35] 上述干細胞是臍帶間充質(zhì)干細胞、臍血間充質(zhì)干細胞、皮膚干細胞、口腔黏膜干細 胞和牙髓間充質(zhì)干細胞、脂肪間充質(zhì)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞、造血干細胞、肝臟干細胞、 神經(jīng)干細胞中的任一種。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0037] (1)本發(fā)明涉及的方法，單次接種即實現(xiàn)在細胞外基質(zhì)表面形成多層細胞膜的效 果，保證在修復(fù)創(chuàng)面時能夠分泌足夠量的多種細胞因子，誘導(dǎo)新生血管形成，促進創(chuàng)面愈 合。加之天然細胞外基質(zhì)的保護、支撐、屏障作用以及三維立體空間結(jié)構(gòu)引導(dǎo)細胞長入和組 織再生等的作用，能夠有效保護促進創(chuàng)面的修復(fù)，較少瘢痕的形成。
[0038] (2)用堿液浸泡脫細胞處理后的膠原膜，不僅方法簡單，而且使得到的細胞外基質(zhì) 膠原纖維結(jié)構(gòu)更加疏松。這種疏松的膠原纖維結(jié)構(gòu)不僅為細胞的生長增殖提供了更加適宜 的三維空間結(jié)構(gòu)，而且保證了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分能夠快速的交換滲透，極大的促進了細 胞的增殖。之后用PBS溶液進行清洗浸泡，不僅去除了殘留的試劑，而且改善了細胞生長增 殖的微環(huán)境。使形成復(fù)層化細胞膜更加緊密的粘附在細胞外基質(zhì)上，甚至能夠使細胞部分 長入基質(zhì)中，也延長了細胞因子發(fā)揮作用的時間。
[0039] (3)采用凍干的方式進行處理，不僅保證了產(chǎn)品具有預(yù)期的使用效果，并且能夠延 長保質(zhì)期，大大降低了運輸和儲存的要求。
[0040] (4)制備周期短，工藝簡單，適合產(chǎn)業(yè)化，適用范圍寬，創(chuàng)面修復(fù)效果好，減少瘢痕 形成，愈合的創(chuàng)面與正常皮膚的彈性和韌性相近。
【附圖說明】
[0041] 圖1A是經(jīng)堿液浸泡處理后的牛心包膜的HE圖片。
[0042] 圖1B是經(jīng)堿液浸泡處理后的牛心包膜的HE圖片。
[0043] 圖2A為培養(yǎng)2天后細胞外基質(zhì)表面細胞膜的掃描電鏡圖。
[0044] 圖2B為培養(yǎng)3天后細胞外基質(zhì)表面細胞膜的掃描電鏡圖。
[0045] 圖2C為培養(yǎng)5天后細胞外基質(zhì)表面細胞膜的掃描電鏡圖。
[0046] 圖3為細胞外基質(zhì)上單次接種細胞培養(yǎng)5天后的HE染色結(jié)果。
[0047] 圖4A為大鼠燒燙傷創(chuàng)面使用皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)治療后lw(l周）的實物圖。
[0048] 圖4B為對照組治療大鼠燒燙傷創(chuàng)面lw(l周）后的實物圖。
[0049]圖4C為大鼠燒燙傷創(chuàng)面使用皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)治療后3w(3周）的實物圖。
[0050] 圖4D為對照組治療大鼠燒燙傷創(chuàng)面3w(3周）后的實物圖。
【具體實施方式】
[0051] 為了解決現(xiàn)有的組織工程皮膚構(gòu)建方法存在的培養(yǎng)周期長、成本高、工藝復(fù)雜、不 適合產(chǎn)業(yè)化、不能滿足調(diào)節(jié)創(chuàng)面微環(huán)境的作用，從而使其對創(chuàng)面的修復(fù)效果有限、保質(zhì)期 短，對存儲條件和運輸要求高的缺點，本實施例提供了一種皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法： 將種子細胞直接接種在經(jīng)特殊處理的細胞外基質(zhì)上，實現(xiàn)了細胞外基質(zhì)表面細胞復(fù)層化和 細胞外基質(zhì)內(nèi)部部分細胞長入的效果，并將其進行凍干滅菌處理，所制備的皮膚潰瘍修復(fù) 基質(zhì)能夠有效的促進糖尿病足部潰瘍、靜脈潰瘍、深度燒燙傷等慢性傷口的愈合，并能減少 瘢痕的形成，愈合的創(chuàng)面與正常皮膚的彈性和韌性相近。
[0052] 該皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法具體是采用脫細胞、去抗原和增厚處理后的天然 細胞外基質(zhì)作為生物支架，復(fù)合種子細胞在天然細胞外基質(zhì)表面形成多層細胞的細胞膜 (具有2~10層細胞膜的細胞），經(jīng)冷凍干燥處理后即得皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)；其中涉及的種 子細胞是自體或同種異體來源的成纖維細胞或胚胎或干細胞。
[0053] 按照制備過程，該皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法，主要包括細胞外基質(zhì)的制備、培 養(yǎng)基的配制、種子細胞的分尚和體外培養(yǎng)、接種細胞和三維培養(yǎng)、凍干等步驟；具體制備過 程如下：
[0054] 步驟一、細胞外基質(zhì)的制備：
[0055] 脫細胞：用于制備細胞外基質(zhì)的膠原膜組織在除去脂肪和其他雜物后，進行 脫細胞去抗原和滅活處理，具體的處理方法可參照專利申請?zhí)枮镃N201110145229. 0、 CN201210251134. 1、CN201310358048. 5、CN201310117569. 1 和 CN201310109216. 7 中記載 的任一種脫細胞去抗原和滅活處理方式均可。如專利申請?zhí)枮镃N201310109216. 7中提及 的方法：將前處理完成的膠原膜置于2. 0M氯化鉀和0. 1M的氨水混合溶液中浸泡60分鐘， 之后更換用等量的純化水震搖1小時，如此交替循環(huán)處理3次，最后用純化水清洗至pH值 6. 0 ~8. 0〇
[0056] 細胞外基質(zhì)的獲?。簩⑸鲜鎏幚硗瓿傻哪z原膜組織（簡稱膠原膜）用1M堿溶液 浸泡5~30min，如氫氧化鈉溶液、碳酸氫鈉溶液，碳酸鈉溶液、氫氧化鉀溶液等，或用1%。~ 1 %的次氯酸鈉浸泡1~2小時，使膠原膜的厚度增加2~7倍，較優(yōu)的是增厚3~5倍。然 后用大量的0. 01~0. 05M PBS溶液進行清洗至pH為6~7為止，并用PBS溶液浸泡1~ 6小時得到細胞外基質(zhì)。該步驟是通過堿液的作用使膠原膜的膠原纖維結(jié)構(gòu)更加疏松，圖 1B所示（與圖1A相比，說明堿液處理可有效的疏松膠原纖維結(jié)構(gòu)），便于細胞更好的粘附 甚至長入，使產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)和性能更加穩(wěn)定。
[0057] 另外用PBS溶液清洗浸泡不僅可使膠原膜內(nèi)部微環(huán)境更加適合細胞生長增殖，而 且能夠去除其他殘留試劑，保證細胞外基質(zhì)不會對細胞的增殖產(chǎn)生任何負面影響。然后將 細胞外基質(zhì)裁切成一定的規(guī)格，如圓形、矩形等，也可在細胞外基質(zhì)上進行打孔（分為打通 和不打通，孔徑0. 5~2mm)處理，使孔均勻分布在細胞外基質(zhì)上，孔密度為0. 2~1個/cm2， 10~25kGy鈷60福照滅菌后備用。
[0058] 不難看出，此時這里的細胞外基質(zhì)為經(jīng)過堿液增厚處理的脫細胞膠原膜，主要成 分為I、111型膠原，包括同種異體皮膚、羊膜等，也包括如牛、豬等異種來源的皮膚、心包膜、 腹膜等組織膜類。不僅與人體皮膚的成分相近，而且具有一定的彈性與韌性，幾乎無免疫原 性。同時處理后的膠原膜具有更加疏松的三維立體空間結(jié)構(gòu)，能夠引導(dǎo)細胞和長入和組織 再生，使愈合的創(chuàng)面具有接近正常皮膚的特性，還能抑制瘢痕形成。
[0059] 步驟二：培養(yǎng)基的配制：
[0060] 按9:1的體積比將DMEM/F12商用培養(yǎng)液與胎牛血清或新生牛血清混合為基礎(chǔ)液； 再按500ml基礎(chǔ)液標準加入胰島素1~100ng，轉(zhuǎn)鐵蛋白1~50mg，亞硒酸鈉1~30 y g，氫 化可松10~600 y g，表皮細胞生長因子1~20 y g，堿性成纖維細胞生長因子1~100ng， 轉(zhuǎn)化生長因子0 1~lOOng，維生素C 1~100mg，配制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配制 成以下培養(yǎng)基，其中添加物的濃度為終濃度：
[0061] 培養(yǎng)基a :基礎(chǔ)培養(yǎng)基+牛垂體提取液10~30 y g/ml ;
[0062] 培養(yǎng)基b:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+腺嘌呤1~100yg/ml;
[0063] 培養(yǎng)基c:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HRG50~300ng/ml;
[0064] 培養(yǎng)基d:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血小板衍生因子1~20ng/ml;
[0065] 添加的牛垂體提取液、腺嘌呤、HRG、血小板衍生因子都具有促進細胞生長增殖的 效果，有助于實現(xiàn)細胞膜復(fù)層化。
[0066] 步驟三、種子細胞的分離和體外培養(yǎng)：可參考現(xiàn)有技術(shù)進行相關(guān)種子細胞的分離 和體外培養(yǎng)，如采用組織貼壁法從所需的膠原膜組織中進行種子細胞的分離，或采用酶消 化法從所需的膠原膜組織中進行種子細胞的分離，或差速貼壁法從所需的膠原膜組織中進 行種子細胞的分離；并用F12或MEM或DMEM或RPMI-1640培養(yǎng)基混合5 %~20 %的胎牛血 清進行體外傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25~38°C，3%~7%的C02濃度。
[0067] 步驟四、接種細胞和三維培養(yǎng)：在無菌環(huán)境下，按1 X 104~10 X 10 6個/cm2的接種 密度在細胞外基質(zhì)上進行細胞接種。接種時用頂端尖銳的器具刺入細胞外基質(zhì)〇. 2~1_ 進行"打針式"接種即注射其中，每次注入0.5~1.0ml，針孔密度為0. 1~0.5個/cm2,并 在細胞外基質(zhì)表面進行點狀接種即逐滴滴在細胞外基質(zhì)表面上，然后通過輕微振蕩使細胞 均勻分布在細胞外基質(zhì)表面。培養(yǎng)條件：37°C，5% C02，在37°C、5%的0)2培養(yǎng)箱中，使接種 后的細胞外基質(zhì)完全浸沒于培養(yǎng)基a中，培養(yǎng)1~2天，之后更換培養(yǎng)基b，浸沒所述接種后 的細胞外基質(zhì)，培養(yǎng)1~2天后更換為培養(yǎng)基c，培養(yǎng)基c液面與所述接種后的細胞外基質(zhì) 平齊，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天后更換為培養(yǎng)基d，同樣浸沒所述接種后的細胞外基質(zhì)，培養(yǎng)1~2 天；培養(yǎng)期間每天換液。