一種納米佐劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物制品免疫佐劑制備工藝技術領域，主要涉及一種納米佐劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]疫苗在預防和治療重大傳染病從而保護人類免受侵害的過程中發(fā)揮著極其重要的作用。目前，臨床上絕大多數(shù)疫苗以減毒或滅活的細菌或病毒為載體，具有良好的免疫原性，免疫一次或兩次即可有效引起機體的系統(tǒng)免疫反應，但其極有可能回復毒力且穩(wěn)定性較差，從而限制了其在臨床中的廣泛使用。同時，目前臨床上批準用于人體的佐劑主要為鋁佐劑和MF59兩種，然而這兩種佐劑主要刺激機體產(chǎn)生體液免疫反應，很難刺激細胞免疫反應的發(fā)生，這對于預防和治療病毒等胞內(nèi)病原體的感染顯然是不夠的。研宄開發(fā)出安全性好且能有效刺激機體細胞免疫和體液免疫的疫苗及其載體和佐劑成為絕大多數(shù)傳染病疫苗研發(fā)中的瓶頸問題。鑒于病毒載體疫苗潛在的安全性問題，近年來DNA疫苗和亞單位疫苗如蛋白質(zhì)疫苗等新型疫苗逐漸成為重大疾病防治研宄的熱點。然而DNA和蛋白質(zhì)較難進入機體且易被酶降解導致了疫苗較差的免疫原性。要解決這些問題需借助于合適的疫苗載體或佐劑?？捎糜谌梭w的兩種佐劑(鋁佐劑和MF59)主要激活機體的體液免疫，對細胞免疫的調(diào)節(jié)作用較弱，這對于預防和治療胞內(nèi)病原體如病毒等的感染顯然是不夠的。作為非病毒載體，納米材料具有較好的生物相容性和獨特的理化性質(zhì)，如易于加工修飾、促進功能分子入胞、保護DNA和蛋白質(zhì)等免受降解，在疫苗載體或佐劑的研宄與開發(fā)過程中逐漸成為關注的熱點。目前，已有一些納米材料在實驗動物水平顯示出較好的載體作用或佐劑活性。本文講述了一種新型的納米材料，通過與蛋白質(zhì)進行結合，可以獲得較好的免疫原性，展現(xiàn)了較好的應用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種納米佐劑及其制備方法，本發(fā)明制備佐劑通過與蛋白質(zhì)進行結合，可以獲得較好的免疫原性，展現(xiàn)了較好的應用前景。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
一種納米佐劑，所述佐劑成分質(zhì)量比為硼酸:尿素:葡萄糖=10:10:3。
[0005]所述的納米佐劑的制備方法，所述方法包括如下步驟:按比例稱取硼酸、尿素、葡萄糖，研磨均勻，放入坩禍中，在高溫電爐中進行加熱，升溫速率5度/min至1250度/min，保持5h，自然冷卻，獲得到粉末，并且再次均勻研磨，用去離子水進行溶解，6000rpm離心lOmin，重復一遍，獲得到的膠體即為納米氮化硼膠體(BN)，該氮化硼(BN)顆粒直徑在60-100nm;為了使得納米材料充分氨基化，將該膠體通入氨氣至飽和狀態(tài)，在磁力攪拌器上攪拌24h，獲得的溶液在去離子水中透析，至pH=6.9-8.0停止，整個實驗在室溫下進行。
[0006]所述的納米佐劑在制備疫苗上的應用。
[0007]所述疫苗的制備方法為將抗原與納米佐劑按一定比例進行混合，所述抗原與納米佐劑質(zhì)量比為50:1?100:1，加入交聯(lián)劑進行交聯(lián)4-8h，交聯(lián)劑的濃度為0.1-1%，并且進行透析去除交聯(lián)劑，獲得的即為制備好的疫苗。
[0008]本發(fā)明的優(yōu)點在于:通過一發(fā)明了一種比較簡單的方法合成納米材料氮化硼(BN),并且通過實驗驗證發(fā)現(xiàn)該納米材料有較好的佐劑活性，是一個獨創(chuàng)性的發(fā)現(xiàn)。BN是一種與碳納米管結構相似的納米材料，只是由氮元素和硼元素替代了碳元素結構了網(wǎng)狀結構，保持了非常好的生物相容性，并且具有很高的水溶性。我們合成的納米材料顆粒比較均勻，通過實驗我們發(fā)現(xiàn)，該納米材料具有較好的生物相容性和獨特的理化性質(zhì)，如易于加工修飾、促進功能分子進入細胞、保護外源DNA和蛋白質(zhì)等免受降解，在疫苗載體或佐劑的研宄與開發(fā)過程中有很好的應用價值。另外本發(fā)明通過對納米材料進行修飾，使得該納米材料帶上豐富的氨基，當然也可以給納米材料進行其他的修飾，使得納米材料可以帶上更多的大分子或者抗原，從而引發(fā)機體的更加強烈的免疫反應。
【附圖說明】
[0009]圖1納米佐劑(BN)電鏡圖。
[0010]圖2納米佐劑(BN)濃度的曲線圖。
[0011]圖3納米佐劑(BN)與蛋白質(zhì)交聯(lián)后吸光度的變化。
[0012]圖4納米佐劑(BN)與蛋白質(zhì)交聯(lián)后掃描電鏡元素分析圖。
[0013]圖5納米佐劑(BN)與蛋白質(zhì)交聯(lián)后動物免疫的抗體活性圖。
【具體實施方式】
[0014]實施例1
按比例稱取質(zhì)量比為硼酸:尿素:葡萄糖=10:10:3，研磨均勻，放入坩禍中，在高溫電爐中進行加熱，升溫速率5度/min至1250度/min，保持5h，自然冷卻，獲得到粉末，并且再次均勻研磨，用去離子水進行溶解，6000rpm離心lOmin，重復一遍，獲得到的膠體即為納米氮化硼膠體，該氮化硼顆粒直徑在80nm ;為了使得納米材料充分氨基化，將該膠體通入氨氣至飽和狀態(tài)，在磁力攪拌器上攪拌24h，獲得的溶液在去離子水中透析，至pH=7.0停止，整個實驗在室溫下進行。
[0015]實施例2 第一步:疫苗的制備
取納米佐劑5ml，濃度為0.04mg/ml，取5ml過濾除菌的牛血清白蛋白2mg/ml為抗原，進行混合，加入200ul的25%的戊二醛交聯(lián)8h，在去離子水中透析，透析至pH=7停止透析。所獲得的產(chǎn)物即為疫苗。并進行檢測。UV-vis檢測結果見(圖3)。為了進一步驗證抗原與佐劑的交聯(lián)結果，我們利用掃描電鏡元素分析(SEM — mapping)技術來驗證納米材料上是否含有抗原，由于佐劑上有硼元素和氮元素組成，而蛋白質(zhì)有碳元素，氮元素，氧元素，氫元素和硫元素組成，并且抗原和佐劑交聯(lián)后會形成共價鍵，經(jīng)過去離子水洗滌是無法洗滌下去的，因此可以利用SEM — mapping來檢測抗原是否和佐劑交聯(lián)。取上述交聯(lián)并透析后的疫苗，12000rpm離心lOmin，棄上清，加入去離子水超聲重懸，并再次12000rpm離心lOmin，反復5次，直至離子濃度低于lOppm，取最后一次離心的沉淀，干燥后進行掃描電鏡觀察，結果見(如圖4).從UV-vis結果可以看出，未交聯(lián)的抗原和交聯(lián)過后的抗原最大吸收峰有明顯的差別，這說明了抗原與佐劑交聯(lián)成功。從SEM — mapping結果來看，在抗原中存在的元素也顯示在了佐劑的表面上，這也說明了抗原與佐劑交聯(lián)成功。成功制備疫苗。
[0016]第二步:動物免疫
本實驗選取小鼠作為實驗對象，選取9只SPF級Km鼠，分成三組，每組3只。第一組作為空白對照，第二組直接注射10ug的抗原最為陰性對照，第三組注射含有10ug抗原的疫苗為陽性對照。免疫過程按一下進行，取20g的小鼠，在SPF級實驗室中飼養(yǎng)，溫度控制在24°C，濕度控制在50%，前三天觀察小鼠活動狀態(tài)，第四天進行第一次免疫，兩周之后進行第二次免疫，兩周之后取小鼠血清，檢測抗體活性。
[0017]檢測方法按常規(guī)ELISA進行，緩沖液配方及具體步驟如下:
ELISA緩沖液配方如下:
包被液:1.59gNaC03，2.93gNaHC03，加 ddH20 至 1000mL。
[0018]洗滌液:8.0gNaCl，0.2gKCl，2.9gNa2HP0412H20，0.2gKH2P04，0.5mL 吐溫一20 (Tween-20)，加 ddH20 至 1000mL。
[0019]封閉液:0.1g明膠，洗滌液100mL。
[0020]顯色液A::醋酸鈉13.6g，檸檬酸1.6g，30%雙氧水0.3ml，蒸餾水加至500ml.顯色液B:EDTA 0.2g，檸檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15g TMB溶于3mlDMS0中，蒸餾水加至500ml。
[0021]終止液:0.5M H2S04。
[0022]實驗步驟如下:
具體操作步驟如下:
(1)抗原用包被液稀釋至10ug/ml包被酶標反應板，10ul/孔，每個稀釋度設3個重復孔，放置于4°C過夜；
(2)取出酶標板，甩干，用洗漆液洗3次，最后一次甩干后，將酶標板孔朝下放放置濾紙上反復拍打干凈；
(3)每孔加入150ul，封閉液37°C封閉60min，重復步驟(2)；
(4)用封閉液將待檢血清在酶標板上迸行1:100倍稀釋，10ul/孔，并加入空白血清作為陰性對照，37 °C作用2h后，重復(2 );
(5)用封閉液將HRP標記的羊抗鼠IgG適當稀釋(1:2000)，100111/孔，37°〇作用601^11，重復(2)；
(6)加入TMB底物10uL/孔，室溫避光靜置10-15min；
(7)最后加入50ul終止液以終止反應，用酶標儀在450mn波長下測定OD值。實驗結果如(圖5)，從結果可以看出，直接將蛋白質(zhì)或者抗原免疫動物，其免疫反應比較弱，加入佐劑之后，免疫反應比直接注射蛋白或抗原要高出將近4倍。
[0023]從動物實驗可以看出，交聯(lián)納米佐劑的抗原可以產(chǎn)生很高的抗體活性，隨著科學技術的進一步發(fā)展和納米材料生產(chǎn)工藝研宄的不斷深入，相信將有更好的無免疫原性、可調(diào)控，能長期的生物耐受的納米佐劑被開發(fā)并應用于疫苗中，這將對提高疫苗免疫效果以及疫苗在疾病防制中的應用發(fā)揮重要作用。
[0024]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一種納米佐劑，其特征在于:所述佐劑成分質(zhì)量比為硼酸:尿素:葡萄糖=10:10:3。
2.—種如權利要求1所述的納米佐劑的制備方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟:按比例稱取硼酸、尿素、葡萄糖，研磨均勻，放入坩禍中，在高溫電爐中進行加熱，升溫速率5度/min至1250度/min，保持5h，自然冷卻，獲得到粉末，并且再次均勻研磨，用去離子水進行溶解，6000rpm離心lOmin，重復一遍，獲得到的膠體即為納米氮化硼膠體，該氮化硼顆粒直徑在60-100nm ;為了使得納米材料充分氨基化，將該膠體通入氨氣至飽和狀態(tài)，在磁力攪拌器上攪拌24h，獲得的溶液在去離子水中透析，至pH=6.9-8.0停止，整個實驗在室溫下進行。
3.一種如權利要求1所述的納米佐劑在制備疫苗上的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于:所述疫苗的制備方法為將抗原與納米佐劑按一定比例進行混合，所述抗原與納米佐劑質(zhì)量比為50:1?100:1，加入交聯(lián)劑進行交聯(lián)4-8h，交聯(lián)劑的濃度為0.1_1%，并且進行透析去除交聯(lián)劑，獲得的即為制備好的疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種納米佐劑及其制備方法，按比例稱取硼酸、尿素、葡萄糖=10:10:3，研磨均勻，放入坩堝中，在高溫電爐中進行加熱，升溫速率5度/min至1250度/min，保持5h，自然冷卻，獲得到粉末，并且再次均勻研磨，用去離子水進行溶解，6000rpm離心10min，重復一遍，獲得到的膠體即為納米氮化硼膠體（BN），該氮化硼顆粒直徑在60-100nm；為了使得納米材料充分氨基化，將該膠體通入氨氣至飽和狀態(tài)，在磁力攪拌器上攪拌24h，獲得的溶液在去離子水中透析，至pH=6.9-8.0停止，整個實驗在室溫下進行。
【IPC分類】A61K39-39, A61P37-04
【公開號】CN104740629
【申請?zhí)枴緾N201510150836
【發(fā)明人】呂暾, 黃彩進, 王立波, 劉秋文, 周敏
【申請人】福州大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月1日