O稀釋至25nM)混勻得到 的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中的終濃度為 25nM、DBeQ在體系中的終濃度為5nM);
[0080] 對照組 I (5nM 對照）：將 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (儲存母液為 100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至25nM)混勻得到的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故DBeQ在體系中的終濃度為5nM，體系內不含蛋白）；
[0081] 實驗組 2 (IOnM):將 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶劑為 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (儲存母液為100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至50nM)混勻得到 的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中的終濃度為 25nM、DBeQ在體系中的終濃度為IOnM);
[0082] 對照組 2 (IOnM 對照）：將 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (儲存母液為 100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至50nM)混勻得到的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故DBeQ在體系中的終濃度為10nM，體系內不含蛋白）；
[0083] 實驗組 3 (15nM):將 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶劑為 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (儲存母液為100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至75nM)混勻得到 的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中的終濃度為 25nM、DBeQ在體系中的終濃度為15nM);
[0084] 對照組 3 (15nM 對照）：將 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (儲存母液為 100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至75nM)混勻得到的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故DBeQ在體系中的終濃度為15nM，體系內不含蛋白）；
[0085] 實驗組 4 (20nM):將 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶劑為 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (儲存母液為100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至IOOnM)混勻得到 的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中的終濃度為 25nM、DBeQ在體系中的終濃度為20nM);
[0086] 對照組 4 (20nM 對照）：將 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (儲存母液為 100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至IOOnM)混勻得到的測活體系（后續(xù)加入 IOul ATP，體系終體積為50ul，故DBeQ在體系中的終濃度為20nM，體系內不含蛋白）；
[0087] 實驗組 5 (30nM):將 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶劑為 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (儲存母液為100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至150nM)混勻得到 的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中的終濃度為 25nM、DBeQ在體系中的終濃度為30nM);
[0088] 對照組 5 (30nM 對照）：將 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (儲存母液為 100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至150nM)混勻得到的測活體系（后續(xù)加入 IOul ATP，體系終體積為50ul，故DBeQ在體系中的終濃度為30nM，體系內不含蛋白）；
[0089] 實驗組 6 (40nM):將 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶劑為 5*assay buffer)和 IOul DBeQ (儲存母液為100 % DMSO溶解濃度為5mM，使用前12 % DMSO稀釋至200nM)混勻得到 的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中的終濃度為 25nM、DBeQ在體系中的終濃度為40nM);
[0090] 對照組 6 (40nM 對照）：將 30ul 5*assay buffer 和 IOul DBeQ (儲存母液為 100% DMSO溶解濃度為5mM，使用前12% DMSO稀釋至200nM)混勻得到的測活體系（后續(xù)加入 IOul ATP，體系終體積為50ul，故DBeQ在體系中的終濃度為40nM，體系內不含蛋白）；
[0091] 對照組 0 :將 30ul Vps4 蛋白（41. 67nM，溶劑為 5*assay buffer)和 IOul 12 % DMSO混勻得到的測活體系（后續(xù)加入IOul ATP，體系終體積為50ul，故Vps4蛋白在體系中 的終濃度為25nM，體系內不含DBeQ);
[0092] 將上述各組測活體系，每個體系做4個平行?；靹蚝笫覝胤跤齦Omin。
[0093] 2、測活反應
[0094] 向上述各組測活體系中加入IOul ImM的ATP (ATP終濃度為200mM)，混勻，室溫反 應30min ;避光加入50ul孔雀綠試劑，混勾，室溫反應10min ;加入IOul 0. 2M檸檬酸鈉，混 勻，室溫反應5min ;測定0D630。
[0095] 3、數據處理
[0096] 計算相對活性（RA，relative activity)。相對活性=(實驗組η-對照組η)/(對 照組O-對照組η)，最后用SPSS19. O分析IC50。
[0097] 使用孔雀綠法可以通過測定磷酸根的濃度，來測定Vps4蛋白的ATPase的活性。結 果如圖3所示：隨著DBeQ濃度的增加，RA的值越來越低，進而說明DBeQ可以抑制白色念珠 菌Vps4蛋白的ATPase活性，其IC 5。為13. 325 μ M。
[0098] 實施例2、DBeQ對白色念珠菌Cps (羧肽酶）分布的影響
[0099] 白色念珠菌中含有液泡這一結構（圖8a)，如果野生型的ESCRT系統(tǒng)完好時，細胞 表達連有綠色熒光蛋白的cps (GFP-CPS)，其液泡內會充滿綠色（圖8b);如果突變型（比如 敲除Vps4)的ESCRT系統(tǒng)缺陷時，細胞表達連有綠色熒光蛋白的cps (GFP-CPS)不能有效的 被轉運進入液泡，所以只有液泡膜是綠色，而且由于細胞的膜轉運體系缺陷，在液泡膜的某 處還會有積聚，顯示為綠色的亮點，此結構成為E型區(qū)域（class E compartment)(圖8c)， 本實施例通過研究DBeQ對白色念珠菌Cps分布的影響，進而研究DBeQ對ESCRT系統(tǒng)的影 響。具體步驟如下：
[0100] 1、重組載體 Pmet-GFP-Cps CIplO 的構建
[0101] (1)以白色念珠菌BWP17gDNA為模板，采用Cps-ClaI F和Cps-PstI R引物進行 PCR擴增，得到PCR擴增產物，即Cps基因，引物序列如下：
[0102] Cps-ClaI F:5'GCCGATCGATATGATTGGACTTCCATTG3' ；
[0103] Cps-PstI R :5'CGAACTGCAGTTATTTATTGTTTGCCTTG3'。
[0104] 將PCR擴增產物1 %瓊脂糖凝膠電泳，100V，30min，切膠回收。
[0105] (2)用ClaI和PstI將步驟⑴得到的PCR產物雙酶切，得到大小為1743bp的 PCR產物；用ClaI和PstI酶將Pmet-GFP CIplO載體雙酶切，得到大小為約5500bp的骨 架載體，過夜將1743bp的PCR產物和大小為約5500bp的骨架載體連接，得到重組載體 Pmet-GFP-Cps CIp 10。并對其進行測序驗證。
[0106] 結果表明：重組載體Pmet-GFP-Cps CIplO為將Pmet-GFP CIplO載體的ClaI和 PstI酶切位點間的DNA片段替換為序列表中序列3所示的Cps基因，保持Pmet-GFP CIplO 載體的其他序列不變得到的載體。
[0107] 2、重組載體的線性化
[0108] 用Sail內切酶將重組載體Pmet-GFP-Cps CIplO線性化，得到線性化的重組載體 Pmet-GFP-Cps CIp10。
[0109] 3、重組菌的獲得
[0110] 采用醋酸鋰法將線性化的重組載體Pmet-GFP-Cps CIplO分別轉化BWP17菌株 和 vps4-/_ 菌株，分別得到重組菌 Pmet-GFP-Cps CIplO/BWP17 和 Pmet-GFP-Cps CIplO/ vps4_/_〇
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