。小鼠血液 中的毒性研究顯示在24小時內(nèi)，相比于游離順鉑群組（瘤內(nèi)和靜脈內(nèi)兩者），腫瘤內(nèi)納米粒 子群組的血流中存在極少量的化學(xué)藥物，表明遞送系統(tǒng)的毒性減到最小。
[0181] B. HCPCl 腫瘤
[0182] 材料和方法
[0183] 將71_80g的金敘利亞（Syrian)倉鼠麻醉并且準備植入腫瘤細胞。從培養(yǎng)物收集 倉鼠頰囊癌瘤（HCPCl)細胞，接著將懸浮于PBS緩沖液中的IX IO8個細胞皮下注入倉鼠的 頰囊中。7天后，當(dāng)腫瘤尺寸達到約IOOmm3時，將倉鼠分成4個群組，使重量和腫瘤尺寸差 異減到最小。
[0184] 通過腹膜內(nèi)注射游離順鉑和局部放入納米粒子嵌入海綿（I. 15mg/kg順鉑等效 物）來處理攜帶腫瘤的倉鼠。以3天間隔投與兩種劑量。處理后，嚴密監(jiān)測動物，并且在不 知道每個動物接受哪種注射的情況下每隔一定間隔使用卡尺對每個動物進行腫瘤尺寸和 體重的測量。根據(jù)公式（長度）X (寬度）2/2計算每個時間點的腫瘤體積，其中長軸是長 度，短軸是寬度。用CIS-NP嵌入海綿局部處理和游離順鉑腹膜內(nèi)處理的HCPCl同種異體移 植倉鼠的腫瘤抑制和重量改變百分比。
[0185] 結(jié)果
[0186] 圖9A和9B中示出的結(jié)果表明，兩種處理獲得腫瘤尺寸的可比減小，但在納米粒子 的情況下重量損失顯著較小，表明在相同功效的情況下較大的安全性。
[0187] 實例9 :合成PEG結(jié)合殼聚糖和PEG化殼聚糖納米粒子
[0188] 材料和方法
[0189] 如下文所描述合成PEG結(jié)合殼聚糖。制備含有0. 1 % w/v殼聚糖的5mL乙酸溶 液（0. 175% v/v)，并且使用IM NaOH將pH調(diào)節(jié)到6。隨后，在室溫下在磁性攪拌下將5mg NHS-PEG-C00H添加到殼聚糖溶液中持續(xù)3小時。接著將混合物調(diào)節(jié)到pH 7。在氬氣氛圍 下進行反應(yīng)過夜。接著凍干所得溶液以產(chǎn)生PEG結(jié)合殼聚糖。
[0190] 為了評估結(jié)合到PEG的殼聚糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，獲得偏光傅立葉變換紅外（FTIR)光譜 以便表征。PEG-NHS中酯-C = 0特有的1713cm-l下峰值在PEG-殼聚糖的FT-IR光譜中 消失，這是因為酯鍵轉(zhuǎn)化成PEG-殼聚糖中的酰胺鍵。另外，在~1466cm-l、~1657cm-l、 ~3365cm-l下的峰值的強度增加，這歸因于殼聚糖與PEG的交鍵中的酰胺鍵形式。結(jié)果顯 示PEG與殼聚糖的成功結(jié)合。
[0191] PEG化殼聚糖納米粒子由如下文所描述的PEG結(jié)合殼聚糖制備。簡單來說，在劇烈 攪拌的同時將5mL三聚磷酸鹽（TPP)溶液添加到含有0. 1% w/v PEG-殼聚糖的IOmL乙酸 溶液（〇. 175% v/v)中。在室溫下連續(xù)攪拌混合物10分鐘，產(chǎn)生PEG化CHI-NP。
[0192] 實例10 :在大規(guī)模下NP的最佳化
[0193] 過程自動化是工業(yè)生產(chǎn)不可或缺的一部分，因為其通過消除批次間變化和人類誤 差來實現(xiàn)更快并且更便宜的制造和產(chǎn)品特性標準化。尤其在納米技術(shù)應(yīng)用中是必需的，在 所述應(yīng)用中，產(chǎn)品特性必須保持在非常有限的公差內(nèi)。
[0194] 自動化NP合成的材料和方法：
[0195] 所有所使用的試劑和化學(xué)物質(zhì)都是賦形劑或醫(yī)藥級的。
[0196] 溶液A :溶液A :含0. 1 %順鉑的0. 1 %三聚磷酸鹽（TPP)溶液
[0197] 溶液B :含0. 1 %殼聚糖（CL113)的0. 175%乙酸溶液
[0198] 將IOmL溶液B放置在玻璃燒杯中并且在磁性攪拌器上以600rpm攪拌。借助于懦 動栗或可以提供恒定流速（如本文所使用，以I. 5mL/min)的任何其它栗將總計IOmL溶液 A逐滴轉(zhuǎn)移到攪拌溶液B上，但其可以改變以產(chǎn)生不同尺寸、電荷、多分散性、NP產(chǎn)率以及藥 物囊封效率特性。
[0199] 使用從1:1 (如在以上情況下）到1.1:0.85的不同比率的溶液A與溶液B (A:B)。 不同混合比率產(chǎn)生不同NP特性。在已轉(zhuǎn)移一半溶液A時將溶液B的攪拌速度逐漸提高到 650rpm。當(dāng)溶液A的轉(zhuǎn)移完成時，將攪拌速度逐漸提高到700rpm，并且接著將二糖海藻糖逐 漸添加到溶液中以獲得2%的最終海藻糖濃度。繼續(xù)攪拌直到所有添加的海藻糖溶解（或 持續(xù)至少10分鐘）以平衡溶液。
[0200] 測量Z平均值、多分散指數(shù)（PdI)、每個峰值的平均直徑以及所得NP的NP產(chǎn)率（計 數(shù)率）。
[0201] 根據(jù)所需最終產(chǎn)物，遵循以下步驟中的任一個。
[0202] 對于儲存，將最終NP溶液放置在恰當(dāng)容器中并且在干冰中或在超低溫冷凍器中 使用液氮冷凍直到所得全部冷凍，并且接著將其凍干直到所得溶劑全部消除。
[0203] 為了放置在載體晶片（凱莫辛（ChemoThin)晶片或CTW)中，接著放入最終NP溶 液中，在攪拌下逐漸添加含2mL 1 %殼聚糖Gl 13溶液的1 %乙酸（或1 %檸檬酸），并且混 合物保持攪拌10分鐘。接著將這一混合物放置在恰當(dāng)容器中并且凍干。如果溶液A與溶 液B的比率不同于1: 1，那么必須調(diào)節(jié)待添加的G113殼聚糖量以使得其體積是總NP溶液的 10%〇
[0204] 可擴展性為大批量生產(chǎn)所必需。藥物運載納米粒子通過自組裝形成于溶液環(huán)境 中，其是僅在適當(dāng)化學(xué)條件下發(fā)生的動態(tài)過程。這一技術(shù)對制造變量極其敏感，所述變量包 括后續(xù)溶液的混合速率和其濃度、新鮮度以及純度。后續(xù)溶液的混合速率無法在不犧牲納 米粒子特性的情況下提高到大于某一值。此外，歸因于自組裝的動態(tài)性質(zhì)，混合過程必須在 有限時間內(nèi)完成，因為這一持續(xù)時間的任何延遲都會提高納米粒子特性或產(chǎn)率相比于最佳 值有偏差的可能性。自組裝生產(chǎn)方法的敏感性質(zhì)迫使采用嚴格控制的分批型制造工藝并且 不允許每批次較高生產(chǎn)體積。通過使用小組研發(fā)的自動化系統(tǒng)，我們已成功地將初始人工 納米粒子生產(chǎn)工藝調(diào)適成自動化版本，并且其現(xiàn)在可以嚴格地控制所得納米粒子的特性， 包括尺寸、多分散性以及囊封效率。這些參數(shù)在藥物遞送系統(tǒng)的功效以及原料成本方面至 關(guān)重要?？梢哉{(diào)節(jié)參數(shù)獲得最大批料體積與納米粒子產(chǎn)率（特定生產(chǎn)批次中形成的納米粒 子的數(shù)量）之間的平衡，同時保持納米粒子特性在較窄公差內(nèi)。發(fā)現(xiàn)所得納米粒子的多分 散性完全在可接受的范圍內(nèi)。初始結(jié)果證明，在不犧牲納米粒子特性或產(chǎn)率的情況下可以 獲得至多70mL的批料體積。此外，有可能并行進行這些成批生產(chǎn)過程以加快生產(chǎn)速度。
[0205] 納米粒子調(diào)配物的穩(wěn)定性是必需的。納米粒子調(diào)配物的穩(wěn)定性測試顯示，在不會 降低介質(zhì)中的納米粒子產(chǎn)率的情況下，從生產(chǎn)開始其在生產(chǎn)介質(zhì)中穩(wěn)定長達3小時。此外， 有可能在無任何產(chǎn)率下降的情況下通過將天然二糖海藻糖添加到生產(chǎn)介質(zhì)中將此延長到 至少長達4小時。
[0206] 所述方法涉及冷凍干燥步驟。當(dāng)設(shè)計所述過程后的NP穩(wěn)定性時，這可能是一個顧 慮。為了證明NP在冷凍干燥之后保持類似結(jié)構(gòu)和特性，將冷凍干燥后獲得的NP的粉末形 式再懸浮于不同pH中。30分鐘后，通過澤塔塞澤測量不同pH溶液下NP的尺寸。NP尺寸 增加百分比計算如下：（不同pH中的NP尺寸減去冷凍干燥前的NP尺寸）八冷凍干燥前的 NP 尺寸）X 100。
[0207] NP溶液的純化，即，去除所有過量化合物，如TPP和游離順鉑。在使用30K帕爾納 米賽普過濾裝置（PALL Nanosep Filtration Device)的小規(guī)模工藝中，其被證明是成功 的。去除大于90%的過量組分并且產(chǎn)生高度純化的NP產(chǎn)品。至于大規(guī)模純化，所述小組 與帕爾生命科學(xué)（PALL Life Science) -起研究小型（Minimate)TFF(切向流過濾）系統(tǒng)。 結(jié)果顯示在1小時內(nèi)從100mL中去除過量游離化合物。
[0208] 實例11.含有NP的順鉑的負載能力和細胞攝取
[0209] 材料和方法
[0210] NP的調(diào)配物已經(jīng)最佳化以獲得較佳載藥能力和囊封效率。通過ICP-AES測定囊封 效率（EE%)。簡單來說，400uL NP使用帕爾納米賽普30K過濾器（1100rcf，8分鐘，25°C) 離心。離心后，收集底部溶液（對應(yīng)于游離順鉑）和頂部溶液（對應(yīng)于NP)，并且在以1/100 稀釋于2 %硝酸中之后通過ICP-AES測量這些溶液中的Pt量。使用下式計算EE% :
[0211] 100_(Pt 底留物（mg) X 100/Pt 總理論值（mg))
[0212] 在52uM下用FITC標記的NP處理TR-146細胞30分鐘，并且通過流動式細胞測量 術(shù)測量NP的細胞攝取。
[0213] 結(jié)果
[0214] 結(jié)果表明30%的負載能力伴隨81 %的囊封效率。
[0215] 結(jié)果顯示約75%的NP被細胞攝取，如圖10中所示。
[0216] 實例12.殼聚糖的改性
[0217] 為了增加對殼聚糖納米粒子的細胞攝取機制以及這些NP在胞內(nèi)區(qū)室中的運輸?shù)?理解，用各種熒光團合成殼聚糖聚合物。經(jīng)由殼聚糖聚合物上的胺基，經(jīng)由酯化學(xué)作用結(jié)合 熒光團（FITC，阿萊克薩（Alexa))(圖11)。因為殼聚糖聚合物的胺基在納米粒子調(diào)配和藥 物囊封方面起主要作用，所以用熒光團使僅約5%的胺基官能化。殼聚糖聚合物還用硫醇基 官能化以改良粘膜粘附特性。使用2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷（圖12)。不同于殼聚糖熒光團， 通過使用2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷，正電荷保留在聚合物上，并且引入硫醇端基。
[0218] 熒光素鈉鹽（FITC)、2_亞氨基硫雜環(huán)戊烷HCL以及N-(3-二甲基氨基丙 基）-Ν' -乙基碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)購自西格瑪-阿爾德里奇（Sigma-Aldrich)。阿萊 克薩nuor.t. 647羧酸、琥珀酰亞胺酯（阿萊克薩647)購自生命技術(shù)。
[0219] 合成殼聚糖-FITC結(jié)合物：將25mg殼聚糖溶解于25ml乙酸水溶液（0. 175%，v/ v)中，并且用IM NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)到6。向這一溶液中添加 Img含熒光素鈉鹽的乙醇 (10mg/ml)和21mg EDC，并且在室溫下攪拌12小時。12小時后，用去礦物質(zhì)水滲析反應(yīng)混 合物2天，并且冷凍干燥獲得所需殼聚糖-FITC結(jié)合物。
[0220] 合成殼聚糖-阿萊克薩結(jié)合物：將25mg殼聚糖溶解于25ml乙酸水溶液（0. 175%， v/v)中，并且用IM NaOH將溶液pH調(diào)節(jié)到6。向這一溶液中添加50ul含阿萊克薩647的 DMS0(lmg/ml)和21mg EDC，并且在室溫下攪拌12小時。12小時后，用去礦物質(zhì)水滲析反應(yīng) 混合物2天，并且冷凍干燥獲得所需殼聚糖-阿萊克薩結(jié)合物。
[0221] 合成硫醇化殼聚糖：將50mg殼聚糖溶解于5ml 1 %乙酸中，并且用IM NaOH將溶 液PH調(diào)節(jié)到6。向這一溶液中添加20mg 2-亞氨基硫雜環(huán)戊烷HC1，并且在室溫下攪拌反 應(yīng)混合物24小時。反應(yīng)完成后，反應(yīng)混合物用5mM HCl滲析，用含有1% NaCl的5mM HC1、 5mM HCl滲析兩次，并且最后用0. 4mM HCl滲析。透析后，冷凍干燥反應(yīng)混合物以獲得固體 硫醇改性的殼聚糖。
[0222] 實例13 :以高通量方式加速合成NP嵌入晶片
[0223] 使用各種凍干形式進行實驗，并且發(fā)現(xiàn)最佳一個是12孔盤。
[0224] 材料和方法
[0225] 試劑：晶片溶液、液氮、12孔盤、凍干器。
[0226] 方案：通過離子膠凝方法，通過將順鉑逐滴添加到殼聚糖溶液中首先合成順鉑囊 封NP。接著攪拌混合物10分鐘。攪拌工藝后，接著將含谷氨酸殼聚糖（