在特定范圍內(nèi)隨著環(huán)境中的氧含量的變化為細(xì)胞提 供所需的氧濃度，W維持細(xì)胞正常生長及活性。優(yōu)選地，在細(xì)胞制劑中，血紅蛋白的質(zhì)量分 數(shù)為1 %~5 %。
[0054] 成纖維細(xì)胞生長因子不僅能促進(jìn)羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，而且能夠促進(jìn)其細(xì)胞 體積的增大。優(yōu)選地，在細(xì)胞制劑中，成纖維細(xì)胞生長因子的濃度為1-lOng/ml。
[0055] 因此，輔助性成分的添加不僅能夠避免細(xì)胞制劑凝固、沉淀等問題，而且能夠維持 細(xì)胞制劑內(nèi)的氧氣含量，并維持細(xì)胞正常的生長增殖及細(xì)胞活性，同時能夠阻止羊膜間充 質(zhì)干細(xì)胞的定向分化，保持其干細(xì)胞特性，從而使得羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞能夠起到修復(fù)卵巢 細(xì)胞的作用。
[0056] 進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的用于修復(fù)卵巢功能的細(xì)胞制劑還包括殼聚糖、青霉素和 鏈霉素。
[0057] 由于殼聚糖分子的正電荷和細(xì)菌細(xì)胞膜上負(fù)電荷的相互作用，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶 和其他成分泄露，從而達(dá)到抗菌、殺菌的作用，具有較好的抗菌活性，能夠抑制一些真菌、細(xì) 菌和病毒的生長繁殖。優(yōu)選地，細(xì)胞制劑中，殼聚糖的濃度為5~20ng/ml。
[0058] 青霉素能夠阻礙細(xì)菌的細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致細(xì)胞泄漏死亡，從而抑制細(xì)菌的生長;鏈 霉素能夠作用于細(xì)菌的核糖體，阻礙蛋白翻譯，從而抑制細(xì)菌生長；自然環(huán)境下，不考慮人 為產(chǎn)生的抗藥性，對青霉素不敏感的絕大多數(shù)微生物對鏈霉素敏感，反之亦然；因此，最為 優(yōu)選地是將青霉素和鏈霉素搭配使用能夠控制幾乎全部常見的細(xì)菌，從而能夠盡量避免細(xì) 菌對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長及活性造成的不良影響。優(yōu)選地，細(xì)胞制劑中，青霉素的濃度 為100000~300000單位/ml,鏈霉素的濃度為100000~300000單位/ml。
[0059] 因此，采用殼聚糖結(jié)合青霉素和鏈霉素，不僅可W達(dá)到直接殺菌的目的，而且可阻 止處于分裂期的細(xì)菌生長，從而達(dá)到徹底殺菌的目的。
[0060] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合具體實(shí)施例，對本 發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用 于限定本發(fā)明。
[0061] 實(shí)施例1
[0062] 本發(fā)明提供的用于修復(fù)卵巢功能的細(xì)胞制劑，包括W下成分;且細(xì)胞制劑中，各成 分濃度如下：
[0063] 羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞2 X IO5個/ml;
[0064] 卵巢細(xì)胞6X IO5個/ml;
[0065] 15ng/ml 肝納素；
[0066] 15ng/ml 白介素-6;
[0067] 15ng/ml 白介素-3;
[0068] 50ng/ml干細(xì)胞生長因子；
[0069] 50ng/ml FMS樣酪氨酸激酶3配體；
[0070] 5 %血紅蛋白生理鹽水注射液；
[0071] 5ng/ml成纖維細(xì)胞生長因子；
[0072] lOng/ml 殼聚糖；
[0073] 200000單位/ml青霉素，體積20]il;
[0074] 200000單位/ml鏈霉素，體積20iU。
[0075] 其中，羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的來源過程包括W下步驟：
[0076] Sla、獲取羊膜；
[0077] Slla、經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，簽署知情同意書后，無菌環(huán)境下收取正常足月、單 純臀位因素的破宮產(chǎn)、產(chǎn)婦自愿放棄并捐獻(xiàn)科研的廢棄胎盤。將胎盤取下后浸在胎盤保存 液中，維持在2~8 °C ;其中，胎盤保存液中包括DMEM/F12、0.5 %的血清替代物、50000 lU/ml 頭抱氨卡、80000U/ml慶大霉素、30ug/ml兩性霉素 B，用NaHC〇3調(diào)整pH值為7.0~7.2;
[0078] S12a、將步驟Slla中保存的胎盤從胎盤保存液中取出，并置于無菌環(huán)境中，用酒精 順時針重復(fù)3次擦拭消毒，從胎盤上W廝帶為中屯、剝離羊膜組織；
[0079] Sl 3a、將步驟Sl 2a中獲得的羊膜組織剪成2mm3小塊。
[0080] S2a、分離獲得羊膜上皮細(xì)胞；
[0081 ] 取步驟Sl 3a中剪碎的羊膜組織，加入0.05 %化yps in/抓TA溶液，于37 °C水浴鍋處 理1個小時，劇烈震蕩20分鐘W分離羊膜上皮細(xì)胞，收集消化液和洗涂液，于4°C下，200g，離 屯、5分鐘后棄上清，收獲細(xì)胞沉淀物，即羊膜上皮細(xì)胞，用添加有體積分?jǐn)?shù)為10 %的FBS和雙 抗的高糖DMM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀物，細(xì)胞計(jì)數(shù)后按IX IOVcm2接種細(xì)胞，用添加有10% FBS和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)羊膜上皮細(xì)胞，每周換液2次。
[0082] S3a、膜酶消化細(xì)胞；
[0083] 取步驟2a獲得的羊膜上皮細(xì)胞經(jīng)膜酶細(xì)胞消化液消化后，用皿SS平衡鹽溶液充分 清洗后濾干，再用等體積的0.2%的I型膠原酶消化后，200g離屯、5分鐘，用皿SS平衡鹽溶液 重復(fù)清洗一次后棄上清，用少量添加有體積分?jǐn)?shù)為10%FBS(fetal bovine serum胎牛血 清)和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀物，即收獲羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0084] 其中，HBSS平衡鹽溶液的抑為7.2，其中包括:8邑/1的化(：1，0.4邑/1的1((：1，1邑/1的葡 萄糖，60mg/L 的 KH2PO4，47.5mg/L 的 Na2HP〇4。
[0085] S4a、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)；
[0086] 取步驟S3a中獲得的羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)，按IX IO5個/cm2接種細(xì)胞，并 用添加有體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS(fetal bovine serum胎牛血清)和雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基 培養(yǎng)，每周換液2次，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%時，按1:4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，收獲第=代羊膜 間充質(zhì)干細(xì)胞用于制備細(xì)胞制劑。
[0087] 進(jìn)一步地，在本實(shí)施例中，卵巢細(xì)胞的來源過程，包括W下步驟：
[0088] S化、獲取卵巢組織，并用膜酶消化；
[0089] 收集因非卵巢癌因素切除的全子宮及雙附件患者的卵巢組織，將卵巢組織標(biāo)本置 于培養(yǎng)皿中、無菌環(huán)境下，去除脂肪組織，采用PBS沖洗組織3次，去除紅細(xì)胞;充分剪碎卵巢 組織至糊狀，將3倍卵巢組織體積的膠原酶加入培養(yǎng)皿中，吹打并轉(zhuǎn)移至離屯、管中，放入37 °C培養(yǎng)箱中，消化30分鐘，每隔10分鐘充分吹打，直至組織塊溶解，消化液變渾濁。
[0090] S2b、對步驟S化中獲得的細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0091] 向步驟Slb中獲得的含有卵巢細(xì)胞的消化液中加入等量的培養(yǎng)基A充分混勻，W 150化/min離屯、5min，棄上清，加入適量PBS重懸細(xì)胞2次，用200目濾網(wǎng)過濾，離屯、后加入2-4ml的培養(yǎng)基B于37 °C、0.5 % C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞融合度至80 % W上時，停 止傳代。
[0092] 其中，培養(yǎng)基A為含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和1 %青霉素和鏈霉素的DMEM培 養(yǎng)基；培養(yǎng)基B為添加有20%Knockout Serum Replacements%非必需氨基酸、1%谷氨酷 胺、1%0-二硫基乙醇、4ng/ml的bFGFW及1%青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。
[0093] S3b、對步驟S2b中傳代后獲得的細(xì)胞再次消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；
[0094] 棄除步驟S2b中的培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，加入0.25 %膜酶覆蓋培養(yǎng)皿底，并置于 37°C培養(yǎng)箱中，間隔2分鐘鏡下觀察消化情況，待大部分貼壁細(xì)胞變圓變量，加入等量的培 養(yǎng)基A終止消化，用吸管反復(fù)輕柔吹打培養(yǎng)皿底，制成單細(xì)胞懸液，W1500r/min離屯、5min， 棄上清，加入適量PBS溶液重懸細(xì)胞2次，加入適量培養(yǎng)基B液，按1: 2的比例傳代，于37 °C、 0.5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，隔天換液，獲取對數(shù)生長期的卵巢細(xì)胞用于細(xì)胞制劑的 制備。
[00巧]實(shí)施例2
[0096] 本實(shí)施例提供的用于修復(fù)卵巢功能的細(xì)胞制劑，包括W下成分，且各成分在細(xì)胞 制劑中的濃度如下：
[0097] 羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞1 X IO5個/ml;
[009引卵巢細(xì)胞4X IO5個/ml;
[0099] 15ng/ml 肝納素；
[0100] lOng/ml 白介素-6;
[0101] lOng/ml 白介素-3;
[0102] 30ng/ml干細(xì)胞生長因子；
[0103] lOng/ml FMS樣酪氨酸激酶3配體；
[0104] 1 %血紅蛋白生理鹽水注射液；
[0105] Ing/ml成纖維細(xì)胞生長因子；
[0106] 5ng/ml 殼聚糖；
[0107] 100000單位/ml青霉素，體積lOul;
[010引 100000單位/ml鏈霉素，體積IOiil。
[0109] 其中，羊膜間充質(zhì)干