一種抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤難以治愈和復(fù)發(fā)的主要原因之一。原發(fā)腫瘤可通過手術(shù)切除、放射治療或其他局部治療加以有效控制甚至治愈，但已播散的腫瘤用上述手段治療往往難以控制病情的進(jìn)一步發(fā)展。腫瘤轉(zhuǎn)移是由一系列級聯(lián)步驟組成:(1)原發(fā)性腫瘤細(xì)胞侵襲鄰近的細(xì)胞外基質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞層；(2)侵及血管壁；(3)穿入脈管系統(tǒng)；(4)在遠(yuǎn)端組織粘附和著床；(5)離開循環(huán)到周圍間質(zhì)組織；(6)適應(yīng)新環(huán)境形成微轉(zhuǎn)移灶；(7)增殖為肉眼可見的繼發(fā)性腫瘤。
[0003]由原發(fā)性腫瘤所釋放進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，即所謂的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells, CTCs)在惡性腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的作用日益受到關(guān)注。CTCs可在循環(huán)系統(tǒng)中(包括骨髓和淋巴系統(tǒng))長期以低活性或休眠狀態(tài)存在。由于其低活性(或休眠)，所以化療藥物對其不敏感，也由于其在手術(shù)后的亞健康人體內(nèi)含量很低，所以化療藥物對其都不起作用。與正常血液細(xì)胞相比，循環(huán)腫瘤細(xì)胞具有抗原特性，其表面存在豐富的生物標(biāo)記物如 EpCAM、SialyLewis、Ki_67、CD44+、HER2、和 Folate Receptor 等，這些物質(zhì)可在腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，而在正常細(xì)胞表面低量表達(dá)或不表達(dá)。
[0004]米非司酮(mifepristone，MIF)臨床上廣泛用于緊急避孕，終止早期妊娠和引產(chǎn)。其作用過程為:在蛻膜中競爭性結(jié)合孕激素受體使蛻膜細(xì)胞壞死，蛻膜，子宮肌收縮，絨毛組織剝離，分宮頸擴(kuò)張，導(dǎo)致流產(chǎn)，從而達(dá)到終止妊娠的目的。由于腫瘤的發(fā)生和生長過程在很多方面和胚胎的早期發(fā)育過程具有相似性，因此早期的研究者推測MIF可能也具有抗腫瘤的作用。近年來越來越多的研究表明，MIF已經(jīng)證明在多種癌細(xì)胞中具有抑制細(xì)胞增殖的作用，如乳腺癌，子宮內(nèi)膜癌，宮頸癌，前列腺癌，胃癌，腦癌，骨癌，卵巢癌，以及多種動物模型中發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長和抗腫瘤的作用，且可以作為一種溫和的抗腫瘤藥物應(yīng)用在臨床實(shí)驗(yàn)中。
[0005]介孔二氧化硅納米顆粒(MSN)以其獨(dú)特的優(yōu)勢在藥物遞送等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。作為藥物輸送載體在腫瘤治療中的應(yīng)用。MSN具有較高的表面積和孔體積，因此藥物負(fù)載量較大，甚至可超過35wt.%，大大超越現(xiàn)有的絕大多數(shù)載藥納米粒。此外，MSN可作為腫瘤革E向納米藥物輸送載體。利用滲透新生血管和滯留增強(qiáng)效應(yīng)(EPR效應(yīng)，EnhancedPermeability and Retent1n Effect)，通過改變MSN外形尺寸，使MSN載藥系統(tǒng)易于從高通透性且不完整的腫瘤毛細(xì)血管網(wǎng)中滲出，進(jìn)入腫瘤組織間隙，而難于透過正常血管，從而實(shí)現(xiàn)藥物輸送，增加了高毒性藥物在腫瘤組織中的蓄積量，增長滯留時(shí)間。因此，調(diào)節(jié)MSN顆粒直徑大小，利用EPR效應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)MSN載藥系統(tǒng)被動靶向腫瘤組織釋放藥物的目的。MSN載藥系統(tǒng)還可通過修飾靶向分子實(shí)現(xiàn)對腫瘤的主動靶向。將對腫瘤細(xì)胞有特異性識別作用的配體連接在MSN外殼上，可將藥物準(zhǔn)確、有效地輸送到靶細(xì)胞或病變部位，從而實(shí)現(xiàn)MSN載藥系統(tǒng)主動靶向的目的。
[0006]檢索國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明，到目前為止，還沒有一個(gè)藥物能特異性靶向CTCs并調(diào)控CTCs的活性，以達(dá)到預(yù)防并抑制微轉(zhuǎn)移的目的。面對這個(gè)科技空白，本發(fā)明人利用MSN為藥物載體，包載低毒性抗腫瘤藥物米非司酮，并在其表面修飾上能特異性識別CTCs的上皮細(xì)胞粘附分子抗體(ant1-EpCAM，aE)，制備一種能特異性識別并調(diào)控CTCs活性的納米制劑(aE-MSN-M)用于防治腫瘤轉(zhuǎn)移。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能特異性識別并調(diào)控CTCs活性的納米制劑(aE-MSN-M)用于防治腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0008]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取了如下技術(shù)方案:
一種抗體偶聯(lián)的介孔二氧化娃/米非司酮納米制劑包含介孔二氧化娃納米粒(MSN)、米非司酮(MIF)和上皮細(xì)胞粘附分子抗體(ant1-EpCAM，aE)(購自Abcam公司，單克隆抗體，IgG型)，所述MSN負(fù)載MIF，所述aE共價(jià)修飾于MSN的表面。
[0009]—種制備如上所述的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑的方法為:先制備空白MSN，將MSN表面羥基基團(tuán)進(jìn)行羧基化處理后，再將米非司酮物理吸附于其孔道結(jié)構(gòu)中，然后再將aE共價(jià)偶聯(lián)到MSN表面，得aE-MSN-M納米制劑。
[0010]所述的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑的制備方法包括以下步驟:
(I)將三乙醇胺(TEA)溶液加入到十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)水溶液中，加入四乙基硅烷(TEOS)，得空白MSN。
[0011](2)將3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和丁二酸酐于乙醇溶液中反應(yīng)24 h后，加入空白MSN，繼續(xù)攪拌24 ho離心，所得沉淀用無水乙醇和二次水反復(fù)高速離心洗滌數(shù)次，冷凍干燥，即得羧基化修飾的MSN。
[0012](3)將羧基化MSN加入米非司酮的乙醇溶液，攪拌48 h后離心，得載米非司酮的介孔二氧化硅納米粒(MSN-M)。
[0013](4)將MSN-M分散于2_ (N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液中，磁力攪拌至分散均勻，加入1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)常溫?cái)嚢? h后，加入抗體aE繼續(xù)常溫?cái)嚢? ho高速離心，所得沉淀用PBS緩沖液洗滌2-3次，冷凍干燥即得aE-MSN-M固體粉末。
[0014]步驟(I)中得到的空白MSN的粒徑為100 ~ 500 nm，孔徑為2.5 ~ 8 nm。
[0015]步驟(3)中米非司酮和MSN的投料質(zhì)量比為1:10 ~ 5:1，得到的MSN-M的載藥量為100 ~ 400 mg米非司酮/g MSNo
[0016]步驟(4)中抗體aE和MSN-M的投料質(zhì)量比為1:1000 ~ 1:50，得到的aE_MSN_M的粒徑為 100 ~ 800 nm。
[0017]本發(fā)明的作用原理是:第一，采用羧基化的MSN作為米非司酮的載體材料，通過物理吸附及電荷相互作用的方式使米非司酮負(fù)載到MSN的孔道結(jié)構(gòu)中，并分散在水溶液中，解決米非司酮水溶性差的問題；第二，通過共價(jià)偶聯(lián)的方式將aE修飾于MSN表面，可主動靶向識別過表達(dá)有上皮細(xì)胞粘附分子的腫瘤細(xì)胞特別是血液中的CTCs，使該納米制劑能選擇性作用于CTCs ;第三，該納米制劑中的aE能抑制CTCs的活性，且納米制劑中的米非司酮可跟aE協(xié)同抑制CTCs粘附到血管內(nèi)膜，阻止微轉(zhuǎn)移灶的形成，防治腫瘤轉(zhuǎn)移。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明選用MSN作為藥物載體，負(fù)載能干擾腫瘤細(xì)胞粘附于血管內(nèi)膜的藥物MIF，并與能特異性識別CTCs的aE共價(jià)偶聯(lián)，形成的aE-MSN-M具有納米尺度，可攜帶藥物高度分散在水相中，不僅能主動靶向識別CTCs，還能抑制CTCs的活性，且有效阻止CTCs粘附到血管內(nèi)膜，阻斷微轉(zhuǎn)移灶的形成，防治腫瘤轉(zhuǎn)移；
(2)本發(fā)明的aE-MSN-M納米制劑的粒徑小于800nm，不會形成給藥栓塞，可用于患者的靜脈給藥，能夠在血液循環(huán)中特異性識別并抑制腫瘤細(xì)胞，從而達(dá)到防治腫瘤轉(zhuǎn)移的目的。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明所制備的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑的TEM圖(A)，粒徑分布圖(B)，氮?dú)馕?解吸等溫線及孔徑分布圖(C)，和藥物釋放圖(D);
圖2是本發(fā)明所制備的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性識別情況。
[0020]圖3是本發(fā)明所制備的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑對循環(huán)腫瘤細(xì)胞的特異性抑制情況，**/< 0.01。
[0021]圖4是本發(fā)明所制備的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納