糖和BSA的使用可模擬細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)及生物活性物質(zhì)等，實現(xiàn)仿生控 釋，應(yīng)用于體內(nèi)后可有效刺激細(xì)胞增殖，分化。
[0033] EP管中500 μ 1液體可將膜材料完全浸泡又不至因子浪費。
【附圖說明】
[0034] 圖1本發(fā)明膜材料負(fù)載因子前后對比照片；
[0035] 圖2本發(fā)明膜材料的體外釋藥曲線；
[0036] 圖3本發(fā)明膜材料應(yīng)用于顱骨缺損區(qū)域micro ct掃描結(jié)果及新生骨情況；
[0037] 圖4⑶34-/⑶90+免疫熒光雙染示bFGF對干細(xì)胞募集作用圖；
[0038] 圖5 ALP免疫組化染色示ADM+bFGF組陽性表達(dá)圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面結(jié)合附圖與實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0040] 實施例1負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜的制備方法：
[0041] 原料：成品ADM膜（煙臺正海生物技術(shù)有限公司，B型海奧? 口腔生物膜海奧，請詳 細(xì)寫明公司名稱，以及所買產(chǎn)品的型號）
[0042] lmmol/L肝素/硫酸肝素溶液
[0043] 200ng/mL 的 bFGF 溶液
[0044] (1)]\^生物緩沖液配置：以配比為例，稱量9.768]\^、29.22 8恥(：1、51^10%的 Bri j35,溶于IL蒸餾水，用NaOH溶液調(diào)整PH至6. 0±0. 1，備用；PBS緩沖液配置：以配IL 為例，稱量 9g NaCl，6g Na2HPO4 · 12H20(或 Na2HP042 . 38g)，0· 4g NaH2PO4 · 2H20,溶于 IL 蒸 餾水，用NaOH溶液調(diào)整PH至7. 4,備用。
[0045] 也可直接通過試劑商購買上述緩沖液。
[0046] (2)肝素化脫細(xì)胞真皮基質(zhì)膜的制備：將成品ADM膜置于含有l(wèi)mmol/L肝素的 0. lmol/L，PH = 5的MES生物緩沖液中，浸泡3小時，后置于MES生物緩沖液中過夜，獲得肝 素化ADM膜；
[0047] (3)負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜制備。每Icm2 ADM膜用500 μ L的bFGF溶液（200ng/ mL bFGF，0. 1 % BSA，5%蔗糖，0. 01 % EDTA溶于PBS緩沖液）于4°C條件下浸泡過夜，然后 采用-60°C真空凍干機(jī)凍干膜材料，得到負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜，每張 Icm2大小的膜含 有 IOOng bFGF〇
[0048] 負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜體外釋藥測定
[0049] 取一片制備完成的ADM膜（含bFGF IOOng)，置于I. 5mL的印pendorf (EP)管中， 蓋緊管口，管內(nèi)加入0. 5mLPBS緩沖液作為釋放介質(zhì)，將EP管置恒溫箱中，溫度為37 °C，在 4,8, 12, 24, 48, 72, 120, 168, 240, 336h取樣0. 3mL，并加入0. 3mL新鮮釋放介質(zhì)，收集所有緩 釋液于_80°C保存，采用酶聯(lián)免疫吸實驗（ELISA)方法（國產(chǎn)Assay人bFGF酶聯(lián)免疫吸附 試驗試劑盒）測定緩釋液中bFGF的濃度，計算累積釋放度。重復(fù)三個樣本，取平均值。用 累積釋藥百分?jǐn)?shù)對時間繪圖得到載藥ADM屏障膜的釋藥曲線，見圖2,由圖2可知總體緩釋 藥量為總體藥量的90%，即其載藥率約為90%。體外緩釋系統(tǒng)顯示24小時內(nèi)釋放藥量為 34. 1%，48小時內(nèi)釋放藥量52. 3%，72小時內(nèi)釋放藥量62. 5%，120小時內(nèi)釋藥量78. 7%， 觀察至240小時后基本無新藥釋放。
[0050] 負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜應(yīng)用于大鼠顱骨缺損及其愈合效果測定
[0051] 動物實驗分為三組，分別為空白對照組（control)，單純膜材料（ADM組），負(fù)載 bFGF的膜材料（ADM+bFGF組）。在8w齡的雌性Wi star大鼠的顱骨左側(cè)頂骨上制備8mm X 6mm 橢圓全厚骨缺損，分別將上述膜材料覆蓋于缺損表面，并設(shè)置空白對照組。于術(shù)后1周，2 周，4周，8周處死所有實驗動物并取材。
[0052] (1)4%多聚甲醛內(nèi)固定后常規(guī)EDTA脫鈣，脫水，透明，石蠟包埋，石蠟切片，通過 HE染色，Micro ct掃描分析比較四組骨缺損的愈合情況。
[0053] (2)采用⑶34-/⑶90+免疫熒光雙染觀察骨缺損愈合過程中材料對間充質(zhì)干細(xì)胞 的募集情況。
[0054] (3)堿性磷酸酶（ALP)免疫組化染色檢測干細(xì)胞成骨分化的情況。
[0055] (4)所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用SPSS17. 0統(tǒng)計軟件包，對相關(guān)參數(shù)進(jìn) 行單因素方差分析，α =0.05。
[0056] 結(jié)果顯示，如圖3所示（A)三維重建的缺損區(qū)域愈合的典型結(jié)果，圓圈部分為原本 缺損的制備范圍，NEW BONE顯示新生骨情況；(B)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為 0. 05, *P < 0. 05,相比于空白對照組；#P < 0. 01，相比于空白對照組；AP < 0. 05,相比于 ADM+bFGF組。由圖中可見，bFGF+ADM組愈合情況明顯好于其他兩組，說明bFGF優(yōu)化了 ADM 屏障膜，增強(qiáng)了其在骨缺損愈合中的作用。
[0057] 如圖4所示，紅色熒光標(biāo)記的為干細(xì)胞表面標(biāo)志⑶34,綠色熒光標(biāo)記為干細(xì)胞表 面標(biāo)志⑶90,藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞核，我們默認(rèn)的間充質(zhì)干細(xì)胞為⑶34-，⑶90+細(xì)胞，即表達(dá) 綠色熒光而不表達(dá)紅色熒光的細(xì)胞，每組選取5張片子，每張選取三個視野進(jìn)行觀察計數(shù)， 計算間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量。（A) Iw處死動物取材后檢測干細(xì)胞數(shù)量；(B) 2w處死動物取材檢 測干細(xì)胞數(shù)量；（C)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)為0. 05, *P < 0. 05,相比于空白 對照組；< 0. 01，相比于空白對照組；▲ P < 0. 05,相比于ADM+bFGF組。由結(jié)果可見， Iw和2w時bFGF+ADM組對干細(xì)胞的募集作用強(qiáng)于其他，這也解釋了后期成骨效果好的原因。
[0058] 結(jié)果如下：
[0059] (1)術(shù)后實驗動物成活率90%，缺損處無明顯炎癥及免疫排斥反應(yīng)發(fā)生。
[0060] (2)組織學(xué)HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，ADM組、ADM+bFGF組缺損處修復(fù)組織量明顯多于空 白對照組。
[0061] (3) Sw組Micro ct影像學(xué)分析結(jié)果顯示，ADM組骨愈合情況明顯好于空白對照組 (圖3A)，ADM+bFGF組骨缺損基本完全愈合，新生骨體積明顯多于其他兩組（圖3B)。
[0062] (4)⑶34-/⑶90+免疫熒光雙染結(jié)果顯示ADM+bFGF在Iw和2w時對干細(xì)胞的募集 作用很強(qiáng)，明顯高于其他兩組（P〈〇. 01)(圖4)。
[0063] (5)堿性磷酸酶（ALP)免疫組化染色顯示2w時ADM+bFGF組的平均光密度（IOD) 明顯高于單純ADM組和空白對照組（P〈0. 05)(圖5)。
[0064] 上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進(jìn)行了描述，但并非對本發(fā)明保護(hù)范 圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不 需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種bFGF優(yōu)化的ADM屏障膜的制備方法，其特征是： (1) 將ADM膜置于含有肝素的MES生物緩沖液中浸泡后，除去浮于表層的肝素分子獲得 肝素化ADM膜； (2) 將步驟（1)得到的肝素化ADM膜置于bFGF溶液中浸泡后，凍干膜材料，即得到bFGF 優(yōu)化的ADM屏障膜。2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述步驟⑴中浸泡溫度為0_8°C。3. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述步驟⑴中肝素的濃度為 0. 5-1. 5mmol/L〇4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述步驟（1)中MES生物緩沖液的濃度 為 0? lmol/L，pH = 5-5. 5〇5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述步驟（2)中凍干溫度為-60°C。6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述步驟（2)中肝素化ADM膜與bFGF溶 液的用量關(guān)系為lcm2:500 y L。7. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征是：所述步驟（2)中bFGF溶液為：200ng/ mLbFGF，0? 1 % BSA，5%蔗糖，0? 01 % EDTA 溶于 pH = 7-7. 5 的 PBS 緩沖液制得。8. 如權(quán)利要求1-7任一所述的方法制備的ADM屏障膜。9. 如權(quán)利要求8所述的ADM屏障膜，其特征是：每張Icm2大小的膜含有IOOng bFGF。10. 如權(quán)利要求8所述的ADM屏障膜在制備骨組織工程中所用到的材料中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種bFGF優(yōu)化的促進(jìn)硬組織再生的ADM屏障膜及其制備方法與應(yīng)用，將肝素化ADM膜用bFGF溶液于0-8℃浸泡后-60℃凍干膜材料，得到負(fù)載bFGF的肝素化ADM膜。本發(fā)明將bFGF負(fù)載于GTR屏障膜材料表面不僅可有效發(fā)揮其空間保持功能而且可以通過對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的募集和促增殖作用加速大鼠顱骨缺損的愈合，因此該發(fā)明更新了現(xiàn)有的ADM膜材料，促進(jìn)了骨組織工程的發(fā)展。
【IPC分類】A61L27/54, A61L27/38
【公開號】CN105126173
【申請?zhí)枴緾N201510623816
【發(fā)明人】楊丕山, 杜密
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年12月9日
【申請日】2015年9月25日