DBeQ在抑制白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及DBeQ在抑制白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 白色念珠菌（Candida albicans)是一種常見的條件致病真菌，通常在人體粘膜表 面造成局部感染，在免疫缺陷病人中白色念珠菌往往可造成系統(tǒng)性感染。由于HIV的感染 以及腫瘤病人和器官移植病人數(shù)量的增加，白色念珠菌的感染日益成為重要的臨床問題。 研究表明在癌癥病人中，白色念珠菌是最常見的造成感染的真菌（在癌癥病人體內(nèi)分離出 的真菌病原體中70%屬白色念珠菌），同時(shí)，具有抗藥性菌株的出現(xiàn)和傳播也進(jìn)一步增加 了治療的難度。例如，傳統(tǒng)上fluconazole是有效的治療藥物，然而目前已出現(xiàn)多個(gè)抗該藥 物的白色念珠菌菌株，因此，開發(fā)新型藥物成為了一個(gè)日漸迫切的課題。
[0003] 白色念珠菌的一個(gè)特點(diǎn)是其形態(tài)可以在單細(xì)胞的酵母態(tài)與纖維狀的菌絲態(tài)之間 變化。研究表明，只有菌絲態(tài)的白色念珠菌才能完成其對(duì)內(nèi)皮或粘膜的侵襲。感染的病人取 樣研究還發(fā)現(xiàn)，侵入上皮組織的白色念珠菌都以菌絲態(tài)存在。因此，目前證據(jù)表明菌絲態(tài)的 形成是白色念珠菌得以侵襲人體組織的一個(gè)決定因子。由于局部感染的建立是導(dǎo)致白色念 珠菌進(jìn)入血液導(dǎo)致系統(tǒng)性病變的基礎(chǔ)，該菌的形態(tài)變化很可能是其致病性的關(guān)鍵因素。因 此，干預(yù)菌絲形成有可能成為開發(fā)新型藥物的基礎(chǔ)。
[0004] 轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)體分選復(fù)合物（endosomalsortingcomplexrequiredfortransport， ESCRT)最初是在內(nèi)體（endosome)內(nèi)陷形成多囊泡體（multivecicular body，MVB)的過程 中發(fā)現(xiàn)的，其作用是完成膜蛋白的降解，其包括5種蛋白復(fù)合物，分別命名為ESCRT 0、I、 II、III和Vps4/Vtal。其中，Vps4屬于AAA ATPase。研究表明，ESCRT系統(tǒng)的缺失會(huì)導(dǎo)致MVB 形成的障礙，并且在內(nèi)體上出現(xiàn)一個(gè)特殊的結(jié)構(gòu)，稱為E型區(qū)域（class E compartment)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供式I所示的DBeQ的新用途。
[0006] 本發(fā)明提供了式I所示的DBeQ在制備抗白色念珠菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用：
[0007]
[0008] 上述應(yīng)用中，所述抗白色念珠菌是通過抑制白色念珠菌的菌絲生長(zhǎng)體現(xiàn)的。
[0009] 上述應(yīng)用中，所述抑制白色念珠菌的菌絲生長(zhǎng)是通過抑制Vps4蛋白活性體現(xiàn)的。
[0010] 上述應(yīng)用中，所述抑制白色念珠菌Vps4蛋白活性是通過1)抑制Vps4蛋白的 ATPase活性和/或2)抑制ESCRT系統(tǒng)功能體現(xiàn)的。
[0011] 本發(fā)明還提供了式I所示的DBeQ在抑制白色念珠菌的菌絲生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明還提供了式I所示的DBeQ在制備抑制白色念珠菌的菌絲生長(zhǎng)的產(chǎn)品中的 應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了式I所示的DBeQ在抑制Vps4蛋白的ATPase活性中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明還提供了式I所不的DBeQ在制備抑制Vps4蛋白的ATPase活性的廣品中 的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明還提供了式I所示的DBeQ在抑制ESCRT系統(tǒng)功能中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明還提供了式I所示的DBeQ在制備抑制ESCRT系統(tǒng)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
[0017] 上述應(yīng)用中，所述Vps4蛋白來源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具體為白色念珠 菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3 ;所述Vps4蛋白的氨基酸序列具體如序列表中序列2所 不。
[0018] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種抗白色念珠菌的產(chǎn)品。
[0019] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品的活性成分為式I所示的DBeQ，所述產(chǎn)品的用途為如下 (1)-(4)中的至少一種：
[0020] 1)抗白色念珠菌；
[0021] 2)抑制白色念珠菌的菌絲生長(zhǎng)；
[0022] 3)抑制Vps4蛋白的ATPase活性；
[0023] 4)抑制ESCRT系統(tǒng)功能。
[0024] 上述產(chǎn)品在抑制白色念珠菌的菌絲生長(zhǎng)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0025] 上述產(chǎn)品在抑制Vps4蛋白的ATPase活性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 上述產(chǎn)品在抑制ESCRT系統(tǒng)功能中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0027] 上述應(yīng)用中，所述抑制ESCRT系統(tǒng)功能是通過抑制Cps轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入液泡中體現(xiàn)的。
[0028] 上述產(chǎn)品或上述應(yīng)用中，所述Vps4蛋白來源于白色念珠菌；所述白色念珠菌具體 為白色念珠菌BWP17或白色念珠菌BWP17URA3 ;所述Vps4蛋白的氨基酸序列具體如序列表 中序列2所示。
[0029] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 DBeQ可以抑制白色念珠菌菌絲的生長(zhǎng)，并通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明 DBeQ是一個(gè)白色念珠菌Vps4蛋白的有效抑制劑，DBeQ是通過對(duì)Vps4蛋白的抑制作用進(jìn)而 對(duì)ESCRT系統(tǒng)產(chǎn)生影響，表現(xiàn)為白色念珠菌菌絲的生長(zhǎng)受到了抑制。因此，DBeQ不僅可以 作為進(jìn)一步開發(fā)抗白色念珠菌感染的基礎(chǔ)，還可以被開發(fā)為一種研究細(xì)胞功能的研究工具 用于觀察細(xì)胞在ESCRT系統(tǒng)被抑制后的變化。
【附圖說明】
[0030] 圖1為白色念珠菌Vps4蛋白的純化。M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1為未誘導(dǎo)的E. coli全菌； 2為誘導(dǎo)后的E. coli全菌；3為細(xì)胞破碎液；4為親和層析柱的穿過峰；5為凝血酶酶切后 親和層析柱的洗脫峰。
[0031] 圖2為DBeQ的分子式。
[0032] 圖 3 為 DBeQ 抑制 Vps4 的 ATPase 活性。
[0033] 圖4為DBeQ影響Cps的分布。圖4a為GFP-Cps在BWP17中充滿整個(gè)液泡；圖4b 為GFP-Cps在vps4-/-中只是集中在液泡表面，呈現(xiàn)戒指狀；圖4c為GFP-Cps BWP17在30uM DMSO處理4h后，GFP-Cps的分布和a基本相同；圖4d為GFP-Cps BWP17在30uM DBeQ處理 4h后，GFP-Cps的分布與a相比發(fā)生改變，但不如Vps4敲除作用明顯。
[0034] 圖5為白色念珠菌的不同菌絲生長(zhǎng)狀態(tài)。圖5a為白色念珠菌的酵母態(tài)；圖5b為 單菌絲態(tài)，當(dāng)酵母態(tài)處于誘導(dǎo)條件（37°C，20% serum或Ph7)下會(huì)長(zhǎng)出菌絲；圖5c為多菌 絲態(tài)，當(dāng)菌絲不能正常維持極性時(shí)，會(huì)出現(xiàn)兩根或多根菌絲。
[0035] 圖6為Vps4的缺失抑制了白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)。圖6a為使用pH誘導(dǎo)；圖6b為 使用血清誘導(dǎo)。其中，T為總菌絲數(shù)；S為單菌絲數(shù)；M為多菌絲數(shù)；BWP17URA3為野生型； V4-/-URA3為Vps4敲除型；V4-/-EQV4URA3為Vps4敲除后補(bǔ)充入Vps4E235Q顯性負(fù)突變 體。
[0036] 圖7為DBeQ抑制白色念珠菌菌絲生長(zhǎng)。圖7a為使用Ph7誘導(dǎo)菌絲；圖7b為使用 血清誘導(dǎo)菌絲。
[0037] 圖8為GFP-Cps在BWP17和vps4-/_中分布模式圖。圖8a為酵母型白色念珠菌； 圖8b為GFP-Cps在BWP17中的分布；圖8c為GFP-Cps在vps4-/_中的分布。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞是北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。
[0041] 大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞是北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。
[0042] 白色念珠菌 BWP17 (營養(yǎng)型為 arg-/his-/ura_)在文獻(xiàn) "Wilson, R. B. , Davi s,D. , and Mitchell,A.P. 1999. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181(6) :1868 - 1874. PMID: 10074081"中公開過，公眾可從北京師范大學(xué)獲 得。
[0043] 白色念珠菌vps4-/_(簡(jiǎn)寫v4-/_，營養(yǎng)型為arg+/his+/ura_)是運(yùn)用基因敲除的 方法將白色念珠菌BWP17基因組中的兩個(gè)vps4拷貝敲掉，且其余基因與白色念珠菌BWP17 一致的菌株。基因敲除的方法在文獻(xiàn)"Fonzi W. A.，and Irwin Μ. Y. · Isogenic strain construction and gene mapping in Candida albicans. Genetics, 1993, 134:717-728.'， 中公開過，公眾可以從北京師范大學(xué)獲得。
[0044] 白色念珠菌BWP17URA