劇烈攪拌的同時(shí)將以0. 1% w/v于純化水中的5mL 三聚磷酸鹽（TPP)溶液添加到含有0. 1% w/v殼聚糖的IOmL乙酸溶液（0. 175% v/v)中。 在室溫下連續(xù)攪拌混合物10分鐘，產(chǎn)生含有113nm NP的殼聚糖納米粒子（CHI-NP)溶液。
[0124] 順鉑負(fù)載納米粒子制備如下。在劇烈攪拌的同時(shí)將含有不同量順鉑（0.1_5mg) 的5mL 0. 1 % w/v三聚磷酸鹽（TPP)溶液添加到含有0. 1 % w/v殼聚糖的IOmL乙酸溶液 (0. 175% v/v)中。在室溫下連續(xù)攪拌混合物10分鐘，產(chǎn)生具有不同順鉑負(fù)載量的順鉑囊 封CHI-NP的集合。
[0125] 通過(guò)ICP-AES(電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜學(xué)）對(duì)順鉑負(fù)載納米粒子中的順 鉑量進(jìn)行定量，并且計(jì)算負(fù)載效率。
[0126] 對(duì)于穩(wěn)定性測(cè)試，合成順鉑囊封納米粒子并且對(duì)于尺寸分布通過(guò)澤塔塞澤納米儀 來(lái)表征。接著將5mL NP溶液添加到IOmL PBS、培養(yǎng)基和水中。所得個(gè)別溶液接著再次表 征。NP溶液的儲(chǔ)存穩(wěn)定性測(cè)試在室溫中3周后進(jìn)行。
[0127] 結(jié)果
[0128] 如上文所描述制備的納米粒子表征并且概述在表4中。
[0129] 表4 :順鉑囊封低分子量殼聚糖納米粒子。
[0131] 使用表4中示出的低分子量研究殼聚糖制備含有不同量順鉑的順鉑負(fù)載納米粒 子。使用低分子量研究級(jí)殼聚糖的PDI和尺寸能控性表現(xiàn)不佳。
[0132] 為了獲得較佳品質(zhì)藥物負(fù)載納米粒子，使用PROTASAN UP3( CL 113 (殼聚糖氯化 物）制備順鉑負(fù)載納米粒子。如上文所描述制備的這些順鉑囊封納米粒子表征并且概述在 表5中。
[0133] 表5 :順鉑囊封PROTASAN? UP CL 113 (殼聚糖氯化物）納米粒子。
[0134] CN 105142619 A I兄明書(shū) 13/22 頁(yè)
[0135] 使用33. 3%順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子獲得最佳調(diào)配物，并且選擇這一調(diào)配物進(jìn)行 其它活體外和活體內(nèi)研究。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，在劇烈攪拌的同時(shí)將以〇. l%w/V含有順鉑（5mg)的 5mL三聚磷酸鹽（TPP)溶液添加到含有0. 1% w/v殼聚糖的IOmL乙酸溶液（0. 175% v/v) 中。在室溫下連續(xù)攪拌混合物10分鐘，產(chǎn)生尺寸為143nm的33. 3%順鉑負(fù)載CHI-NP。
[0136] 通過(guò)ICP-AES(電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜學(xué)）對(duì)表5中示出的順鉑負(fù)載納 米粒子中的順鉑量進(jìn)行定量，并且負(fù)載效率顯示于表6中。針對(duì)囊封效率繪制的負(fù)載效率 顯示于圖2中。
[0137] 表6 :通過(guò)ICP-AES對(duì)順鉑負(fù)載納米粒子中的順鉑進(jìn)行定量。
[0139] 如表7中所示，通過(guò)在第0天和第21天測(cè)量順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子的直徑、PDI 以及ζ電位，來(lái)測(cè)定由表5中的PROTASAN? UP CL 113制備的順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子的 穩(wěn)定性。
[0140] 表7.順鉬負(fù)載納米粒子穩(wěn)定性
CN 105142619 A 說(shuō)明書(shū) 14/22 頁(yè)
[0142] 數(shù)據(jù)顯示納米粒子穩(wěn)定長(zhǎng)達(dá)三周。
[0143] 實(shí)例3 :pH對(duì)順鉬囊封殼聚糖納米粒子特性的影響
[0144] 材料和方法
[0145] 使用澤塔塞澤（納米ZS，英國(guó)馬爾文儀器公司）研究pH對(duì)上文所提到的33. 3% 順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子的尺寸和ζ電位的影響。用〇. IM氫氧化鈉溶液（NaOH)在持續(xù) 攪拌下在一定pH范圍內(nèi)（3. 7-8)滴定納米粒子（12mL)的水性分散液。將經(jīng)滴定的分散液 轉(zhuǎn)移到毛細(xì)管測(cè)量池中以便澤塔塞澤測(cè)量。測(cè)量出納米粒子的特性（尺寸和電荷兩種）隨 pH變化而改變。
[0146] 材料和方法
[0147] 在3. 7-8. OpH范圍內(nèi)，納米粒子的ζ電位變化顯示于圖3中（以黑色表示）。在 較低PH下交聯(lián)殼聚糖的較高表面正電荷密度歸因于殼聚糖的表面游離胺基。隨著納米粒 子懸浮液PH提高，較大比例胺基被去質(zhì)子化，導(dǎo)致粒子所測(cè)量的正ζ電位下降。
[0148] pH對(duì)納米粒子尺寸的影響顯示于圖3中。在3. 7-5的pH范圍下，平均納米粒子 尺寸為常數(shù)。酸性介質(zhì)中的殼聚糖的正電荷產(chǎn)生納米粒子之間的排斥力。然而，隨著PH提 高，平均測(cè)量粒徑提高，表明納米粒子膨脹并且聚集。納米粒子膨脹導(dǎo)致藥物在PH 6或更 高pH下釋放，其使得順鉬負(fù)載殼聚糖納米粒子成為pH敏感性藥物釋放系統(tǒng)。
[0149] 實(shí)例4 :在pH = 6下順鉬囊封殼聚糖納米粒子的活體外模擬藥物釋放研究。
[0150] 材料和方法
[0151] 對(duì)33 %順鉬負(fù)載殼聚糖納米粒子進(jìn)行活體外藥物釋放研究。3mL納米粒子溶液用 pH 6緩沖液進(jìn)行透析。旋轉(zhuǎn)速度固定在IOOrpm下。在特定時(shí)間間隔（10分鐘、30分鐘、1 小時(shí)、1. 5小時(shí)、2小時(shí)以及24小時(shí)）取出各5ml的樣品。收集樣品并且通過(guò)ICP-AES對(duì)順 鉑濃度進(jìn)行定量。
[0152] 結(jié)果
[0153] 計(jì)算順鉑從納米粒子釋放的百分比并且概述在圖4中。在24小時(shí)之后，大致60% 順鉑從納米粒子釋放。
[0154] 實(shí)例5 :制備嵌入有順鉑囊封殼聚糖納米粒子的殼聚糖海綿
[0155] 材料和方法
[0156] 將含有1 %殼聚糖w/v的0. 6mL 1 % w/v檸檬酸添加到16mL CHI-NP或順鉑負(fù)載 的CHI-NP(16:6w/W NP和殼聚糖）中。在-80°C下冷凍所得溶液并且凍干2天以獲得納米 粒子嵌入海綿。檸檬酸用作滲透增強(qiáng)劑以及味道掩蔽劑。
[0157] 為了理解來(lái)自海綿樣基質(zhì)的納米粒子的釋放曲線，合成FITC標(biāo)記的納米粒子。簡(jiǎn) 單來(lái)說(shuō)，將25mg殼聚糖溶解于25ml(. 175%，v/v)乙酸水溶液中，并且用IM NaOH將pH值調(diào) 節(jié)到6. 0。將一毫克熒光素鈉鹽溶解于100 μ 1乙醇中并且添加到殼聚糖溶液中。為了催化 形成酰胺鍵，添加 EDAC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽]以達(dá)到0. 05Μ 的最終濃度。在暗處在室溫下培育反應(yīng)混合物12小時(shí)伴隨著持久攪拌。通過(guò)用去礦物質(zhì) 水進(jìn)行透析（纖維素透析導(dǎo)管，孔徑12, 400Da;無(wú)縫）來(lái)分離所得FITC結(jié)合殼聚糖。通過(guò) 紅外光譜學(xué)（IR)和分光熒光法，使用未改性的殼聚糖和熒光素作為對(duì)照進(jìn)行衍生化方法 的評(píng)估。
[0158] 接著通過(guò)以下相同方案，使用FITC結(jié)合殼聚糖獲得FITC標(biāo)記的納米粒子。接著 將FITC標(biāo)記的納米粒子嵌入如上文所描述的海綿中。將海綿放置于ImL PBS中并且在各 個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集溶液。通過(guò)測(cè)量所收集的溶液的熒光強(qiáng)度，隨時(shí)間推移測(cè)量來(lái)自殼聚糖海綿 的納米粒子的釋放曲線。
[0159] 制備FITC標(biāo)記的順鉑囊封納米粒子嵌入海綿，并且將其放置于具有兩種pH條件 (即，pH 5. 5和pH 7)的6孔盤(pán)中。來(lái)自海綿的納米粒子的釋放通過(guò)其在不同時(shí)間點(diǎn)的熒 光強(qiáng)度使用盤(pán)讀數(shù)器來(lái)測(cè)量。
[0160] 結(jié)果
[0161] 從海綿釋放的納米粒子隨時(shí)間推移而增加，如圖5所示。在大致20分鐘內(nèi)90%的 納米粒子從海綿釋放。
[0162] 結(jié)果顯示在pH 5. 5下比在pH 7下快的釋放曲線，其指示腫瘤細(xì)胞上我們的優(yōu)選 釋放平臺(tái)（比健康細(xì)胞酸性更強(qiáng)）。
[0163] 實(shí)例6 :使用順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子的細(xì)胞生存力研究
[0164] 材料和方法
[0165] 使用MTT(3-(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物）分析進(jìn)行 33%順鉑負(fù)載納米粒子的細(xì)胞生存力研究。FaDu (HTB-43,來(lái)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection，ATCC))細(xì)胞系是來(lái)源于咽的順鉬敏感性鱗狀癌細(xì) 胞系[臨床癌癥研究10:8005-8017(2004).]，將其用于活體外研究。
[0166] 還使用四唑化合物（3_(4, 5-二甲基噻唑-2-基）-5-(3-羧基甲氧基苯 基）-2-(4-磺基苯基）-2H-四唑內(nèi)鹽MTS進(jìn)行33 %順鉑負(fù)載納米粒子的細(xì)胞生存力研究。 當(dāng)被細(xì)胞并入時(shí)，MTS被代謝活性細(xì)胞生物還原。發(fā)光量與培養(yǎng)物中的活細(xì)胞數(shù)量成正比。
[0167] 在單獨(dú)組的實(shí)驗(yàn)中，在用15%順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子處理24小時(shí)后，使用MTT 分析檢測(cè)KB細(xì)胞（海拉亞系）。
[0168] 為了理解CIS-NP是如何影響順鉑抵抗性細(xì)胞系，進(jìn)行順鉑敏感性卵巢細(xì)胞系 A2670和順鉑抵抗性卵巢細(xì)胞系A(chǔ)2670的細(xì)胞生存力研究。
[0169] 結(jié)果
[0170] 顯示24小時(shí)和48小時(shí)培育后相對(duì)于FaDu細(xì)胞系，如MTT分析所評(píng)定的游離順鉑、 33%順鉑負(fù)載納米粒子以及空白納米粒子的活體外療效的結(jié)果分別顯示于圖6A和6B中。
[0171] 使用MTS分析的48小時(shí)33 %順鉑負(fù)載納米粒子、空白納米粒子或游離順鉑相對(duì)于 HCPC 1 (倉(cāng)鼠頰囊癌瘤）細(xì)胞的細(xì)胞生存力顯示于圖6C中。細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)生50%抑制的濃 度的IC5。值對(duì)于游離順鉑約為0. 06 μ M，對(duì)于空白納米粒子為0. 26 μ M，并且對(duì)于33%順鉑 負(fù)載納米粒子大致為2. 3ηΜ。
[0172] 圖7A和圖7B顯示單獨(dú)組實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，其中在用15%順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子處 理24小時(shí)（圖7A)和72小時(shí)（圖7B)后，使用MTT分析檢測(cè)KB細(xì)胞（海拉亞系）。所述 結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子的療效。此外，還已研究了人類(lèi)口腔表皮的KB 細(xì)胞系、其它類(lèi)型的細(xì)胞系（例如3T3 :小鼠成纖維細(xì)胞；A431 :皮膚癌瘤）。
[0173] 具有順鉑敏感性和不敏感性細(xì)胞系的研究顯示比敏感性細(xì)胞系的游離CIS低得 多的CIS-NP的IC5。;然而，在CIS-NP與抵抗性細(xì)胞系的游離CIS群組之間差異并不顯著。 盡管通過(guò)使用高濃度藥物可以破壞抵抗性細(xì)胞系兩個(gè)群組中的細(xì)胞，但在活體內(nèi)情況下對(duì) 于游離CIS存在劑量限制性毒性問(wèn)題。
[0174] 實(shí)例8 :使用順鉑負(fù)載殼聚糖納米粒子的活體內(nèi)小鼠研究
[0175] A. FaDu 腫瘤
[0176] 材料和方法
[0177] 將4-5周大的裸小鼠麻醉、刮毛并且準(zhǔn)備植入腫瘤細(xì)胞。從培養(yǎng)物收集FaDu細(xì) 胞，并且接著將懸浮于1:1PBS緩沖液與基質(zhì)膠的混合物中的3X105個(gè)細(xì)胞皮下注入小鼠 背部。21天后，當(dāng)腫瘤尺寸達(dá)到大致150_3時(shí)，將小鼠分成3個(gè)群組，每個(gè)群組五個(gè)小鼠， 使重量和腫瘤尺寸差異減到最小。通過(guò)皮下注射PBS、順鉑負(fù)載納米粒子或無(wú)藥物殼聚糖納 米粒子（1.15mg/kg順鉑等效物）來(lái)處理攜帶腫瘤的小鼠。以3天的間隔，即，分別在第21 天、第24天、第27天以及第30天投與兩種劑量。注射后，嚴(yán)密監(jiān)測(cè)動(dòng)物，并且在不知道每 個(gè)動(dòng)物接受哪種注射的情況下每隔一定間隔使用卡尺對(duì)每個(gè)動(dòng)物進(jìn)行腫瘤尺寸和體重的 測(cè)量。根據(jù)公式（長(zhǎng)度）X (寬度）2/2計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腫瘤體積，其中長(zhǎng)軸是長(zhǎng)度，短軸 是寬度。
[0178] 結(jié)果
[0179] 針對(duì)每個(gè)群組制備的中位腫瘤生長(zhǎng)曲線描繪了隨時(shí)間變化的中位腫瘤尺寸（圖 7)。結(jié)果表明順鉑負(fù)載納米粒子減小腫瘤尺寸。
[0180] 在處理終點(diǎn)（三周）收集三個(gè)群組（腫瘤內(nèi)CIS-NP、腫瘤內(nèi)游離順鉑以及靜脈內(nèi) 游離順鉑）的腫瘤組織，并且使用ICP-MS進(jìn)行分析。結(jié)果顯示用納米粒子處理的群組相較 于其它兩個(gè)群組，在腫瘤中具有最多的藥物積聚，即，腫瘤內(nèi)和靜脈內(nèi)游離順鉑）