一種有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]骨缺損已經(jīng)成為現(xiàn)在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域的研宄熱點，因意外、疾病、遺傳或其他原因造成的骨組織缺損是臨床上的常見病，也是骨科治療的難題之一。目前，治療骨缺損的方法有自體骨移植和異體骨移植、組織工程技術(shù)和基因治療法等。近年來，微球、微囊等在生物醫(yī)學領(lǐng)域的研宄已經(jīng)得到越來越多的重視。微球是一種以適宜高分子材料為載體制成的球形或類球形微粒，有關(guān)研宄表明，顆粒的形態(tài)和結(jié)構(gòu)能影響顆粒在人體內(nèi)的活性，形狀不規(guī)則的顆粒植材入人體會產(chǎn)生炎癥等不良反應，因此，形狀較規(guī)則的球狀載藥顆粒是作為植入藥物載體的優(yōu)先選擇。
[0003]隨著生物醫(yī)學工程的發(fā)展，電磁場的生物學效應越來越受到人們的重視。古代已有利用電磁場治療骨組織疾病的歷史，臨床上電磁場主要應用于治療骨折、神經(jīng)系統(tǒng)損傷以及軟組織損傷的修復，并已取得滿意的效果。首先，成骨細胞作為骨發(fā)生細胞，對于骨損傷的修復與重建至關(guān)重要。研宄發(fā)現(xiàn)，磁場可以通過直接作用于成骨細胞的DNA，影響基因的表達和促進蛋白質(zhì)的合成從而促進細胞的增殖。在實驗室骨折治療中證實，脈沖磁場能促進骨膠原的合成，增加骨組織的血液供應，從而加速骨折的愈合；低頻和靜磁場具有促進組織再生的生物學作用。利用電磁場的這種功能，利用雜化仿生法將鐵鹽和亞鐵鹽原位生成超順磁Fe3O4,作為復合微球的原料之一，這種雜化仿生的方法，反應條件溫和，沒有殘留毒副物質(zhì)產(chǎn)生，并且可降低有機與無機界面的界面能，引導納米四氧化三鐵在有機基質(zhì)上原位結(jié)晶形成均勻分散的納米顆粒，克服了水熱合成法導致的四氧化三鐵納米粒的聚集問題。
[0004]磁性載藥微球作為給藥載體，主要具有以下優(yōu)勢:(I)藥物隨著載體被吸附到靶區(qū)周圍，使靶區(qū)很快達到所需濃度，而在其他部位分布量相對減少，因此可降低給藥劑量；
(2)藥物絕大部分在局部作用，相對減少了藥物對人體正常組織的毒副作用，特別是降低對肝、脾、腎等造血和排泄系統(tǒng)的損害；(3)加速產(chǎn)生藥效，提高療效。
[0005]殼聚糖是一種帶正電荷的天然聚多糖，其結(jié)構(gòu)與細胞外基質(zhì)的主要成分一糖胺聚糖十分類似，能促進傷口愈合和骨組織的形成，降解產(chǎn)物對人體無毒副作用，并且具有良好的生物降解性和生物相容性。近年來，已有多位學者將殼聚糖與納米羥基磷灰石復合制成多孔支架材料，而采用雜化仿生法在殼聚糖上原位結(jié)晶形成納米羥基磷灰石，從而作為靶磁性載藥微球材料的方法鮮有報道。
[0006]中醫(yī)藥治療骨折和骨不連具有數(shù)千年的歷史，用藥獨到、簡便靈驗。研宄表明，中藥淫羊藿的有效成分-淫羊藿苷，是其黃酮類化合物的主體成分，可促進骨髓細胞DNA的合成以及成骨細胞BMP和基因的表達，誘導骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化，增強成骨細胞活性，抑制破骨細胞的吸收，從而對骨質(zhì)疏松起到良好的拮抗作用。此外，淫羊藿苷具有來源廣泛、提取工藝相對簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、易于儲存、可耐受消毒性等生物學優(yōu)點，因此，淫羊藿苷可作為一種新型成骨誘導活性因子用于骨再生研宄。這里，我們采用雜化仿生的方法，構(gòu)建靶磁性殼聚糖-羥基磷灰石控緩釋骨修復復合微球，在電磁場可以促進組織再生的生物學基礎(chǔ)上，利用超順磁四氧化三鐵對傳統(tǒng)中藥的靶向性，納米羥基磷灰石的大比表面積和高表面活性裝載傳統(tǒng)中藥，殼聚糖對藥物的包埋功能，以及有機基質(zhì)與無機基質(zhì)的相互靜電作用，增加載藥量，起到靶磁性和控緩釋雙重作用，作為骨填充材料進行局部定向釋藥，通過體外細胞復合培養(yǎng)評價體系初步探討其用于骨修復的可行性。
[0007]近年來“融合高技術(shù)磁性醫(yī)療”，靶向制劑又稱靶向給藥系統(tǒng)，為第四代藥物制劑，指載體通過局部給藥或全身血液循環(huán)而選擇性地濃集定位于靶組織、靶器官、靶細胞或者細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的給藥系統(tǒng)。應用后可以在病變部位高度集中，正常部位只有少量藥物，從而最大限度提高治療效果，減少全身性的毒副作用。在治療骨缺損等骨組織疾病中與中藥-淫羊藿苷起到相輔相成的目的。
[0008]基于目前的基礎(chǔ)研宄成果，本研宄以治療和修復骨折、骨缺損等骨組織疾病為目的，利用殼聚糖中的羥基和氨基基團對四氧化三鐵以及羥基磷灰石的原位誘導結(jié)晶作用，調(diào)控無機礦物在有機基質(zhì)上原位非均勻成核結(jié)晶，同時包載具有促進骨修復功能的中藥-淫羊藿干，有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球。該給藥系統(tǒng)，基于磁力的組織工程，直接作用于成骨細胞的DNA，影響基因的表達和促進蛋白質(zhì)的合成，具有促進組織再生的生物學作用；同時融合高技術(shù)磁性醫(yī)療，利用超順磁四氧化三鐵與中藥-淫羊藿干的靜電相互作用，增大載藥量，在體外磁場定向引導下，具有靶向磁性和控制緩釋雙重作用，可提高靶區(qū)藥物濃度，從而提高療效，降低毒副作用，有望能在治療骨缺損等骨組織疾病中與淫羊藿苷起到相輔相成的目的。并且在微球內(nèi)部形成無數(shù)微小磁場，對成骨細胞形成持續(xù)的微弱磁力刺激，從而有望更好地治療并修復骨質(zhì)疏松、骨折、骨缺損等骨組織疾病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于骨組織缺損的修復。利用電磁場促進組織再生的生物學機制以及磁性微球的靶磁性，利用雜化仿生法將性能完全不同的有機相與無機相結(jié)合起來，實現(xiàn)二者分子級復合，制備一種具有靶磁性和控緩釋雙重作用的有機/無機雙相雜化載中藥復合微球。該方法的制備工藝條件溫和，操作簡捷，無毒副作用，成本較低，制備所得的復合微球粒徑可控，成球性好，無機相分散均勻，性能優(yōu)越。
[0010]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球:利用電磁場促進組織再生的生物學機制以及雜化仿生技術(shù)，以殼聚糖為有機基質(zhì)，可溶性鐵鹽和可溶性亞鐵鹽無機相為納米四氧化三鐵先驅(qū)物，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為無機相納米羥基磷灰石的前驅(qū)體；利用有機相的模板作用與無機物離子在界面處的相互作用，從分子水平調(diào)控無機礦物相的析出，通過兩相之間的晶格匹配、靜電作用、立體化學互補以及空間定位作用，引導納米羥基磷灰石和納米四氧化三鐵在有機基質(zhì)上原位非均勻成核結(jié)晶形成均勻分散的納米顆粒，使無機相具有一定的形狀、尺寸、取向和結(jié)構(gòu)。同時復合了對成骨細胞具有促進增殖和分化作用的傳統(tǒng)中藥-淫羊藿苷，雜化仿生制備有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球。
[0011]制備方法包括以下步驟: (1)將殼聚糖溶解于體積分數(shù)為I?2%的乙酸溶液中，淫羊藿苷溶解于無水乙醇中；
(2)磁力攪拌下，往殼聚糖的乙酸溶液中加入淫羊藿苷的醇溶液；再按照HAP的化學計量比Ca/P = 1.67，緩慢加入濃度為1.5?3mol/L的可溶性鈣鹽和濃度為0.6?1.8mol/L的可溶性磷酸鹽溶液；
(3)按四氧化三鐵的化學計量比n(Fe3+):n( Fe2+)=2:1，向步驟(2)得到的混合液中依次加入濃度為0.1?0.3mol/L的可溶性鐵鹽溶液和濃度為0.05?0.15mol/L的可溶性亞鐵鹽溶液；
(4)以I?3mo I/L KOH或NaOH的乙醇/水溶液為凝膠浴，其中乙醇與水的體積比為I?2:1，將步驟(3)的混合液通過高壓靜電微囊成型裝置，滴入凝膠浴中成型。
[0012](5)將成型的微球連同凝膠浴一并置于37°C水浴鍋中水浴8?12h，然后用去離子水反復洗滌至中性，移至_4°C冰箱預冷凍，-10°C?-80°C冷藏后，再轉(zhuǎn)入冷凍干燥機中進行冷凍干燥至少24h，至完全脫水，即獲得一種有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球。
[0013]步驟(I)所述的淫羊藿苷醇溶液的體積為2ml，攪拌時間為lh。
[0014]步驟(2)所述的可溶性鈣鹽是硝酸鈣或氯化鈣，可溶性磷酸鹽是磷酸氫二鉀、磷酸二氫
鉀、磷酸氫二鈉或磷酸二氫的一種或幾種。
[0015]步驟(2)所述的可溶性鈣鹽溶液和可溶性磷酸鹽溶液，前者攪拌0.5~lh，后者攪拌2?4h0
[0016]步驟(3)所述的可溶性鐵鹽是氯化鐵、硝酸鐵或硫酸鐵，可溶性亞鐵鹽是氯化亞鐵或硫酸亞鐵中的一種。
[0017]步驟(4)的最終混合液中，殼聚糖的質(zhì)量百分比為2?4%;淫羊藿苷的質(zhì)量百分比為0.03?0.08%;加入的Ca/P前驅(qū)體溶液理論形成HAP量為3?5%;雜化形成的Fe3O4的理論百分比為2?4%。
[0018]一種有機/無機雙相雜化靶磁性載中藥復合微球的制備，可以簡單概括為以下幾個過程:
(1)有機基質(zhì)與無機離子的界面識別，形成有效的成核位點；
(2)藥物分子在有機基質(zhì)上的吸附；
(3)超順磁四氧化三鐵與中藥靜電相互作用，吸附藥物分子；
(4)復合微球的成型；
(5)有機基質(zhì)調(diào)控無機離子原位成核結(jié)晶自組裝成納米粒；
(6)復合微球的后處理。
[0019]本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于:殼聚糖是一種帶正電荷的天然多糖，不與體液發(fā)生反應并可被機體的溶菌酶生物降解，并能促進傷口愈合和骨的形成，具有無免疫原性、無毒性等特性。利用電磁場促進組織再生的生物學機制以及雜化仿生技術(shù)，以殼聚糖為有機基質(zhì)，可溶性鐵鹽和可溶性亞鐵鹽為納米四氧化三鐵的先驅(qū)物，可溶性鈣鹽和可溶性磷酸鹽為納米羥基磷灰石的前驅(qū)體；利用殼聚糖中的羥基和氨基基團