞移植后能夠通過促進卵泡膜細胞和顆粒細胞增殖、抑制調 亡，從而使雌激素合成增加。而雌激素是卵泡發(fā)育所必不可少的，它能夠刺激卵泡發(fā)育，使 原始卵泡發(fā)育到成熟卵泡;并且有助于卵巢積儲膽固醇，通過對下丘腦的正負反饋調節(jié)，控 制腦垂體促性腺激素的分泌，從而間接影響卵巢功能。因此，羊膜間充質干細胞所分泌的細 胞因子能夠改善卵巢局部微環(huán)境，促進細胞增殖、減少細胞調亡，從而達到修復卵巢功能的 目的。
[0021] 進一步地，羊膜間充質干細胞能夠在一定程度上改善血清性激素水平，與其他類 型干細胞相比，具有來源豐富、取材無創(chuàng);為正常丟棄組織，不存在倫理問題;且取自新生組 織，存在環(huán)境和老年化導致的DNA損傷的可能性很小;分離即用，細胞均一性好，不需要建立 細胞庫，細胞量豐富，細胞活力較好、擴增能力穩(wěn)定、無免疫原性、無致瘤性等優(yōu)點，更加適 合移植治療。
[0022] 而分離純化后的卵泡膜細胞或卵泡顆粒細胞存活期較短，細胞易死亡，而由卵泡 膜細胞、卵泡顆粒細胞和卵巢間質細胞等共同混合的卵巢細胞則能夠保證卵泡膜細胞和卵 泡顆粒細胞的相互作用，并能夠接受下丘腦-垂體分泌激素的調節(jié)和細胞因子的作用，而卵 巢間質細胞可W不斷分化補充形成具有分泌功能的卵泡膜細胞和卵泡顆粒細胞，使得移植 后的卵巢細胞具有分泌性激素的功能，起到即時修復卵巢功能的作用。
[0023] 由于干細胞易分化及遺傳穩(wěn)定性相對較差等特性，因此本發(fā)明將羊膜間充質干細 胞與卵巢細胞混合，通過卵巢細胞的旁分泌及近分泌進而影響羊膜間充質干細胞，W防止 羊膜間充質干細胞的多向分化及突變的發(fā)生，從而能夠維持羊膜間充質干細胞對卵巢修復 所起的作用，進而延長細胞制劑的有效期，并使得羊膜間充質干細胞實現(xiàn)長期穩(wěn)定修復卵 巢功能的目的；而卵巢細胞不僅可抑制羊膜間充質干細胞的多向分化，而且能夠促進卵巢 功能的修復，從而能夠實現(xiàn)最大限度地修復卵巢功能的目的。優(yōu)選地，羊膜間充質干細胞的 濃度為2 X IO5個/ml，卵巢細胞的濃度為6 X IO5個/ml。
[0024] 進一步地，本發(fā)明中羊膜間充質干細胞的來源過程，包括W下步驟：
[00巧]Sla、獲取羊膜；
[00%] S2a、分離獲得羊膜上皮細胞；
[0027] S