解，用多功能酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值，計(jì)算細(xì)胞的存活率。結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，MSN-COOH和MSN-M對(duì)體外模擬懸浮CTCs模型中結(jié)腸癌細(xì)胞均無(wú)明顯的毒性，細(xì)胞存活率在90%以上。說(shuō)明該濃度梯度的空白載體和MIF對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞無(wú)毒性；aE-MSN和aE-MSN-M在低濃度(小于100 μ g/mL)時(shí)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞無(wú)明顯毒性，在高濃度時(shí)(大于100μ g/mL)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞有顯著的調(diào)控作用，且在整體的濃度梯度下隨著濃度的增大對(duì)細(xì)胞的毒性也越大。說(shuō)明在模擬血液環(huán)境中，aE-MSN和aE-MSN-M仍能調(diào)控血液中結(jié)腸癌細(xì)胞的活性。
[0032](9)抑制CTCs粘附于血管內(nèi)膜實(shí)驗(yàn):選用IL-1 β刺激HUVECs中細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，以增加其粘附癌細(xì)胞的能力。用熒光顯微鏡法考察MSN-C00H、MSN-M、aE_MSN和aE-MSN-M對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞與HUVECs間粘附的影響。選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的HUVECs，經(jīng)胰蛋白酶消化后，配成細(xì)胞懸液。于每孔500 PL接種到24孔板，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使其生長(zhǎng)到覆蓋率達(dá)到80%-90%時(shí)，吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液洗滌一次，再于每孔加入500 μ? Μ199培養(yǎng)基(含刺激因子IL-Ιβ，濃度為I ng/mL)，另設(shè)空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，置于37°C，5% C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，以激活HUVECs。在此期間將對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細(xì)胞用胰酶溶液消化后，配成細(xì)胞懸液。于離心機(jī)中1500 rpm離心5 min，吸棄上清液，加入I mL PBS緩沖液吹打均勻，加入10 PL羅丹明123溶液并充分混勻，室溫下避光染色20min。充分染色后將細(xì)胞懸液于離心機(jī)中1500 rpm離心5 min，吸棄上清液，用PBS緩沖液洗滌2次，加入I mL無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，配成濃度為3 X 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。用無(wú)酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基配制不同納米粒子的分散液，吸棄舊培養(yǎng)基，于每孔450 PL上述納米粒子的分散液和50 PL結(jié)腸癌細(xì)胞懸液加入到24孔板內(nèi)，納米粒子的終濃度為100 Pg/mL，結(jié)腸癌細(xì)胞個(gè)數(shù)為15000個(gè)/孔。設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育I h，整個(gè)過(guò)程均避光操作。小心吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕洗滌2次以去除未粘附的結(jié)腸癌細(xì)胞，加入500 PL無(wú)酚紅的1640培養(yǎng)基至每孔中，使用熒光倒置顯微鏡拍照，每孔隨機(jī)選取10個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)平均粘附細(xì)胞數(shù)。結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，MSN-COOH空白載體對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞粘附于HUVECs的幾乎沒(méi)有作用；MSN-M和aE-MSN中的MIF和aEpCAM均有一定的抑制作用；當(dāng)二者同時(shí)存在時(shí)，即當(dāng)aE-MSN-M作用時(shí)，對(duì)結(jié)腸癌粘附于HUVECs具有明顯的抑制效果。
[0033](10)動(dòng)物體內(nèi)抑制腫瘤轉(zhuǎn)移活性實(shí)驗(yàn):選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)且狀態(tài)良好的結(jié)腸癌細(xì)胞SW620，經(jīng)胰蛋白酶消化后，生理鹽水洗滌3次，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并加入生理鹽水配制成細(xì)胞懸液，使得細(xì)胞濃度為1.5X107個(gè)/mL。常溫?zé)o菌環(huán)境放置備用。用生理鹽水將現(xiàn)合成的納米藥物MSN-COOH和aE-MSN-M配制成濃度為8mg/mL的分散液，室溫環(huán)境保存?zhèn)溆谩?br>[0034]將實(shí)驗(yàn)用裸小鼠每組5只，隨機(jī)分成三組:空白對(duì)照組、MSN-COOH實(shí)驗(yàn)組和aE-MSN-M實(shí)驗(yàn)組。將上述配制的SW620細(xì)胞懸液經(jīng)尾靜脈注射，每組裸小鼠注射200 μ L約含3 X 16個(gè)SW620細(xì)胞。I h后在MSN-COOH實(shí)驗(yàn)組和aE-MSN-M實(shí)驗(yàn)組分別根據(jù)裸鼠體重按40 mg/kg的劑量經(jīng)尾靜脈注射MSN-COOH和aE-MSN-M分散液至裸鼠體內(nèi)，在空白組中注射相當(dāng)體積的生理鹽水作為對(duì)照。各組實(shí)驗(yàn)裸鼠在給藥22天后，處死，取出完整的肺肝組織，經(jīng)布氏液染色后觀察肺內(nèi)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。并將肺組織在福爾馬林溶液中保存進(jìn)行石蠟包埋和切片，并按下式計(jì)算腫瘤負(fù)荷。結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，空白組裸鼠肺部出現(xiàn)微小的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，說(shuō)明裸鼠體內(nèi)已出現(xiàn)SW620肺轉(zhuǎn)移；MSN-C00H實(shí)驗(yàn)組裸鼠也能觀察到腫瘤轉(zhuǎn)移的結(jié)節(jié)，證明本實(shí)驗(yàn)組裸鼠也出現(xiàn)SW620肺轉(zhuǎn)移，同時(shí)也說(shuō)明MSN-COOH不能抑制腫瘤的肺轉(zhuǎn)移；aE-MSN-M實(shí)驗(yàn)組的裸鼠肺部組織表面觀察不到腫瘤的結(jié)節(jié)，則說(shuō)明該納米?？赡芫哂幸种芐W620肺轉(zhuǎn)移的作用。根據(jù)肺組織切片中腫瘤所占整個(gè)切片的面積比例，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組和MSN-COOH實(shí)驗(yàn)組中腫瘤所占整個(gè)肺切片面積比例分別在8.5±0.8%和8.2± 1.1%，二者相差無(wú)幾，在aE-MSN-M實(shí)驗(yàn)組腫瘤所占比例為0.5 ±0.1%，通過(guò)與空白實(shí)驗(yàn)組相比，具有顯著性差異。因此我們從病理切片的結(jié)果也能進(jìn)一步的證實(shí)aE-MSN-M具有抑制腫瘤肺轉(zhuǎn)移的作用。
[0035]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種抗體偶聯(lián)的介孔二氧化娃/米非司酮納米制劑，其特征在于:包含介孔二氧化硅納米粒子MSN、米非司酮MIF和上皮細(xì)胞粘附分子抗體aE ;所述MSN負(fù)載MIF，所述aE共價(jià)修飾于MSN的表面。2.一種制備如權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑的方法，其特征在于:先制備空白MSN，將MSN表面羥基基團(tuán)進(jìn)行羧基化處理后，再將MIF包埋于其孔道結(jié)構(gòu)中，然后再將aE共價(jià)偶聯(lián)到MSN表面，制得aE-MSN-M納米制劑。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)在十六烷基三甲基氯化銨溶液中加入三乙醇胺和四乙基硅烷，得空白MSN; (2)在乙醇中加入3-氨丙基三乙氧基硅烷和丁二酸酐，反應(yīng)24h，加入空白MSN，繼續(xù)攪拌24 h ;離心，所得沉淀用無(wú)水乙醇和二次水反復(fù)高速離心洗滌，冷凍干燥，得羧基化MSN ； (3)將羧基化MSN加入米非司酮的乙醇溶液中，攪拌48h，離心，得載米非司酮的介孔二氧化娃納米粒子MSN-M ； (4)將MSN-M分散于2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液中，磁力攪拌使之分散均勻，加入1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，常溫?cái)嚢? h，加入抗體aE，繼續(xù)常溫?cái)嚢? h，高速離心，所得沉淀用PBS緩沖液洗滌2-3次，冷凍干燥，得aE-MSN-M納米制劑。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(I)中得到的空白MSN的粒徑為100~ 500 nm，孔徑為 2.5 ~ 8 nm。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(3)中米非司酮和MSN的投料質(zhì)量比為 1:10 ~ 5:1。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(3)中得到的MSN-M的載藥量為100~ 400 mg米非司酮/g MSN07.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(4)中抗體aE和MSN-M的投料質(zhì)量比為 1:1000 ~ 1:50。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:步驟(4)中得到的aE-MSN-M的粒徑為100?800 nm。9.如權(quán)利要求1所述的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑在制備預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑及其制備方法和應(yīng)用。該制劑包含介孔二氧化硅納米粒子（MSN）、米非司酮（MIF）和上皮細(xì)胞粘附分子抗體（anti-EpCAM，aE），所述MSN負(fù)載MIF，所述aE共價(jià)修飾于MSN的表面。本發(fā)明的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑，不僅可靶向識(shí)別并遏制循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs）的活性，還能抑制CTCs與血管內(nèi)膜間的粘附，干擾腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程，顯著遏制腫瘤轉(zhuǎn)移。
【IPC分類】A61P35/04, A61K31/567, A61K47/42, A61K39/395, A61K47/48, A61K9/19
【公開(kāi)號(hào)】CN105125510
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510635471
【發(fā)明人】高瑜, 賈力, 顧頌恩
【申請(qǐng)人】福州大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年9月30日