米制劑干擾循環(huán)腫瘤細(xì)胞粘附于血管內(nèi)膜情況，、P< 0.05，# P< 0.01，## P< 0.01。
[0022]圖5是本發(fā)明所制備的抗體偶聯(lián)的介孔二氧化硅/米非司酮納米制劑抑制模型動物腫瘤轉(zhuǎn)移效果圖，**/"< 0.01。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面，將通過實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于這些實(shí)施例，在本發(fā)明權(quán)利要求所闡明的范圍內(nèi)，可進(jìn)行各種改變或等同替換。
[0024]實(shí)施例1
(I)量取20 mL超純水于50 mL圓底燒瓶中，加入2.0 g十六烷基三甲基氯化銨(CTAC)，室溫攪拌至完全溶解，加入0.02 mg三乙醇胺(TEA)，于95°C油浴恒溫加熱冷凝攪拌I h。隨后逐滴滴加1.5 mL四乙基硅烷(TE0S)，繼續(xù)于95°C油浴恒溫加熱冷凝攪拌Iho將樣品冷卻至室溫，用無水乙醇高速離心洗滌3-4次以除去殘留的反應(yīng)試劑。然后收集樣品于20 mL的洗滌溶劑中(0.2 g氯化鈉溶于20 mL甲醇)室溫攪拌3 h，用甲醇高速離心洗滌。重復(fù)上述洗滌步驟3-4次以除去模板劑CTAC。冷凍干燥，即得白色MSN固體粉末。
[0025](2)量取2.5 mL 3_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和75 mg 丁二酸酐于20 mL無水乙醇中，常溫攪拌24 h。隨后加入10mg MSN繼續(xù)常溫攪拌24 h，將高速離心所得沉淀依次用無水乙醇和二次水反復(fù)高速離心洗滌數(shù)次，冷凍干燥，即得白色羧基化修飾的MSN-COOH固體粉末。
[0026](3)稱取MIF 12 mg溶于無水乙醇中，配制成濃度為I mg/mL。取上述MIF溶液于25 mL的圓底燒瓶中，加入20 mg MSN-C00H，常溫攪拌48 h。12000 rpm離心5 min收集上清液，PBS緩沖液洗滌2-3遍，冷凍干燥即得MSN-M固體粉末。
[0027](4)稱取2 mg MSN-M于I mL MES緩沖液中，磁力攪拌至分散均勻，配制成I mg/mL的分散液。取上述MSN-M分散液100 μ L和500 μ L MES于5 mL圓底燒瓶中，加入10mg EDC, 5 mg NHS常溫攪拌2 h，加入10 μ L aEpCAM繼續(xù)常溫攪拌2 h，將高速離心所得沉淀PBS緩沖液洗滌2-3次，冷凍干燥即得aE-MSN-M固體粉末。對其進(jìn)行透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)表征，結(jié)果見圖1 (A)和(B)。圖1 (C)為氮?dú)馕?解吸等溫線及孔徑分布圖，由圖可知，MSN表現(xiàn)出介孔二氧化硅納米粒典型的IV型等溫吸附-解吸曲線，在低相對分壓區(qū)間P/P^0.2-0.4范圍內(nèi)出現(xiàn)毛細(xì)凝聚現(xiàn)象，說明MSN具有孔徑結(jié)構(gòu)并且孔徑分布較均一。
[0028](5)體外釋放實(shí)驗:分別選取不同pH值(5.5，7.4)的含1%乙醇的PBS緩沖液作為釋放溶劑，考察MSN-M的體外釋放行為。使用pH 7.4的PBS緩沖液將MSN-M配制成終濃度為I mg/mL的分散液。然后取上述分散液I mL于透析袋(MffCO=HOOO)中，并將透析袋置于裝有100 mL PBS緩沖液(pH值分別為5.5和7.4)的燒杯中，于37°C恒溫攪拌，每間隔一定時間進(jìn)行取樣，采用高效液相色譜法測定和通過差減法計算出MIF的各個時間點(diǎn)的累積釋放量。兩組各去三個平行樣本，取平均值。圖1 (D)為不同的pH值條件下，MSN-M載藥納米粒釋放MIF的曲線。pH值對藥物的釋放有很大影響，在pH 7.4的生理條件下藥物釋放量較低，釋放速度快，在8 h達(dá)到65%左右，這是因為在生理環(huán)境中，MSN-COOH的羧基與MIF分子存在靜電吸附，使得MIF不易從MSN-COOH孔道中釋放出來；而在pH 5.5的酸性環(huán)境中，藥物的釋放量在5 h即能釋放85%，釋放速度快，釋放量多，這主要是因為在酸性環(huán)境中存在較多的帶有正電荷的氫離子，氫離子于MSN-COOH上的羧基結(jié)合，使羧基質(zhì)子化，從而與MIF的吸附能力減弱，促進(jìn)MIF的釋放。
[0029](6)為進(jìn)行腫瘤細(xì)胞特異性識別實(shí)驗，需對MSN進(jìn)行熒光標(biāo)記。量取5 μ L APTES和100 yL (I mg/mL)異硫氰酸熒光素(FITC)于5 mL圓底燒瓶中，常溫避光攪拌24 h。隨后加入5 mg MSN-COOH繼續(xù)常溫避光攪拌24h，將高速離心所得沉淀依次用無水乙醇和二次水反復(fù)高速離心洗滌數(shù)次，冷凍干燥，即得黃色F-MSN固體粉末。稱取2 mg F-MSN于ImL MES緩沖液中，磁力攪拌至分散均勻，配制成I mg/mL的分散液。取上述MSN-COOH分散液100 μ L和500 μ L MES于5 mL圓底燒瓶中，加入5 mg 1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，10 mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)常溫攪拌2 h，加入10 μ L aEpCAM繼續(xù)常溫攪拌2 h，將高速離心所得沉淀PBS緩沖液洗滌2-3次，冷凍干燥即得aE-F-MSN固體粉末。
[0030](7 ) CTCs特異性識別實(shí)驗:采用模擬CTCs的模型和流式細(xì)胞術(shù)考察F-MSN和aE-F-MSN的細(xì)胞攝取情況。取志愿者新鮮全血I mL裝與抗凝管中，加入10 mL生理鹽水，稀釋后備用。選取對數(shù)期生長且狀態(tài)良好的HT-29和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，使用Hoechst焚光染料常溫避光染色30 min。充分染色后將細(xì)胞懸液于離心機(jī)中1500rpm離心5 min，吸棄上清液，用PBS緩沖液洗滌2次，加入培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打均勻，配制成細(xì)胞懸液備用。將上述血液和結(jié)腸癌細(xì)胞懸液共2mL接種到6孔板中，使每孔中含有3 X 15個結(jié)腸癌細(xì)胞。加入預(yù)先配制好的F-MSN和aE-F-MSN，終濃度為100 μ g/mL。在培養(yǎng)箱中振蕩孵育2 h，以免結(jié)腸癌細(xì)胞貼壁。取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)孔中的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移到離心管中，用Hank’s緩沖液洗滌3次，2000 rpm離心5 min,去除上清液，再次加入I mL PBS緩沖液，吹打均勻，在1500 rpm, 5 min的條件下離心，吸除上清液，用400 μ L PBS緩沖液重新懸浮細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm和663 nm波長處檢測，每個樣品的細(xì)胞計數(shù)為14個，利用流式軟件分析平均熒光強(qiáng)度。結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，在體外模擬懸浮CTCs模型中，結(jié)腸癌細(xì)胞對aE-F-MSN的攝取量高于對F-MSN的攝取量，說明F-MSN能被體外模擬CTCs模型中的結(jié)腸癌細(xì)胞攝取，同時aE-F-MSN能夠在血液環(huán)境中，依靠偶聯(lián)的aEpCAM介導(dǎo)靶向到循環(huán)的結(jié)腸癌細(xì)胞中。
[0031](8) CTCs特異性抑制實(shí)驗:建立一種模擬懸浮CTCs模型，并采用MTT法測試多功能MSN對結(jié)腸癌細(xì)胞活性的調(diào)控。取志愿者新鮮全血I mL裝與抗凝管中，加入10 mL生理鹽水，稀釋后備用。選取對數(shù)期生長且狀態(tài)良好的HT-29和SW620結(jié)腸癌細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后，配制成結(jié)腸癌細(xì)胞懸液備用。將上述血液樣本和結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到多個離心管中，使紅細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞的比例約為1000:1。加入預(yù)先配置好的不同濃度梯度納米粒子(MSN-C00H、MSN-M、aE-MSN和 aE-MSN-M)，終濃度分別為 25 μ g/mL, 50 μ g/mL, 100 μ g/mL,150 μ g/mL, 200 μ g/mL，在震蕩培養(yǎng)箱中孵育2 h。取出離心管，用Hank’ s緩沖液洗滌3次，2000 rpm離心5 min，去除上清液，再次加入I mL PBS緩沖液，吹打均勾，在1500 rpm, 5min的條件下離心，吸除上清液，用400 μ L培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞。將上述細(xì)胞接種到96孔板中，使每孔中約含有13個結(jié)腸癌細(xì)胞，設(shè)置5個復(fù)孔，另設(shè)溶劑對照組和空白對照組，在培養(yǎng)箱中孵育2 ho取出培養(yǎng)板，小心吸棄舊培養(yǎng)基及未貼壁血細(xì)胞，并于每孔中加入100KL新培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中孵育48 ho小心吸棄舊培養(yǎng)基，并于每孔中加入100 PL無血清、無酚紅的1640培養(yǎng)基和10 μ? MTT溶液(已稀釋)，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育4 h。小心吸棄各孔中的培養(yǎng)基，并加入溶液150 PL于各孔中，常溫低速振蕩搖勻10 min，使藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶