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臭椿酮在制備治療前列腺疾病的藥物中的應(yīng)用_4

文檔序號:9359245閱讀:來源:國知局
4?免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
[0114] 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一'丨生作用為基 礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作 用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白 質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體 內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來。目前多用精制的proreinA預(yù)先結(jié)合固化在argarose的 beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后,beads上的proreinA就能吸附抗原達到精 制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合。
[0115] 實驗結(jié)果如圖7所示,利用免疫印跡實驗(westernblot)證明式(I)臭椿酮處理 能夠顯著抑制雄激素受體的蛋白表達;利用聚合酶鏈式反應(yīng)(PolymeraseChainReaction, PCR)實驗證明式⑴臭椿酮能夠抑制AR調(diào)控的下游基因表達。圖7(A)表明式⑴臭椿酮 可以劑量依賴地下調(diào)雄激素受體蛋白水平;圖7(B)表明式(I)臭椿酮同樣可以抑制雄激素 刺激條件下雄激素受體的蛋白水平;圖7(C)表明式(I)臭椿酮可以抑制雄激素受體下游的 靶基因。
[0116] 進一步實驗發(fā)現(xiàn),在一定濃度下式(I)臭椿酮并沒有影響AR的mRNA水平但顯著 抑制了其下游基因PSA的表達,如圖8A所示。而且用放線菌酮(CHX)阻斷蛋白質(zhì)的合成 后,式(I)臭椿酮依然能夠進一步使AR的蛋白表達水平下降,即影響了AR的穩(wěn)定性,如圖 8B所示。此外,蛋白酶體抑制劑MG132可以阻斷式(I)臭椿酮導(dǎo)致的AR蛋白表達水平的 下降,如圖8C所示,這說明臭椿酮誘導(dǎo)的AR蛋白表達水平下降可能與蛋白酶體降解途徑相 關(guān)。實驗還發(fā)現(xiàn)式(I)臭椿酮可以導(dǎo)致AR泛素化的增加,如圖8D所示,進一步說明式(I) 臭椿酮誘導(dǎo)的AR蛋白表達水平下降可能與蛋白酶體降解途徑相關(guān)。免疫共沉淀實驗還證 明式(I)臭椿酮可以導(dǎo)致AR與其分子伴侶之間的結(jié)合下降,如圖8E所示。上述實驗表明 式(I)臭椿酮通過抑制雄激素受體與熱休克分子伴侶之間的結(jié)合誘導(dǎo)其泛素化,從而被蛋 白酶體降解,進而抑制了雄激素受體活性和前列腺癌細胞生長。
[0117] 實施例5 :式⑴臭椿酮在小鼠前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移模型中的抑制效果
[0118] 技術(shù)方法:
[0119] 1.式(I)臭椿酮對小鼠前列腺癌生長模型的抑制作用
[0120] 分別用人前列腺癌細胞22RV1和LNCaP建立兩個小鼠前列腺癌生長模型。將500 萬個人前列腺癌細胞22RV1細胞和LNCaP細胞皮下注射到免疫缺陷小鼠(BLAB/c-nude,裸 鼠)背部皮下,待皮下腫瘤長到IOOmm3左右時,將小鼠分為三組(平均腫瘤體積相同),加 藥組小鼠每天腹腔注射2mg/kg溶于DMSO的式(I)臭椿酮,陽性藥物組注射10mg/kg比卡 魯胺(Bicalutamide,BIL),對照組僅注射DMS0,每天測量并記錄小鼠體重以及腫瘤的長與 寬,22RV1腫瘤(n彡7)和LNCaP腫瘤(n彡4)分別施藥24天和49天后處死小鼠,取皮下 腫瘤,拍照。按照公式體積=長X寬2X0.52計算,統(tǒng)計腫瘤體積。
[0121] 2.式⑴臭椿酮對小鼠前列腺癌轉(zhuǎn)移模型的抑制作用
[0122] 將轉(zhuǎn)移性前列腺癌細胞LNCaP轉(zhuǎn)入螢火蟲熒光素酶(Luciferase)表達質(zhì)粒(該 質(zhì)粒帶有G418抗性篩選標記),并用G418篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞可以表達熒光素酶,熒 光素酶與其底物熒光素接觸后會發(fā)出熒光,可以用動物活體成像系統(tǒng)檢測到細胞的數(shù)量和 位置。構(gòu)建好穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系后,將細胞用基質(zhì)膠混勻注射到小鼠前列腺背側(cè)葉,這樣通過活體 成像技術(shù)就可以檢測到小鼠體內(nèi)的LNCaP細胞的生長和轉(zhuǎn)移情況。
[0123] 實驗結(jié)果如圖9(A)和9(B)所示,通過腫瘤體積的測定表明2mg/kg/day的劑量 下該化合物對表達雄激素受體的兩株前列腺癌細胞(LNCaP和22RV1)都具有顯著的抑制 效果。臨床藥物比卡魯胺(雄激素受體拮抗劑)對LNCaP細胞具有一定的抑制效果,而對 22RV1細胞則抑制效果不明顯。但是式(I)臭椿酮對這兩株前列腺癌細胞都具有較好的抑 制效果。
[0124] 如圖9(E)所示的用藥35天后對小鼠前列腺原位癌的作用效果圖(n> 5),通過動 物活體成像系統(tǒng)拍照圖片,由于腫瘤細胞中帶有熒光素酶,通過向小鼠體內(nèi)打入熒光素底 物后,腫瘤細胞會發(fā)出熒光,這樣利用動物活體成像系統(tǒng)可以確定腫瘤細胞的位置和大小, 圖中陰影代表熒光信號,表明該區(qū)域有腫瘤細胞聚集,熒光強度越深表明腫瘤越大。實驗結(jié) 果顯示在2mg/kg/day劑量的式(I)臭椿酮化合物能顯著抑制前列腺原位癌的轉(zhuǎn)移,如圖 9(F)圖所示,并且效果顯著優(yōu)于陽性藥物10mg/kg/day比卡魯胺(Bicalutamide)。而且, 給藥小鼠與對照組小鼠的體重?zé)o顯著差別,表明式(I)臭椿酮化合物在該劑量下的毒副作 用較小,如圖9(G)所示。
[0125] 實施例6:式⑴臭椿酮在小鼠去勢抵抗性前列腺癌生長和轉(zhuǎn)移模型模型中的抑 制效果
[0126] 如實施例5中所述,將去勢抵抗性前列腺癌細胞22RV1轉(zhuǎn)入螢火蟲熒光素酶 (Luciferase)表達質(zhì)粒構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。構(gòu)建好穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系后,將細胞用基質(zhì)膠混勻注射 到小鼠前列腺背側(cè)葉,待腫瘤形成后將小鼠進行去勢(閹割)。22RV1前列腺癌細胞可以在 去勢以后繼續(xù)生長,抗雄激素藥物比卡魯胺對其治療無效,形成去勢抵抗性前列腺癌。
[0127] 同樣通過動物活體成像系統(tǒng)拍照圖片觀察腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況及藥物的治療 效果。如圖10(A和B)中所述,式(I)臭椿酮能夠顯著抑制去勢小鼠中的22RV1前列腺原 位腫瘤的生長,該腫瘤對比卡魯胺則產(chǎn)生耐藥性。此外,如圖l〇(C和D)所示,式(I)臭椿 酮還可以抑制該腫瘤的轉(zhuǎn)移。
[0128] 綜上所述,式(I)臭椿酮可以抑制小鼠模型中去勢抵抗前列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。
[0129] 上述實施例僅為了說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點,其目的在于讓本領(lǐng)域技術(shù)人員 能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施,并不能以此限制本發(fā)明的保護范圍。凡是根據(jù)本發(fā)明 內(nèi)容的實質(zhì)所作出的等效變化或修飾,都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 式(I)所示的臭椿酮化合物或其水合物或藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載 體在制備治療前列腺癌疾病的藥物中的應(yīng)用;2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物在體外和/或體內(nèi) 抑制雄激素受體突變的前列腺癌細胞株22RV1的增殖、抑制雄激素依賴性前列腺癌細胞株 LNCaP的增殖。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物體外和/或體內(nèi)抑 制前列腺癌細胞的轉(zhuǎn)移。4. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物抑制去勢抵抗性前 列腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用,其特征在于,所述式(I)臭椿酮化合物抑制雄激素受體活 性、抑制前列腺癌細胞生長、遷移和侵襲以及促進前列腺癌細胞凋亡。6. 如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用,其特征在于,式⑴臭椿酮抑制比卡魯胺或MDV3100治療 無效的雄激素受體突細胞株22RV1細胞增殖。7. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用,其特征在于,式(I)臭椿酮體內(nèi)抑制前列腺癌細胞LNCaP 和22RV1的轉(zhuǎn)移。8. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用,其特征在于,式⑴臭椿酮在去勢小鼠動物中抑制前列腺 癌細胞22RV1的生長和轉(zhuǎn)移。9. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,式(I)臭椿酮體外抑制前列腺癌細胞PC3M 的遷移。10. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,式(I)臭椿酮抑制前列腺癌細胞DU145和 LNCaP的侵襲。11. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,式⑴臭椿酮可以抑制雙氫睪酮誘導(dǎo)的雄 激素受體活性以及缺失配體結(jié)構(gòu)域的雄激素受體活性。12. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,式(I)臭椿酮抑制前列腺癌細胞株LNCaP、 22RV1、PC3、DU145及病人來源原代前列腺細胞株的生長。13. 如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征在于,式(I)臭椿酮可以促進前列腺癌細胞 22RV1的凋亡。14. 一種藥物組合物,其特征在于,其包括式(I)臭椿酮化合物或其水合物或藥學(xué)上可 接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。15. 式(I)臭椿酮化合物或其水合物或藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體或如 權(quán)利要求14所述的組合物在制備治療與雄激素受體突變和異常擴增相關(guān)的惡性腫瘤疾病 的藥物中的應(yīng)用。16.如權(quán)利要求15所述的應(yīng)用,其特征在于,所述惡性腫瘤為雄激素受體異常擴增和 突變的惡性腫瘤,包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、腦癌、皮膚癌、膀胱癌、腎癌。
【專利摘要】本發(fā)明提供了中藥單體式(I)臭椿酮(Ailanthone,AIL)在制備治療前列腺疾病的藥物中的應(yīng)用,該化合物能顯著抑制前列腺癌細胞的體外和/或體內(nèi)生長和遷移,降低前列腺癌細胞內(nèi)雄激素受體蛋白表達水平,抑制雄激素受體信號通路,具有前列腺癌治療應(yīng)用前景。
【IPC分類】A61P35/00, A61K31/366
【公開號】CN105078969
【申請?zhí)枴緾N201410186500
【發(fā)明人】易正芳, 何云東, 王金花, 彭世鴻, 劉明耀
【申請人】華東師范大學(xué)
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2014年5月5日
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