一種皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于組織工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚是人體的第一道防御屏障，具有維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)的重要功能，因此，無(wú)論何種原 因引起的皮膚缺失性損傷，都需要及時(shí)給予治療。小面積淺層皮膚損傷是可以通過(guò)人體自 身調(diào)節(jié)自行修復(fù)的，但傷口直徑大于20cm或深至真皮層以及慢性皮膚潰瘍患者，需要通過(guò) 其他手段加以治療。
[0003] 慢性皮膚潰瘍（chronicskinulcer，CSU)又叫難治性潰瘍，是一種臨床常見(jiàn)疾病。 糖尿病足和靜脈潰瘍等都屬于難治性潰瘍。近年來(lái)隨著人們生活水平提高以及社會(huì)老齡 化，糖尿?。╠iabctesmellitus，DM)發(fā)病率逐年攀升。目前我國(guó)糖尿病患者約9200萬(wàn)，其 中15%~25%的患者會(huì)患有足部潰瘍。若不加以治療，可能會(huì)導(dǎo)致截肢。
[0004] 對(duì)于治療各種皮膚缺損，傳統(tǒng)的植皮方法存在諸多不能克服的缺點(diǎn)，如會(huì)造成多 處創(chuàng)面，增加患者的痛苦；不能滿(mǎn)足大面積植入的需求等。另外，如糖尿病足和靜脈潰瘍等 一些難治性潰瘍創(chuàng)面也無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單植皮實(shí)現(xiàn)創(chuàng)面愈合。皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)則為這些難題 提供了解決的途徑。
[0005] 組織工程皮膚一般通過(guò)種子細(xì)胞和支架材料制備而成。支架材料的種類(lèi)較多，但 由于材料本身性質(zhì)和處理方法等所限，目前報(bào)道的支架不能很好的滿(mǎn)足細(xì)胞增殖要求或制 備工藝繁瑣。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM)是結(jié)締組織中細(xì)胞外物質(zhì)的總稱(chēng)， 是一種很好的支架材料。它能夠?qū)ιL(zhǎng)因子起到存儲(chǔ)、顯示及釋放的作用。已有很多報(bào)道 證明細(xì)胞外基質(zhì)能夠有效的引導(dǎo)纖維細(xì)胞長(zhǎng)入并促進(jìn)新生血管形成。接種的細(xì)胞分泌的生 長(zhǎng)因子對(duì)潰瘍、燒燙傷等創(chuàng)面愈合過(guò)程有重要影響。生長(zhǎng)因子可以直接促進(jìn)移植細(xì)胞的增 殖與分化，還可維持其生物功能；潰瘍、深度燒燙傷等創(chuàng)面局部生長(zhǎng)因子及其受體的活性下 降和數(shù)量的相對(duì)或絕對(duì)的缺乏是創(chuàng)面難以愈合的病理生理基礎(chǔ)。
[0006] 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00910078357. 0的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利權(quán)已失效）公開(kāi)了一種以 人源表皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，人源成纖維細(xì)胞分泌形成的細(xì)胞外基質(zhì)為生物支架構(gòu)建組織工 程皮膚的方法。該方法存在培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)（一般為20~50天）、成本高和工藝復(fù)雜的缺陷。
[0007] 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00810116108. 1的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利（專(zhuān)利權(quán)已失效）提及了一種以 人源成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，接種于凝膠生物材料中構(gòu)建組織工程皮膚的方法。該方法同 樣存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)（一般為15~20天）、成本高、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。
[0008] 專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?01510100264. 9的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)，公開(kāi)了一種組織工程皮膚 及其應(yīng)用，其是以脫細(xì)胞真皮基質(zhì)（Acellular dermal matrix，ADM)作為支架材料，臍帶間 充質(zhì)干細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程皮膚。該技術(shù)雖然縮短了培養(yǎng)時(shí)間，但在制備過(guò)程 中需要在脫細(xì)胞真皮基質(zhì)表面包被一層明膠，然后進(jìn)行多次接種，并在ADM表面進(jìn)行扎孔 后培養(yǎng)一段時(shí)間，才可以達(dá)到細(xì)胞膜覆蓋ADM表面的效果。若不包被明膠則無(wú)法得到表面 具有完整細(xì)胞膜的產(chǎn)品。該種制備方法不僅沒(méi)有使脫細(xì)胞基質(zhì)在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)充分發(fā)揮自身 作用，而且工藝較為繁瑣，成本高，不適合產(chǎn)業(yè)化。而且，這種制備方法也只能在ADM表面形 成單層細(xì)胞膜，而細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子作為一種蛋白質(zhì)會(huì)在體內(nèi)快速降解，因而單層的細(xì) 胞膜分泌生長(zhǎng)因子的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足調(diào)節(jié)創(chuàng)面微環(huán)境的作用，從而使其對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)效果 有限。另外，目前已報(bào)道的組織工程皮膚類(lèi)產(chǎn)品幾乎都存在同樣的問(wèn)題，即由于產(chǎn)品形態(tài)而 導(dǎo)致保質(zhì)期短，對(duì)存儲(chǔ)條件和運(yùn)輸要求高的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的組織工程皮膚構(gòu)建方法存在的培養(yǎng)周期長(zhǎng)、成本高、 工藝復(fù)雜、不適合產(chǎn)業(yè)化、不能滿(mǎn)足調(diào)節(jié)創(chuàng)面微環(huán)境的作用，從而使其對(duì)創(chuàng)面的修復(fù)效果有 限、保質(zhì)期短，對(duì)存儲(chǔ)條件和運(yùn)輸要求高的缺點(diǎn)。
[0010] 為此，本發(fā)明提供了一種皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法，主要是采用脫細(xì)胞、去抗 原和增厚處理后的天然細(xì)胞外基質(zhì)作為生物支架，復(fù)合種子細(xì)胞在天然細(xì)胞外基質(zhì)表面形 成具有多層細(xì)胞的細(xì)胞膜，經(jīng)冷凍干燥處理后即得皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)；
[0011] 所述種子細(xì)胞是自體或同種異體來(lái)源的成纖維細(xì)胞或干細(xì)胞。
[0012] 上述皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)的制備方法，具體包括以下步驟：
[0013] 1)步驟一、細(xì)胞外基質(zhì)的制備：將完成脫細(xì)胞去抗原和滅活處理的膠原膜組織用 堿液浸泡進(jìn)行增厚處理，然后用0. 01~0. 05M PBS溶液進(jìn)行清洗至pH為6~7為止，并用 所述PBS溶液浸泡1~6小時(shí)得到細(xì)胞外基質(zhì)，然后用10~25kGy鈷60輻照滅菌后備用；
[0014] 2)步驟二、培養(yǎng)基的配制：
[0015]2. 1)、配制基礎(chǔ)液：按9:1的體積比將DMEM/F12商用培養(yǎng)液與胎牛血清或新生牛 血清混合為基礎(chǔ)液；
[0016]2. 2)、配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基：按500ml所述基礎(chǔ)液標(biāo)準(zhǔn)加入胰島素1~100ng，轉(zhuǎn)鐵蛋 白1~50mg，亞硒酸鈉1~30 y g，氫化可松10~600 y g，表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子1~20 y g， 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1~l〇〇ng，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子0 1~100ng，維生素C 1~100mg，配 制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基；
[0017] 2. 3)、配制培養(yǎng)基：向所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加牛垂體提取液10~30 y g/ml、 腺噪呤1~50mg、HRG 50~300ng/ml和血小板衍生因子1~20ng/ml，分別配制成以下四 種不同的培養(yǎng)基：
[0018] 培養(yǎng)基a :基礎(chǔ)培養(yǎng)基+牛垂體提取液10~30 y g/ml ;
[0019] 培養(yǎng)基b:基礎(chǔ)培養(yǎng)基+腺嘌呤1~100 y g/ml;
[0020] 培養(yǎng)基c :基礎(chǔ)培養(yǎng)基+HRG 50~300ng/ml ;
[0021] 培養(yǎng)基d :基礎(chǔ)培養(yǎng)基+血小板衍生因子1~20ng/ml ;
[0022] 其中，所述牛垂體提取液、腺嘌呤、HRG和血小板衍生因子的濃度為終濃度；
[0023] 3)步驟三、種子細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)：采用組織貼壁法從所需的組織中進(jìn)行種 子細(xì)胞的分離，或采用酶消化法從所需的組織中進(jìn)行種子細(xì)胞的分離，或差速貼壁法從所 需的組織中進(jìn)行種子細(xì)胞的分離；
[0024] 并用？12或1^]?或01^]\1或1^]\〇-1640培養(yǎng)基混合5%~20%的胎牛血清進(jìn)行體 外傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25~38 °C，3 %~7 %的C02濃度；
[0025] 4)步驟四、接種細(xì)胞和三維培養(yǎng)：在無(wú)菌環(huán)境下，按IX 104~10X10 6個(gè)/cm2的 接種密度在所述步驟一制備的細(xì)胞外基質(zhì)上進(jìn)行細(xì)胞接種，接種時(shí)刺入所述細(xì)胞外基質(zhì) 0. 2~1mm進(jìn)行接種，每次注入0. 5~1.0ml，針孔密度為0. 1~0. 5個(gè)/cm2,并在所述細(xì)胞 外基質(zhì)表面進(jìn)行點(diǎn)狀接種，然后通過(guò)輕微振蕩使所述種子細(xì)胞均勻分布在所述細(xì)胞外基質(zhì) 表面；
[0026] 在37 °C、5 %的0)2培養(yǎng)箱中，使接種后的細(xì)胞外基質(zhì)完全浸沒(méi)于培養(yǎng)基a中，培養(yǎng) 1~2天，之后更換培養(yǎng)基b，浸沒(méi)所述接種后的細(xì)胞外基質(zhì)，培養(yǎng)1~2天后更換為培養(yǎng)基 c，培養(yǎng)基c液面與所述接種后的細(xì)胞外基質(zhì)平齊，繼續(xù)培養(yǎng)1~2天后更換為培養(yǎng)基d，同 樣浸沒(méi)所述接種后的細(xì)胞外基質(zhì)，培養(yǎng)1~2天；培養(yǎng)期間每天換液；
[0027] 5)步驟五、凍干包裝和滅菌：將所述步驟三培養(yǎng)完成的樣品進(jìn)行凍干，控制凍干 程序以5~12°C /min的速率降至-80~-20°C，保持1~4小時(shí)后，冷凍干燥10~24小 時(shí)，之后進(jìn)行包裝，再以10~25kGy鈷60輻照滅菌后即得皮膚潰瘍修復(fù)基質(zhì)。
[0028] 上述堿液浸泡處理系指在室溫條件下，用1M堿溶液浸泡5~30min，或用1%〇~ 1 %的次氯酸鈉浸泡1~2小時(shí)，進(jìn)行浸泡處理，使所述膠原膜組織的厚度增加2~7倍。
[0029] 上述堿溶液是氫氧化鈉堿溶液、碳酸氫鈉堿溶液，碳酸鈉堿溶液和氫氧化鉀堿溶 液中的任一種。
[0030] 上述膠原膜組織的厚度增加3~5倍。
[0031] 上述步驟一中在制備的所述細(xì)胞外基質(zhì)上均勻打孔處理后，然后用10~25kGy鈷 60輻照滅菌后備用；
[0032] 所述孔的孔徑為0.5~2mm，所述孔的孔密度為0.2~1個(gè)/cm2,滅菌后備用。
[0033] 上述膠原膜組織是同種異體皮膚和羊膜中的任一種；
[0034] 或牛、豬來(lái)源的皮膚、心包膜和腹膜中的任一種。
[00